mCD20-腺病毒穿梭质粒pDC315的构建

目的：构建腺病毒穿梭质粒pDC315-mCD20重组质粒，为探讨编码mCD20基因的腺病毒载体做好准备，为CD20基因治疗淋巴瘤的研究奠定基础。方法：采用RT-PCR方法将CD20基因克隆出来，通过分子生物学技术构建过渡质粒pcDNA3.1-mCD20质粒，用PCR、酶切进行鉴定后，将该基因cDNA片段插入腺病毒穿梭质粒中，转化至高效感受态DH5ａ细菌细胞中进行扩增，提取质粒，获得重组质粒腺病毒穿梭质粒pDC315-mCD20。结果：成功构建表达mCD20基因的重组质粒，有助于后续研究构建Ad mCD20。     

pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato重组质粒构建腺相关病毒包装(英文)

背景:实验为基因治疗退变椎间盘实验的前期部分,旨在构建含免疫荧光的pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato重组质粒并应用腺相关病毒包装,为后期体内外实验打下基础。目的:构建人SOX9基因过表达腺相关病毒pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato的包装。方法:用酶切法将质粒pAAV-IRES-tdTomato和质粒pUC57-hSOX9连接成pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato,用质粒共转染方法包装腺相关病毒,感染293AAV细胞,腺相关病毒纯化及用生物学滴度测定法进行滴度测定。结果与结论:经测序结果BLAST比对分析,pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato完全与合成的基因序列hSOX9相符,滴度为1×107TU/mL。结果表明,人SOX9基因过表达腺相关病毒pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato包装成功。     

用于包装腺相关病毒293细胞的培养

背景:腺相关病毒作为一种主要的基因工程载体,已被广泛应用。但腺相关病毒是缺陷性病毒,需要包装细胞提供E1蛋白。腺相关病毒293细胞作为重要的腺相关病毒特异性包装细胞,能反式产生E1,但腺相关病毒293细胞娇嫩,培养困难,生物学特性易发生改变。因此,有必要建立一种腺相关病毒293细胞的培养方案以满足基因工程的需要。目的:建立一种体外培养腺相关病毒293细胞的方法。设计:开放性实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科。材料:腺相关病毒293细胞株购于Stratagene公司。高糖型DMEM粉(Gibco公司),AAV Helper-Free系统三质粒(Stratagene公司)。方法:实验于2006-10/2007-04在武汉同济医院神经内科实验室完成。在体外将腺相关病毒293细胞复苏,用高糖型DMEM生长培养基培养,当细胞单层融合度达到50%时传代和冻存,并倒置显微镜下观察细胞的生长状态,记录生长曲线。荧光倒置显微镜下观察,根据腺相关病毒293细胞在共转染腺相关病毒系统三质粒后以及被腺相关病毒上清感染后能否激发出绿色荧光,鉴定其包装腺相关病毒的生物学特性。主要观察指标:①腺相关病毒293细胞形态学观察。②生长曲线。③腺相关病毒包装。结果:①倒置显微镜下显示,腺相关病毒293细胞贴壁生长良好,呈现不规则的多角形,胞浆透亮,胞核隐约可见。②生长曲线显示,细胞传代后第1天为生长适应期,2～5d为生长活跃期,6d后细胞进入生长平台期。③荧光倒置显微镜下观察到,腺相关病毒293细胞激发绿色荧光,共转染腺相关病毒系统三质粒成功。腺相关病毒293细胞被腺相关病毒上清感染后激发出绿色荧光,腺相关病毒包装成功。结论:本实验的培养方法简单有用,培养的腺相关病毒293细胞可保持良好的腺相关病毒包装功能。     

腺相关病毒载体和中枢神经系统疾病的基因治疗

中枢神经系统疾病分子改变的深入研究和基因治疗技术的不断发展为临床治疗这些疾病带来了希望.但基因治疗临床应用的最大障碍之一便是转基因技术中载体系统的选择.理想的体内基因转移载体应具有较好的细胞靶向性,目的基因表达的可控性以及转移方法的简单易行.自七十年代末病毒载体的概念提出以来,用于基因治疗研究的缺陷性病毒载体种类日渐增加,应用也愈加广泛.其中,腺相关病毒(AAV)载体是目前病毒类转基因系统中较新的成员.由于该系统最大的优点之一是它的安全性较好,并且最有可能发展成为将外源基因整合入宿主细胞染色体的非病毒载体系统,因此倍受关注,并已开始应用于临床试验[1].     

3种丙型肝炎病毒结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建鉴定及表达

目的：构建能表达HCV不同结构基因（C、C E1、C E1 E2）的腺病毒表达载体的穿梭质粒，为进一步包装能高效表达HCV不同结构蛋白的腺病毒载体做准备。方法：用分别含有Bg1 Ⅱ及HindⅢ酶切位点的HCV不同片段结构基因上、下游引物，以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/HCV-3011为模板，通过PCR扩增获得HCV3种不同结构基因片段，基因片段回收后，分别以BglⅡ及Hing Ⅲ双酶切，定向插入到腺病毒穿梭质粒Pad.CMV-Link.1中CMV启动子下游Bgl Ⅱ与HindⅢ位点之间。获得3种重组腺病毒穿腺病毒穿梭质粒pad.HCV-C、Pad.HCV-CE1和Pad.HCV-S(C E1 E2)。通过Bgl Ⅱ/Hind Ⅲ双酶切，聚合酶链反应（PCR）及插入片段序列测定对质粒进行了三重鉴定，以抗HCV C单克隆抗体为一抗，利用间接免疫荧光法及Western Blot检测了3种穿梭质粒在HepG2细胞中的瞬时表达。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实，3种穿梭质粒的插入片段分别为HCV C、C E1和C E1 E2区基因片段，免疫荧光及Western Blot法检测表明其可以在HepG2细胞中瞬时表达。结论：构建的3种腺病毒穿梭质粒分别可以表达HCV不同段的结构基因，为包装表达HCV不同结构基因的腺病毒载体奠定了基础。     

腺相关病毒在基因治疗中的研究进展

基因治疗为人类一些疑难疾病的治疗带来了新的希望,但如何将外源基因高效导入靶细胞或机体,一直是人们渴望解决的问题。腺相关病毒（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ,ＡＡＶ）属细小病毒科,是动物病毒中最小的一种真核病毒,在高效转导、稳定表达方面具有其他病毒载体所没有的优越性。在为人类基因治疗寻找一种理想载体的研究,ＡＡＶ受到广泛重视。近年来其他生物学特性及应用研究均取得了较大进展。     

腺相关病毒在基因治疗中的研究进展

基因治疗为人类一些疑难疾病的治疗带来了新的希望,但如何将外源基因高效导人靶细胞或机体,一直是人们渴望解决的问题。腺相关病毒(Adeno-associated Virus, AAV)属细小病毒科,是动物病毒中最小的一种真核病毒,在高效转导、稳定表达方面具有其他病毒载体所没有的优越性。在为人类基因治疗寻找一种理想载体的研究中,AAV受到广泛重视。近年来其基本生物学特性及应用研究均取得了较大进展。     

携带肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体重组腺相关病毒的构建及鉴定

目的:构建一种携带肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)基因的重组腺相关病毒(recombined adeo-associated virus,rAAV)载体。方法:实验于2005-09/2006-04在中山大学附属第一医院普通外科实验室完成。首先构建携带可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体基因的穿梭质粒pAAV-sTRAIL,利用磷酸钙共沉淀法将穿梭质粒共转染入HEK293细胞中,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺相关病毒rAAV-sTRAIL。以噬斑分析法筛选单克隆重组腺相关病毒;聚合酶链反应法鉴定阳性重组腺相关病毒;氯化铯密度梯度离心法纯化病毒;紫外分光光度仪测定病毒颗粒数及纯度,噬斑分析法测定病毒感染滴度;Western blot检测rAAV-sTRAIL在293细胞中的表达情况。结果:成功构建了重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL,制备的病毒纯度好、滴度高,且在293转导细胞中能有效表达目的基因sTRAIL。结论:构建的重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL,为组织工程相关细胞转基因构建及临床应用提供先进的载体系统。     

重组腺相关病毒载体与血友病A基因治疗

基于腺相关病毒(AAV)独特的生物学特性,重组腺相关病毒载体(rAAV)是目前最具希望的基因治疗载体之一。在一些目的基因需长期、稳定表达的疾病的基因治疗中,愈来愈受到青睐。本文就AAV的基因结构和生物学特性、rAAV载体、载体改造及在血友病A基因治疗中的应用作一综述。     

腺相关病毒载体及其在基因治疗中的应用

1 腺相关病毒的生物学特性 腺相关病毒（adeno—associated virus，AAV）属微小病毒科，病毒颗粒直径约20～26nm，20面体，无包膜，其病毒基因组DNA为单链，线形。AAV属于依赖性病毒，最初被疑为腺病毒培养过程中的污染成分，后来发现它常定居于人类呼吸道和胃肠道，且能够在哺乳动物细胞中长期潜伏存在。     

人神经生长因子β亚基慢病毒载体的构建

背景:糖尿病神经源性膀胱的发病与神经生长因子缺乏有关,β亚基是构成神经生长因子(NGF)3种亚基中惟一具有生物活性的亚基,慢病毒载体是基因治疗的理想载体。目的:构建过表达人神经生长因子β亚基(β-NGF)基因的慢病毒载体。方法:通过目的基因的获得,载体质粒双酶切,载体质粒与目的基因的连接将人β-NGF基因克隆到慢病毒载体质粒pGC-FU中,构建重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF。观察人β-NGF基因的克隆情况,并进行重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF的PCR鉴定和测序。结果与结论:构建的重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF进行PCR实际获得的产物与预计PCR产物大小一致,即初步判断为构建成功的重组质粒。所获得的β-NGF基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。说明pGC-FU-β-NGF中携带有正确的β-NGF基因。结果证实,实验成功构建了携带人β-NGF基因的重组慢病毒载体质粒。     

人神经生长因子β亚基慢病毒载体的构建

背景：糖尿病神经源性膀胱的发病与神经生长因子缺乏有关,β亚基是构成神经生长因子（NGF）3种亚基中惟一具有生物活性的亚基,慢病毒载体是基因治疗的理想载体。目的：构建过表达人神经生长因子β亚基（β-NGF）基因的慢病毒载体。方法：通过目的基因的获得,载体质粒双酶切,载体质粒与目的基因的连接将人β-NGF基因克隆到慢病毒载体质粒pGC-FU中,构建重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF。观察人β-NGF基因的克隆情况,并进行重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF的PCR鉴定和测序。结果与结论：构建的重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF进行PCR实际获得的产物与预计PCR产物大小一致,即初步判断为构建成功的重组质粒。所获得的β-NGF基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。说明pGC-FU-β-NGF中携带有正确的β-NGF基因。结果证实,实验成功构建了携带人β-NGF基因的重组慢病毒载体质粒。     

腺相关病毒载体及其在血液系统基因治疗中的应用及研究进展

腺相关病毒园其独特的生物学特性,在基因治疗的应用中日益受到关注,近年来其基础及应用研究均取得了较大进展.本文就腺相关病毒的生物学特性、重组腺相关病毒载体的构建及其在血液系统基因治疗中的研究作一综述.     

重组腺相关病毒载体与血友病A基因治疗

基于腺相关病毒(AAV）独特的生物学特性，重组腺相关病毒载体（rAAV)是目前最具希望的因治疗载体之一。在一些目的基因需长期、稳定表达的疾病的基因治疗中，愈来愈受到青睐。本文就AAV的基因结构和生物学特性、rAAV载体、载体改造及在血友病A基因治疗中的应用作一综述。     

克隆人血小板源性生长因子B基因构建腺相关病毒载体及其病毒滴度测定

目的:克隆人血小板源性生长因子B基因于腺相关病毒载体中,以获得高感染滴度的重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒。方法:实验于2005-10/2006-11在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①健康足月产妇胎盘组织由青岛大学医学院附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意。DH5α宿主菌由青岛大学医学院附属医院中心实验室制备保存。②Trizol试剂提取健康足月产妇胎盘组织总RNA,反转录-聚合酶链反应一步法克隆人血小板源性生长因子B基因全长开放读框。聚合酶链反应产物定向克隆于腺相关病毒载体,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体进行双酶切和测序鉴定。③采用磷酸钙转染法将重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体、腺相关病毒包装载体,腺相关病毒辅助载体共转染腺相关病毒293细胞,包装得到重组腺相关病毒并回收病毒原液,显微镜下观察细胞及培养基的变化。④以携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒作为报告基因同重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体一样共转染相关病毒293细胞,对报告基因行X-Gal染色,通过蓝染的细胞计算病毒滴度。结果:①重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶切鉴定及序列分析:聚合酶链反应产物经电泳证明大小正确,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶经双酶切和测序鉴定证实将血小板源性生长因子B基因正确插入。②腺相关病毒293细胞转染过程中病毒颗粒的产生:腺相关病毒293细胞转染6h后培养基底部出现无数小黑色颗粒,为加入的转染复合物颗粒。24h后腺相关病毒293细胞部分变圆,随着病毒增殖,细胞成串浮起,出现细胞病理效应。48h后细胞变形,逐渐从壁上脱落。72h后培养基的颜色从红色变化为橙色或黄色。③病毒滴度检测:通过携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒感染细胞后X-gal染色计数,测定重组腺相关病毒滴度为1×1010 L-1。结论:成功构建表达人血小板源性生长因子B基因的重组腺相关病毒载体,为进一步研究血小板源性生长因子B基因治疗角膜病和相关细胞系与组织的增殖提供实验基础。     

腺相关病毒载体：通往肿瘤基因治疗的桥梁

腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是一种有缺陷的非致病的人类细小病毒。腺相关病毒载体作为基因治疗的载体,对长期基因矫正和基因治疗具有一定优越性。由于其低致病性、易操作性等优点,腺相关病毒载体被作为转导目的基因的理想载体,现已广泛地应用于多种肿瘤等疾病的基因治疗研究中。通过对腺相关病毒载体的改造优化,增加其靶向性,减少免疫原性,有望为相关疾病的基因治疗研究提供新的手段和方法。本文就目前腺相关病毒在肿瘤治疗中的应用研究加以综述,旨在对病毒载体在肿瘤生物治疗领域中的应用提供相应的参考。     

重组人血管内皮生长因子121的腺相关病毒载体构建及诱导体内血管生成的实验研究

目的:构建重组人血管内皮生长因子(VEGF)121的腺相关病毒载体(AAV-hVEGF121),并检测hVEGF121蛋白的表达和体内及体外的生物学活性.方法:AAV-hVEGF121体外转染COS7和人脐静脉血管内皮细胞.免疫组化方法检测hVEGF121蛋白的表达,MTF法测定hVEGF121对血管内皮细胞增殖的影响.将病毒注射到大鼠下肢肌肉中,3周后取材并现察转基因表达和体内血管新生的情况.结果:体内及体外免疫组化检测有hVEGF121蛋白的表达.MTT和组织学标本检测显示hVEGF121蛋白能促进血管内皮增殖并诱导血管新生,且体内应用无明显的副作用.结论:AAV-hVEGF121可安全有效地转染大鼠肌肉组织并诱导新生血管形成,为进一步的组织工程人工骨的血管化研究打下了基础.     

携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装

背景:细胞分裂周期2(cell division cycle 2,cdc2)在神经变性疾病如阿尔茨海默病的神经元变性过程中扮演了重要角色.以腺相关病毒为载体对cdc2基因进行沉默,可能对神经变性疾病的神经元起保护作用.目的:包装携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV).设计、时间及地点:空白对照实验,于2007-10/2008-08在武汉同济医院神经科实验室完成.材料:Helper Free腺相关病毒系统(pAAV-MCS-EGFP、p-RC、p-Helper)及AAV-293细胞为Stratagene公司产品.方法:应用分子生物学方法构建生成pAAV-MCS-U6-cdc2-slRNA-EGFP表达质粒;用磷酸钙法将该质粒和p-RC、p-Helper质粒共转染AAV-293细胞,包装生成携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP).病毒感染AAV-293细胞后行Western Blot检测cdc2-siRNA对细胞内cdc2基因的沉默效果,并用斑点杂交方法测定该病毒的滴度.主要观察指标:pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP质粒中插入片段U6-cdc2-siRNA的测序;3质粒pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP、p-RC、p-Helper共转染AAV-293细胞; rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP感染AAV-293细胞后cdc2的表达.结果:①DNA测序证明U6-cdc2-siRNA已成功构建到表达质粒pAAV-MCS-EGFP中.②AAV-293细胞表达绿色荧光蛋白,共转染成功.③包装得到的重组腺相关病毒(rAAV-U6-cdC2-siRNA-EGFP)感染AAV-293细胞后能显著下调AAV-293细胞cdc2基因的表达量.④rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP的滴度为1×1012v.g/mL.结论:携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装获得成功.它具有沉默cdc2基因表达的功能.     

腺相关病毒载体及其在血友病A基因治疗中的应用

腺相关病毒（AAV）载体所具有的生物学特性，使其成为一些需要目的基因长期而稳定表达的疾病基因治疗的理想载体之一。BDD FⅧ cDNA的应用以及AAV包装容量的拓展，可能使AAV在血友病A的基因治疗中发挥重要作用。     

肿瘤血管内皮抑素tumstatin腺相关病毒载体的构建及其功能的初步鉴定

目的:探讨腺相关病毒(rAAV)-肿瘤内皮抑素(tumstatin)(简称rAAV-Tum)栽体的构建及其生物学效应的初步鉴定.方法:用PCR扩增tumstatin序列至pAAV-MCS载体,构建pAAV-Tum;采用AAV-Helper Free System包装系统、"氯仿-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提"及冰乙醇沉淀法进行AAV的包装、纯化和浓缩;用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对rAAV-Tum生物学效应进行初步鉴定.结果:成功构建pAAV-Tum载体,并经酶切、PCR及测序证实;rAAV病毒颗粒滴度达2 × 1010 v.p/mL,浓缩后可达到2×1011～12 v.p/mL;rAAV-Tum可以分泌内皮抑素,诱导HUVEC凋亡.结论:成功构建rAAV-Tum腺相关病毒,体外实验表明该病毒能高效诱导内皮细胞的凋亡.