外源性IK1表达对垂体生长激素基因表达的调节

目的:研究Ikaros在调节垂体生长激素(GH)基因表达的作用.方法:应用系列的细胞与分子生物学技术如细胞培养、稳定转染、免疫组化、Northern Blot(N.B)、蛋白质印记、染色质免疫共沉淀等方法分析Ik1及其同工蛋白Ik-6在垂体GH基因表达调节中的作用.结果:野生型Ikaros(Ik1)在垂体GH4细胞中抑制了GH基因mRNA 和蛋白的表达水平.Ikaros不直接与GH基因启动子结合,但能抑制TSA引起的GH基因启动子的组蛋白乙酰化作用.Ik1能够选择性地抑制GH启动区的染色质组蛋白-3的乙酰化作用,因而阻碍了Pit1与GH启动子DNA的结合.结论: Ikaros在垂体激素基因表达过程中抑制了GH基因的表达(分泌),这一研究为功能性垂体腺瘤GH过度分泌的分子靶向治疗提供了新的参考.     

乙型肝炎病毒X蛋白对人肝癌细胞hsp90α基因表达调控机制研究

目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)参与人肝癌细胞hsp90α基因表达的调控机制。方法:采用半定量RT-PCR、蛋白质印迹法及荧光素酶活性检测技术,检测不同剂量HBx表达载体转染的HepG2细胞中hsp90α基因mRNA和蛋白表达及启动子活性的变化,并观察转录因子c-Myc阻断剂10058-F4对上述效应的影响。采用启动子实验分析c-Myc对hsp90α基因启动子的激活作用。RT-PCR和蛋白质印迹法检测表达HBx的HepG2细胞中c-Myc mRNA和蛋白表达情况;蛋白质印迹法及ELISA分析细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达水平及内源性ERK的活性。结果:HBx基因转染HepG2细胞中hsp90α基因的mRNA和蛋白表达水平以及启动子活性呈剂量-依赖性增强,P=0.006 1;c-Myc阻断剂抑制了HBx对hsp90α基因表达的上调效应。c-Myc通过与c-Myc位点(-1094/-1088)结合转录激活hsp90α基因启动子活性。HBx使HepG2细胞中c-Myc mRNA和蛋白表达增强,并伴有ERK1/2蛋白磷酸化水平增加,ERK活性明显提高,P=0.032。结论:HBx通过ERK信号通路反式激活肝癌细胞c-Myc介导的hsp90α基因启动子活性,从而上调hsp90α基因表达。     

转染α1,2-岩藻糖转移酶基因对人卵巢癌细胞系RMG-1癌相关基因表达的影响

背景与目的:前期研究证明转染外来α1,2-岩藻糖转移酶(α1,2-fucosyl transferase,α1,2-FT)基因后人卵巢癌细胞系RMG-1的恶性生物学行为加强.本研究的目的是探讨转染α1,2-FT基因对卵巢癌细胞系RMG-1癌相关基因表达的影响.方法:将基因表达载体pcDNA3.1-HFT-H和空载体pcDNA3.1转染至RMG-1细胞中分别生成RMG-1-H细胞和RMG-1-C细胞,利用基因芯片对这两种细胞的基因表达序列进行分析,使用GoMiner在线数据库进行信息查询.结果:与RMG-1细胞比较,RMG-1-H细胞中有88种差异性表达基因,其中60种基因表达增强,28种基因表达降低.检索其基因功能,发现在分子功能、生物学行为和细胞成分定位三个分支上,差异表达的基因参与到了诸如蛋白质结合、核苷酸结合,细胞增殖、DNA依赖性转录的调节、信号转导、蛋白氨基酸磷酸化、转录、细胞粘附等多方面.结论:转染α1,2-FT基因使卵巢癌RMG-1细胞的基因表达发生了改变.     

表达的siRNA对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因的干涉作用

目的:构建针对人survivin基因的siRNA真核表达载体,检测其对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因表达的干涉作用.方法:将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒稳定转染入SKBr-3细胞,RT-PCR、Western blot印记杂交和细胞免疫化学法检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果:经酶切鉴定及基因测序证实,重组质粒中已插入目的基因片段.RT-PCR显示两个干涉载体均抑制了目的基因的转录;Western blot印记杂交和细胞免疫化学检测结果显示pSUPER-S1对蛋白表达的抑制作用更强.结论:成功地构建了针对人survivin基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,并在人乳腺癌细胞株SKBR-3中有效发挥了对survivin基因的干涉作用.     

MDR1启动子/荧光素酶质粒的构建及其在朊蛋白高表达胃癌细胞中的活性检测

目的:构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法:PCR克隆人MDRl基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果:PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3~5倍。结论:成功构建含MDRl启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。     

CXCL16基因与红色荧光蛋白pDsRed2-N1融合基因表达载体的构建

目的:构建人趋化因子配体16(CXC ligand 16,CXCL16)与增强型红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16,使CXCL16-RFP融合蛋白在人293T细胞中稳定表达。方法:针对CXCL16基因设计引物,扩增人CXCL16 cDNA,退火后插入含有RFP的表达载体pDsRed2-N1。测序正确的CXCL16和RFP的融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16,经脂质体转染人293T细胞株,G418筛选获得稳定转染的细胞株。荧光显微镜观察细胞转染情况,Western blotting比较转染前后293T细胞中CXCL16蛋白的表达变化。结果:经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实,CXCL16基因已正确插入pDsRed2-N1中RFP基因的上游,获得融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16。空载体pDsRed2-N1和融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16经脂质体转染人293T细胞后,在荧光显微镜下可观察到表达RFP的细胞发出红色荧光,转染效率分别可达95%和85%。pDsRed2-N1/CXCL16转染293T细胞后,CXCL16蛋白的表达水平显著上调。结论:成功构建的pDsRed2-N1/CXCL16融合基因表达载体可在293T细胞中稳定表达CXCL16蛋白,为进一步研究CXCL16在细胞增殖调控中的作用奠定了基础。     

RNAi技术沉默STAT3基因对食管癌EC-1细胞MMP-2基因表达的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因对食管癌EC-1细胞MMP-2基因表达的影响,进而探讨STAT3基因在食管癌发生、发展、浸润转移中的作用。方法化学合成siRNA,转染人食管癌EC-1细胞,荧光显微镜下观察转染效率,采用半定量RT-PCR和Western blot法同时检测STAT3、MMP-2基因和蛋白表达水平的变化。结果食管癌EC-1细胞转染特异性STAT3 siRNA后,STAT3和MMP-2基因和蛋白的表达同时受到明显抑制。结论化学合成的STAT3 siRNA可有效抑制STAT3基因和蛋白的表达,同时通过结合MMP-2启动子下调MMP-2基因和蛋白的表达,从而在食管癌发生、发展、浸润转移中起作用,STAT3基因有可能成为食管癌治疗中重要的靶基因位点。     

蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转染对小鼠黑色素瘤B16F1细胞基因表达谱的影响

背景与目的:本实验室已证明蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(snake venom cystatin, sv-cystatin)具有抗肿瘤侵袭转移作用.为了进一步阐明其分子机制,本研究利用高通量的基因芯片技术探讨sv-cystatin基因转染对小鼠黑色素瘤细胞(B16F1)基因表达谱的影响.方法:分别将pcrDNA3.1/sv-cystatin及空载体pcDNA3.1转染B16Fl细胞,建立稳定转染的B16Fl/sv-cystatin及B16F1/pcDNA3.1细胞株,提取总mRNA.应用高通量的基因芯片技术检测差异表达基因,半定量RT-PCR法分别验证5个上调和5个下调的差异表达基因.结果:B16F1细胞经转染sv-cystatin后.共检测了1218个基因,其中有45个差异表达基因,21个基因表达上调(Ratio>3),24个基因表达下调(Ratio<0.5),这些基因的功能涉及细胞粘附迁移、细胞免疫调节、增殖分化与凋亡、基因转录和细胞内信号转导等方面.10个差异表达基因的RT-PCR验证结果与基因芯片分析结果相符.结论:Sv-cystatin不仅具有抑制细胞外基质的作用,而且还具有细胞免疫调节、增殖分化与凋亡、基因转录和细胞内信号转导等多种生物学功能.     

乙型肝炎病毒X基因经p53依赖性与非依赖性途径对p21WAF1表达的影响

背景与目的:研究表明,在不同情况下乙型肝炎病毒 X基因(HBx)对 p21WAF1的表达具有不同的影响,但作用机制仍不清楚.本研究的目的是探讨 HBx对 p53下游基因 p21WAF1的影响.方法:通过正、反义野生型 p53(wtp53)与 HBx单转染及共转染人肝癌细胞株 SMMC-7721细胞,以及 HBx转染不同内源性 p53状态的肝癌细胞株,检测 p21WAF1启动子荧光素酶基因表达,并用流式细胞仪观察细胞周期的变化 ,Western blot法比较 p53、p21WAF1表达水平的变化.结果:正、反义 wtp53与 HBx 单转染及共转染 SMMC-7721细胞 ,HBx与正义 wtp53共转染组(1.007± 0.098)与单转染正义 wtp53(0.490± 0.012)相比,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显升高(P< 0.05),其余各组 HBx均可导致 p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显减少(P< 0.05).Western blot法表明 HBx可导致 p53的表达增加,但 p53表达较低的 SMMC-7721细胞转染 HBx后 p21WAF1蛋白的表达减弱 ,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达(0.053± 0.010)也较对照组(0.094± 0.013)明显减少(P< 0.05),而 p53表达较强的 HepG2细胞转染 HBx后 p21WAF1蛋白的表达增强、p21WAF1启动子荧光素酶基因的表达(1.252± 0.052)较对照组明显升高(0.767± 0.031)(P< 0.05).细胞周期结果表明瞬时转染 HBx的 SMMC-7721和 Hep3B细胞停滞在 G0-G1期细胞数(42.31%、36.96%)较对照组(47.10%、42.90%)减少,而瞬时转染 HBx的 HepG2细胞(63.62%)停滞在 G0-G1期的细胞数较对照组(57.42%)增加,但稳定筛选后 ,pcDNA3HBxHepG2细胞(57.31%)停滞在 G0-G1期细胞数较对照组(61.49%)减少.结论:HBx一方面可能引起 p53蛋白在细胞内积聚导致 p21WAF1表达升高,另一方面可直接抑制 p21WAF1启动子的转录活性.