miRNA-22在脂肪基质细胞体外脂向分化过程中的表达

背景：脂肪基质细胞在特定条件下可以向脂肪细胞分化, 然而,脂肪基质细胞脂向分化的分子机制仍不明确！ 目的：明确miRNA在脂肪基质细胞脂向分化过程中是否发挥作用及其可能机制。 设计、时间及地点：观察对照试验,于2007-10/2008-03在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室完成。 材料：出生30 d健康雄性SD幼鼠8只,取出脂肪,采用密度梯度离心结合贴壁培养法获得了纯度高的脂肪基质细胞。 方法:采用脂向诱导液对第3代的脂肪基质细胞进行诱导培养。建立脂肪基质细胞体外脂向分化细胞模型,采用miRNA芯片技术筛选脂肪基质细胞向脂肪细胞方向分化的相关miRNA,使用实时定量聚合酶链反应技术对芯片结果进行验证。 主要观察指标：①细胞形态学。②PPARγ免疫细胞化学染色和油红O染色。③miRNA芯片结果。④实时定量聚合酶链反应结果。 结果: ①经显微镜下观察、油红O染色及PPARγ免疫细胞化学染色检测证实脂肪基质细胞已经脂向分化。②miRNA芯片发现诱导组中miRNA-22的表达量呈下降趋势。③实时定量聚合酶链反应结果证实miRNA-22的表达量与对照组相比显著减少(P < 0.05)。 结论: miRNA-22在脂肪基质细胞脂向分化后的表达有显著降低,提示miRNA-22可能参与脂肪基质细胞的脂肪分化调控过程,生物信息学分析提示,该过程可能通过对其靶基因MAPK7(ERK5)的调控而实现。     

microRNA-125b在Flk1+脂肪源间充质干细胞向神经分化过程中的表达变化

背景：间充质干细胞的分化受遗传和表观遗传因素的严格调控,越来越多的研究表明microRNA也在这一过程中发挥重要的调控作用。 目的：观察microRNA-125b在Flk1+间充质干细胞向神经细胞分化过程中的表达变化。 方法：成人脂肪样品取自15~35岁健康志愿者,贴壁培养法获得间充质干细胞,采用神经诱导培养基对第3代间充质干细胞进行诱导培养。在诱导第0,4,8,12天检测microRNA-125b的表达情况。应用microRNA芯片技术检测间充质干细胞在神经诱导前后microRNA-125b的表达差异并采用反转录-聚合酶链反应和Taqman real-time PCR的方法进行验证。检测inhibitor抑制microRNA-125b表达的有效性。 结果与结论：①实验成功诱导间充质干细胞向神经分化,诱导培养后12 d观察到细胞形态发生变化：大部分细胞胞体回缩,呈球形,并有轴突形成,免疫荧光检测结果显示,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞特征性表面标志。②RT-PCR和Taqman real-time PCR显示神经诱导后microRNA-125b表达明显升高,与microRNA芯片结果一致。③inhibitor可以有效抑制microRNA-125b的表达。提示microRNA-125b可能在间充质干细胞成神经分化过程中起调控作用。     

骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化过程中Wnt信号通路的调控效应*

背景：骨髓间充质干细胞的成脂肪分化与成骨分化比例的失衡与许多骨疾病密切相关,而近些年发现Wnt信号通路在调控骨髓间充质干细胞的分化方向中起重要作用。 目的：通过Wnt信号通路PCR基因芯片观察大鼠骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞后相关基因表达的变化,寻找Wnt信号通路中调控骨髓间充质干细胞分化的靶基因。 方法：采用大鼠第3代骨髓间充质干细胞分别进行成骨诱导和成脂诱导,7 d后用Trizol萃取培养瓶中的细胞总RNA,倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征及成骨诱导后和成脂诱导后细胞形态特征。采用Wnt信号通路PCR芯片(大鼠)进行基因芯片检测,以未诱导组为对照,计算成脂肪诱导,成骨诱导后相关基因上调/下调的比值。 结果与结论：①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞经成骨诱导后向成骨细胞方向分化,经成脂诱导后向脂肪细胞方向分化。②与未诱导组相比,骨髓间充质干细胞成脂诱导后Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk-1,kremen,FZD1,FZD7)等15个(ratio>2),下调的基因(sFrp 5,β-catenin,Dvl3,Tcf7)等16个(ratio<0.5)。成骨诱导后,Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk1,kremen,β-catenin,Wnt11)6个,表达下调的基因(sFrp5,sFRP4,Fzd1)等15个。提示Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞成脂细胞分化和成骨细胞分化中发挥重要作用。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的：已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞，实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性，以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞，为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞。 方法：实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行。①动物：选择5只普通级SD大鼠，由泸州医学院实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉，取双侧胫骨和股骨，磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔，采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞，胰蛋白酶与EDTA联合消化，传至第4代，用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化。③实验评估：观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化，采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：①骨髓基质细胞形态观察：原代细胞接种1 d后开始贴壁增殖，3 d后多数贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形；10 d后90%细胞融合，以长梭形为主，突起粗大，形成网状、片状；传代后细胞贴壁速度加快，增殖能力更强，7 d左右达到融合。②诱导分化后细胞生长情况和形态变化：第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d，成球的细胞脱离瓶底，悬浮在细胞液中。将细胞离心弃上清，换成血清分化液后，细胞球逐渐贴壁，球周围很快发出突起，分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞。③神经细胞特异性标志的表达：骨髓源性细胞球表达巢蛋白，呈棕黄色，为神经干细胞；从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性。 结论：骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞，且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞。     

改良诱导方案诱导SD大鼠脂肪源性干细胞定向分化为软骨细胞

背景：软骨组织工程是骨科研究的热点,在种子细胞的研究上由于软骨细胞存在老化现象更多的研究集中在干细胞向软骨细胞分化上。分化条件经历单细胞因子、联合细胞因子及贯续细胞因子的应用。 目的：观察改良诱导方案诱导SD大鼠脂肪源性干细胞定向分化为软骨细胞的能力。 设计、时间及地点：观察性实验,于2008-06/12在遵义医学院珠海校区中心实验室完成。 材料：SPF级健康SD大鼠5只,鼠龄18~22 d,体质量约25 g,用于脂肪干细胞的培养基扩增。 方法：在无菌条件下从SD大鼠腹股沟区取皮下脂肪组织约3 g,Ⅰ型胶原酶消化后,1 000 r/min离心10 min,待细胞长满瓶底80%时用2.5 g/L胰蛋白酶消化,按1∶2或1∶3比例传代培养。加入软骨诱导培养基14 d后阿新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测脂肪干细胞向软骨细胞的诱导分化。 主要观察指标：流式细胞仪检测大鼠脂肪干细胞表面CD44、CD45和CD49d的表达。 结果：SD大鼠脂肪组织分离培养出的细胞经流式细胞仪检测CD44、CD49d表达阳性,CD45表达阴性。加入软骨诱导培养基定向诱导72 h后,细胞生长缓慢,逐渐变成圆形,并渐渐有软骨结节形成;诱导分化2周后,阿新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。 结论：SD大鼠脂肪组织能够分离培养出脂肪干细胞,生物学特性与骨髓间充质干细胞相似,能向软骨细胞分化。     

杜仲诱导大鼠间充质干细胞成骨分化中成骨与成脂相关转录因子的表达

背景：杜仲对骨质疏松具有明显的干预和治疗作用,前期研究发现杜仲能够显著诱导骨髓间充质干细胞成骨分化和抑制成脂分化,而对于学术界广泛认同的成骨和成脂相关转录因子的表达变化还未见报道。 目的：观察杜仲诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中成骨和成脂相关转录因子表达的变化。 方法：制备杜仲水/醇提取物,诱导培养至第3代的SD大鼠间充质干细胞,提取物按生药2 g,定容至15 mL体积为原液,诱导时按10-3、10-4倍稀释度稀释。诱导实验分为6组：阴性对照组(加入与诱导物等量的PBS);阳性对照组(诱导物为地塞米松0.01 mmol/L,β-甘油磷酸钠10 mmol/L,L-抗坏血酸钠50 mg/L);杜仲水提取物10-4稀释度诱导组;杜仲水提取物10-3稀释度诱导组;杜仲醇提取物10-4稀释度诱导组;杜仲醇提取物10-3稀释度诱导组,各组于诱导之后的第15天终止培养。RT-PCR和荧光定量PCR方法检测成骨分化转录因子基因Runx2、Osterix和成脂分化转录因子基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ、脂肪酸结合蛋白的表达。 结果与结论：Runx2除在10-3稀释度水提取物组表达下调,在10-4稀释度醇提取物组上调外,其他各组无显著变化;Osx在各诱导组的表达均明显下调;过氧化物酶体增殖物激活受体γ在各组中无显著变化;脂肪酸结合蛋白在各组均下调。提示杜仲诱导间充质干细胞成骨分化与成脂相关转录因子脂肪酸结合蛋白的表达抑制相关。     

大鼠附睾脂肪垫脂肪源性干细胞的分离培养及分化潜能

背景：相对于骨髓基质干细胞,脂肪源性干细胞来源丰富,取材方便,干细胞丰度高,极易培养,具有多向分化潜能,有望成为组织工程、细胞治疗以及基因转染良好的源细胞,但目前对脂肪源性干细胞的研究尚处于初级阶段。 目的：拟在体外分离培养大鼠脂肪源性干细胞,并探讨其分化潜能。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-06/2009-01在南方医科大学组胚教研室和南方医院临床医学实验中心完成。 材料：SPF级成年雄性SD大鼠1只,由南方医科大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下切取大鼠双侧附睾尾脂肪垫,胶原酶消化法分离培养脂肪源性干细胞,胰蛋白酶消化法传代扩增。取第4代脂肪源性干细胞接种到96孔板,5×104个细胞/皿,待细胞贴壁后分成3组：成骨诱导组加入成骨培养基,成脂诱导组加入成脂培养基,对照组仍用基础培养基,培养14 d。 主要观察指标：脂肪源性干细胞的形态变化、体外增殖能力、细胞免疫化学鉴定结果。脂肪源性干细胞成骨和成脂分化能力。 结果：体外培养的脂肪源性干细胞易扩增,传代后以长梭形细胞为主,呈旋涡状排列,克隆样生长;经多次传代仍能保持较强的增殖能力,细胞生长曲线呈“S”形;细胞表面标志CD44和CD49d呈阳性表达,CD106呈阴性表达。脂肪源性干细胞经成骨诱导7 d后,碱性磷酸酶染色呈阳性;成脂诱导3 d后,油红O染色示胞浆内有脂滴出现;对照组细胞碱性磷酸酶染色呈阴性,无脂滴存在。 结论：从大鼠附睾脂肪垫内分离的脂肪源性干细胞易于培养和传代扩增,在特殊条件下可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

残粒脂蛋白诱导大鼠脂肪间充质干细胞的成脂分化**★

背景：高三酰甘油血症患者血浆中的极低密度脂蛋白和乳糜微粒增多，可被水解为残粒脂蛋白。极低密度脂蛋白可诱导其他前体脂肪细胞的成脂分化，推测残粒脂蛋白也具有诱导脂肪间充质干细胞成脂分化的能力。 目的：探讨不同质量浓度残粒脂蛋白对大鼠脂肪间充质干细胞成脂分化的影响。 方法：无菌条件下切取大鼠腹股沟脂肪垫，胶原酶消化法获取脂肪间充质干细胞，接种入含胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，观察细胞形态变化，流式细胞仪检测细胞表面分子的表达。将传至第2代的脂肪间充质干细胞分为4组，对照组单纯以10 mg/L胰岛素进行孵育，剩余3组另加入50，100，200 mg/L残粒脂蛋白，18 d后通过油红O染色评价成脂分化情况。 结果与结论：原代脂肪间充质干细胞早期呈集落样生长，随传代次数增加，逐渐呈均一性梭状细胞外观，细胞表达CD105，基本不表达CD34。与对照组比较，加入50 mg/L残粒脂蛋白后油红O染色强度无明显变化(P > 0.05)，加入100 mg/L残粒脂蛋白后油红O染色强度明显升高(P < 0.05)；加入200 mg/L残粒脂蛋白油红O染色强度明显高于其他3组(P < 0.05)。提示残粒脂蛋白以浓度依赖性的方式诱导脂肪间充质干细胞成脂分化。     

三七总皂甙通过细胞外信号调节蛋白激酶1/2信号通路促进大鼠

背景：三七总皂甙对骨髓基质细胞向神经样细胞分化的效应及相关信号通路目前尚不明确。 目的：探讨细胞外信号调节蛋白激酶1/2信号通路对三七总皂甙调节大鼠骨髓基质细胞向神经细胞增殖、分化的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-05/10在汕头大学医学院分子生物学实验室完成。 材料：4~6周龄雄性SD大鼠9只,由汕头大学医学院实验动物中心提供。三七总皂甙为广西梧州制药集团股份有限公司产品,细胞外信号调节蛋白激酶的抑制剂PD98059为Cell Signaling Tech 公司产品。 方法：全骨髓法体外分离纯化大鼠骨髓基质细胞,取传至第3代细胞进行诱导分化,设立3组：单纯诱导组向培养液中加入10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,预诱导24 h后全量换为正式诱导液(含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2% DMSO、200 μmol/L丁羟回醚的α-MEM培养基),每24 h半量换诱导液1次;三七总皂甙组向预诱导液和正式诱导液内加入终浓度100 mg/L三七总皂甙;PD98059组在三七总皂甙组培养液基础上加入10 μmol/L PD98059。 主要观察指标：细胞形态学观察,MTT法检测细胞增殖情况,免疫组织化学方法鉴定细胞Nestin的表达。 结果：诱导6 h后,少数细胞呈锥形,细胞突起增多伸长,类似神经元,继续诱导培养后细胞突起增多,突起相互连接成网状。与单纯诱导组、PD98059组比较,诱导6,12,24 h三七总皂甙组细胞均明显增殖(P < 0.05),且随诱导时间延长呈递增趋势(P < 0.05);单纯诱导组、PD98059组间比较无明显差异(P > 0.05)。与单纯诱导组比较,诱导24 h后三七总皂甙组Nestin阳性率明显升高(P < 0.05),PD98059组Nestin阳性率明显降低(P < 0.05)。 结论：三七总皂甙可以促进骨髓基质细胞的神经分化和分化后增殖,细胞外信号调节蛋白激酶1/2的特异性抑制剂PD98059能够拮抗三七总皂甙促增殖分化作用,提示细胞外信号调节蛋白激酶1/2信号通路是三七总皂甙促进骨髓基质细胞向神经细胞分化和增殖的重要环节。     

牛磺酸对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响☆

目的：有研究发现，喂食牛磺酸的糖尿病鼠脂肪细胞摄糖的能力增加，但牛磺酸是否能影响脂肪细胞分化，目前还尚不清楚。本实验观察牛磺酸对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响，并探讨牛磺酸影响3T3-L1前脂肪细胞分化的机制。 方法：实验于2006-07/09在中南大学湘雅三医院实验中心完成。①实验材料：实验中应用的3T3-L1细胞由中国科学院上海细胞库提供。②实验方法：将3T3-L1细胞用含体积分数为0.10胎牛血清的高糖DMEM培养液培养，内含108 u/L 青霉素，80×1010 U/L链霉素。细胞达汇片后，按5×107 L-1密度接种于培养瓶中，应用0.5 mmol/L IBMX、0.5 mg/L胰岛素和1 μmol/L地塞米松诱导分化，实验组加入牛磺酸，对照组未实施牛磺酸干预。油红O染色观察脂肪细胞分化情况。10， 20 mmol/L牛磺酸分别干预C3T3-L1前脂肪细胞24，48 h，抽提实验组和对照组细胞RNA及蛋白。③实验评估：采用RT-PCR及Western-blot方法观察脂肪分化相关基因的表达变化。 结果：①10 mmol/L 牛磺酸干预后14 d，实验组油红O染色阳性脂肪细胞明显少于对照组。②10，20 mmol/L牛磺酸分别干预3T3-L1前脂肪细胞24，48 h后，对脂肪分化相关基因Insig-2蛋白、PPAR、Insing-2、脂联素、脂联素受体、GLUT-4、AP-2 mRNA表达无明显影响。