丹参注射液体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

分别采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和丹参注射液联合或2-巯基乙醇(2-ME)单种诱导骨髓间质干细胞(rMScs),免疫组化鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP).结果 显示,bFGF和丹参注射液联合或2-ME单种诱导剂诱导后,rMScs胞体收缩,突起伸出;免疫组化显示,诱导出的神经元样细胞NSE、NF表达阳性,GFAP阴性.认为在体外用丹参注射液与bFGF联合诱导可以使成年Wistar大鼠rMSc8分化为神经元样细胞,并且存活时间明显延长.     

β-BME与BDNF联合RA体外诱导成人MSCs分化为神经元样细胞对比观察

目的 寻找体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的良好方法.方法 分别采用β-巯基乙醇(BME)、脑源性神经营养因子(BDNF)和维A酸(RA)为诱导剂,体外诱导人MSCs分化为神经元样细胞.用免疫组化SP法对诱导后细胞进行鉴定.结果 两种方法诱导6 h后,MSCs均呈现神经元样细胞改变,伸出突起,类似树突和轴突.该细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)均呈阳性表达,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)均呈阴性表达.其中β BME诱导6 h后神经元样细胞分化率为68.32%±2.58%,BDNF+RA诱导6 h后神经元样细胞分化率仅为42.45%±3.26%,两组比较,P＜0.05.但β BME诱导后分化细胞存活时间较短,而BDNF+RA诱导后分化细胞存活时间较长.结论 两种诱导方法均可在体外定向诱导人MSCs转化为神经元样细胞,神经元分化率及存活时间不同.     

脑组织匀浆诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞

目的模拟体内微环境,研究人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)在脑组织匀浆诱导下向神经样细胞的分化程度。方法体外分离、培养、扩增hUCMSCs,流式细胞仪鉴定其表面抗原CD29、CD44、CD45、CD105、CD34、HLA-DR;制备大鼠脑组织匀浆与hUCMSCs共培养,在倒置显微镜下观察细胞形态变化,并应用免疫细胞化学技术检测共培养3 d后细胞内神经干细胞表面标志物巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果脑组织匀浆培养hUCMSCs后,细胞表达nestin、NSE及GFAP,而正常培养的hUCMSCs不表达。结论脑组织匀浆可以诱导hUCMSCs向神经样细胞分化。     

香丹注射液体外诱导大鼠MSCs分化为多巴胺能神经元效果观察

目的探讨香丹注射液体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）定向分化为多巴胺（DA）能神经元的效果。方法体外分离、扩增和鉴定大鼠骨髓MSCs。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导24h后香丹注射液诱导3h，采用免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白2（MAP2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、酪氨酸羟化酶（TH）、增殖细胞核抗原（PCNA）、Bcl-2表达。结果诱导后MSCs分化为具有典型神经元形态的细胞，NSE、MAP2和TH呈高表达，PCNA表达明显减弱。结论香丹注射液诱导大鼠MSCs分化为DA能神经元效果较好。     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(hMSC)体外定向诱导可否分化为神经元样细胞。方法 Percoll分离液离心分离hMSC，体外扩增，采用两种方法：①含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24小时，甲氧酚(BHA)和二甲亚枫(DMSO)联合诱导6小时；②2-巯基乙醇(2-ME)预诱导24小时，BHA和DMSO诱导6小时。免疫组化检测神经元样细胞表达神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果 hMSC在体外扩增传至5代后，流式细胞仪显示hMSC表面抗原CD29、CD44、CD90表达阳性率分别为99．5％，97．8％，98．8％。采用两种方法诱导hMSC后，胞体收缩，突起伸出，较密的部分神经元拉成网状；免疫组化显示诱导的神经元样细胞能特异性表达NSE、NF，不表达GFAP。结论 成人骨髓hMSC在体外可以分化为神经元样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞培养、鉴定及神经样细胞分化

目的建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外培养、纯化、扩增的实验体系,并进行细胞表面抗原的鉴定及定向诱导分化检测。方法采用全骨髓贴壁培养法分离、纯化大鼠BMSCs;观察细胞形态,采用细胞免疫化学染色及流式细胞术检测细胞表面CD90、CD29、CD34和CD45表达;分别使用β-巯基乙醇及碱性成纤维细胞生长因子诱导细胞向神经样细胞分化,采用Western印迹法检测诱导后神经标志蛋白[神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)]表达。结果培养至第3代的BMSCs,CD90、CD29表达阳性,CD34和CD45表达阴性;经诱导后,神经标志蛋白表达显著增高(P<0.05)。结论全骨髓贴壁培养法可分离、培养得到高纯度、具备相关生物学特性的BMSCs,且经诱导可定向分化为神经样细胞。     

熟地含药血清对骨髓间质干细胞向神经细胞分化的影响

目的 观察熟地含药血清对骨髓间质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的影响.方法 原代培养MSCs至第3代,并鉴定;熟地水煎剂分高、中、低3个剂量组对SD大鼠灌胃,10d后取大鼠血清加入培养至第三代的骨髓间质干细胞中诱导其分化,每组分别诱导24h,诱导后的细胞用免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)三种蛋白.结果 原代培养鉴定为MSCs;熟地含药血清能诱导MSCs向神经细胞分化,诱导后与对照组比较,高、中、低3个剂量组细胞NSE,Nestin的表达率都较高(P＜0.05),且高、低剂量组之间比较有统计学意义(P＜0.05);但GFAP表达极低.表明所分化的细胞为神经细胞.流式细胞仪检测结果 显示,β-巯基乙醇对细胞诱导分化能力强而促细胞增殖能力弱.结论 经典的培养方法,可分离出相对较多、纯度较高、生长状态良好的MSCs细胞;熟地含药血清能够促进MSCs向神经细胞的分化.     

大鼠骨髓基质干细胞体外分化为神经元样细胞并表达肠神经相关神经营养因子

目的探讨维甲酸、锌联合胎肠培养基诱导大鼠骨髓基质干细胞向神经元细胞分化的可能性以及分化前后肠神经相关神经营养因子表达的变化。方法体外培养大鼠骨髓基质干细胞（BMSC），传代至第6代，进行神经诱导分化。先以bFGF（10ng／ml）预诱导24h，然后以维甲酸（Retinoic acid，RA）、锌在胎肠培养基（FGCM）条件下诱导10d。免疫荧光法检测神经元标志神经特异性烯醇化酶（NSE）和神经丝蛋白（NF）的表达。RT-PCR法检测胶质源神经营养因子（GDNF）和神经生长因子（NGF）mRNA的表达。结果流式细胞检测BMSC高表达CD90（99，7％），而CD45表达阴性。诱导10d后，部分细胞在形态上表现出神经元样改变，免疫荧光染色神经元标志NSE和NF阳性，而胶质细胞标志GFAP阴性。RT-PCR检测发现，BMSC诱导前低表达神经营养因子NGF和GDNF mRNA，而诱导后表达水平显著增加。结论维甲酸、锌联合胎肠培养基不仅能在体外诱导BMSC分化为神经元样细胞，而且能促进肠神经相关神经营养因子表达显著上调。     

骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中褪黑素受体和多效蛋白的表达

目的体外诱导成人骨髓间充质干细胞（MSCs）向神经元样细胞分化,并探讨分化过程中多效蛋白（PTN）和褪黑素（Mel）受体亚型MT1、MT2 mRNA的表达,以探索MSCs向神经元样细胞分化的特性和机制。方法密度梯度离心加贴壁培养法分离成人MSCs,原代和传代培养。取第6代MSCs设对照和实验组进行诱导,诱导后30min至3d,观察细胞形态并计数。免疫细胞化学法和RT—PCR法测定分化后细胞神经细胞特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白-2（MAP-2）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和诱导前、诱导后12hPTN和MT1、MT2 mRNA的表达。结果接种24h后MSCs开始贴壁,呈圆形或椭圆形。3d后可见梭状细胞呈集落状生长,10d～14d融合。第5代～第6代时呈现较均一的成纤维细胞样形态。诱导后胞体向胞核收缩;出现双极及多极细胞。12h变形细胞增多,细长突起相互连接。24h后变形细胞增多不明显。诱导后12h大部分细胞表达NSE、MAP-2,未检测到GFAP的表达。实验组诱导后12h细胞有PTN和MT1 mRNA的表达。结论PTN和Me1信号传导可能参与调控了MSCs向神经元样细胞的分化。     

大鼠脑组织上清液诱导脂肪来源干细胞分化为神经细胞的实验研究

目的 观察正常大脑、脑梗死对侧及梗死侧大脑脑组织上清液对脂肪来源干细胞(ADSCs)向神经元样细胞分化的影响.方法 取SD大鼠腹膜后脂肪组织进行ADSCs分离培养;用正常脑组织上清液、脑组织梗死侧及对侧脑组织上清液对ADSCs进行诱导,免疫荧光法检测神经细胞标志物的表达,荧光显微镜下观察细胞阳性率.结果 (1)脑梗死侧组诱导组神经元特异性烯醇酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达率均高于其他组(P＜0.05).(2)脑梗死对侧组及正常对照组诱导组NSE、MAP-2、GFAP表达率均高于未干预组(P＜0.05).结论 脑梗死侧及脑梗死对侧组织上清液均能诱导大鼠ADSCs分化为神经元样细胞,表达神经细胞标志物,但前者作用更为明显.     

体外诱导骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的观察大鼠骨髓基质细胞（MSCs）的生长特点及在体外诱导条件下分化为神经元样细胞的能力，并寻找最佳诱导时间。方法无菌条件下，收集大鼠股骨骨髓，分离出MSCs进行培养、扩增、纯化。用神经妥乐平（NT）进行诱导。在不同时间用巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色鉴定阳性细胞。结果MSCs经诱导后呈神经元样形态。免疫组化鉴定显示Nestin阳性细胞表达在诱导第3天时最多，为48．20％&#177;5．61％，NSE阳性细胞表达在第5天时最多，为31．50％&#177;7．32％。结论MSCs在体外诱导条件下可经神经前体细胞转化为神经元样细胞，且第5天为最佳诱导时间。     

体外不同诱导条件对人脐血间充质干细胞分化为神经细胞的研究

目的观察体外不同诱导条件对人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的作用,探讨最佳诱导方法。方法取第3代脐血MSCs进行诱导,分为化学诱导剂组、生长因子诱导组、丹参素联合生长因子诱导组。采用免疫细胞化学方法和免疫荧光方法检测诱导前后神经元特异性标志小鼠抗神经元核抗原(NeuN)、兔抗微管蛋白(β-TubulinⅢ)和星形胶质细胞特异性标志神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的变化。结果 MSCs经3种方法诱导后出现类似神经元样细胞的形态改变,伸出长突起。免疫组织化学和免疫荧光方法鉴定显示,诱导后的细胞能特异性表达NeuN和β-TubulinⅢ,而GFAP阳性细胞较少。丹参素联合生长因子诱导组β-TubulinⅢ及NeuN的阳性细胞率均明显高于生长因子诱导组和化学诱导剂组,而GFAP阳性细胞率明显低于生长因子诱导组,差异均有统计学意义。结论丹参素联合表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子在体外可定向诱导人脐血MSCs分化为神经元,诱导效果最佳。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的初步研究

目的探讨体外培养、扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,诱导MSCs向神经元样细胞定向分化。方法取大鼠骨髓,采用贴壁培养筛选法分离MSCs,进行培养扩增,观察其生物学特性;用IBMX诱导MSCs向神经元样细胞分化,并通过细胞免疫化学法鉴定分化细胞。结果大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离,并可在体外大量扩增,经IBMX诱导,MSCs可向神经元样细胞分化,出现胞体和突起,细胞免疫化学染色神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白呈阳性。结论MSCs易分离和培养,体外培养条件下生长良好,可连续传代,诱导剂作用下可分化出神经元样细胞。     

大鼠脑组织匀浆对其BMSCs向神经元样细胞分化的影响

目的:探讨大鼠脑组织匀浆上清对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化的影响.方法:全骨髓培养法从wistar大鼠中分离培养BMSCs,流式细胞仪鉴定,预诱导24h后,分为4组.空白对照组(A组)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/mL组(B组)、bFGF20ng/mL+正常脑匀浆上清100μg/mL组(C组)、bFGF 20ng/mL+损伤脑匀浆上清100μL/mL组(D组),诱导48h至细胞分化.免疫细胞化学染色分别检测各组诱导分化后神经特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果:第4代BMSCs CD29、CD44和CD34的表达率为99.8%、99.7%和2.2%,诱导后的细胞均具有神经细胞形态特征.免疫组化染色结果:NSE在诱导各组(B组、C组、D组)的表达率为44.50%,63.10%和73.30%,MAP-2的表达率为45.70%、65.30%和75.60%,各组均不表达GFAP.结论:大鼠脑组织匀浆上清能提高BMSCs向神经细胞方向分化的阳性率,损伤脑匀浆的作用更强.     

不同补肾法在脑梗死大鼠体内促骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用

目的 探讨不同补肾法在脑梗死大鼠体内对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化的影响.方法 用线栓法制备大鼠大脑中动脉梗塞(MCAO)模型,随机分为空白诱导组、左归丸诱导组、地黄饮子诱导组、右归丸诱导组、维甲酸(RA)诱导组、左归丸联合RA诱导组、右归丸联合RA诱导组、地黄饮子联合RA诱导组,不同补肾法代表方药含药血清孵育BMSCs,移植后7、14 d进行移植细胞神经标志蛋白的检测.结果 诱导BMSCs经静脉移植入大鼠体内后,阳性表达神经细胞的相关蛋白神经元特异性烯醇化酶(NSE)、Nestin及胶质纤维酸性蛋白(GFAP).结论 不同补肾法在脑梗死大鼠体内能够促BMSCs向神经元样细胞分化,且补阴类代表方左归丸和阴阳双补类代表方地黄饮子在体内诱导分化的效果优于补阳类代表方右归丸.     

三七总皂苷对人骨髓间充质干细胞诱导分化后神经元样细胞生长状态的影响

目的 研究三七总皂苷(tPNS)与bFGF联合在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)分化为神经元样细胞过程中的诱导作用及作用剂量.方法 全骨髓贴壁法分离、培养、扩增、纯化hBMSCs,流式细胞仪检测hBMSCs表面CD29、CD44、CD105、CD34分子,测定周期.取第三代hBMSCs,含20%胎牛血清的1 mmol/Lβ-巯基乙醇(BME)预诱导24 h,继而用bFGF(20 ng/mL)标准组、tPNS(1 mg/mL)药物组、20 ng/mL bFGF+低、中、高剂量tPNS(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL)诱导液诱导,设立空白对照组.采用免疫细胞化学法鉴定神经细胞特异性抗原标记神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋-2(MAP-2)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.MTT法检测各组诱导后不同时间点对神经元样细胞活力的影响.结果 成功分离培养hBMSCs,经诱导后大部分hBMSCs分化为神经元样细胞,联合诱导组细胞生长状态及活力较好,阳性细胞NSE、MAP-2比例高于对照组(P<0.05),GFAP表达阴性.结论 tPNS与bFGF联合在体外能有效诱导hBMSCs分化为神经元样细胞,表达神经细胞特异性抗原,保持较好的活力、延长存活时间.     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的观察黄芪注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化的特点。方法使用稀释浓度为200mg／ml的黄芪注射液诱导BMSCs，分别在1、3、6d倒置显微镜观察细胞形态变化，免疫细胞化学方法观察巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白-2（MAP-2）的表达。结果诱导后可见细胞形态发生改变，自胞体长出突起，随诱导时间延长，长出突起的细胞数量增多，突起进一步伸长，部分突起末端呈分叉状，可见网络状连接。免疫细胞化学示：nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阳性细胞在诱导第3天较多，MAP-2阳性细胞在第6天较多。结论黄芪首先诱导BMSCs向神经干细胞分化，然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化，并促进已分化的细胞进一步成熟、老化。     

叶酸诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞的浓度探索

目的 探讨叶酸对骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的最佳浓度.方法 MSCs由正常成年人骨髓经密度梯度离心加贴壁离心获得,取第5代MSCs以1 mmol/L二巯基乙醇(BME)预诱导24 h后,用羟基茴香醚(BHA)、2%二甲基亚砜(DMSO)和3种不同浓度的叶酸诱导分化,采用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶原纤维酸性蛋白GFAP的表达,MTT(四唑盐比色)法检测不同时间段对BMSCs增殖的影响.结果 不同剂量叶酸组分化为NSE阳性神经元样细胞的百分率都较对照组高(P<0.01) ,但以40 mg/L中等浓度的叶酸神经细胞最多,且神经元比例高于其他组.结论 叶酸诱导BMSCs向神经元分化以40 mg/L浓度为最佳.     

大鼠胎血与骨髓间充质干细胞分化能力的体外研究

目的：比较大鼠胎血和骨髓中间充质干细胞（MSC）体外培养过程中的生长特性及体外诱导两者向神经元样细胞分化的异同。方法：采用标准Ficoll-hypague技术分离大鼠胎血骨髓的单个核细胞（MNC），收获MSC传代培养，流式细胞仪检测细胞的免疫表型。β-巯基乙醇、二甲基亚砜、叔丁基对羟基茴香醚诱导MSC向神经元分化，免疫细胞化学法检测其特异性标志巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果：2种MSC细胞形态、免疫表型无明显差异。定向诱导后，2种细胞均表达Nestin、NSE，但GFAP阴性。结论：大鼠胎血和骨髓MSC的细胞形态、生物学特性无明显差别；两者诱导分化为神经元碰细胞的能力无显著差异。胎血应是MSC的又一来源。     

大鼠骨髓基质干细胞诱导分化为肠神经细胞的体外研究

目的探讨不同方法诱导大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)分化为肠神经细胞的可能性,并探索适宜的诱导方法。方法体外培养并鉴定BMSC,流式细胞法检测CD90和CD45。传代至第6代后行神经诱导分化。先以10ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导24h,然后分2组：胶质细胞源神经营养因子(GDNF)组以10ng/ml GDNF,在胎肠培养基(FGCM)条件下诱导10d；维甲酸组以0．5 mmol/L维甲酸、10μmol/L ZnSO_4和FGCM诱导10d。免疫荧光法检测神经特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、蛋白基因产物(PGP9．5)、一氧化氮合酶(nNOS)和血管活性肠肽(VIP)的表达。所得数据行t检验。结果流式细胞检测BMSC呈高表达,其标志为CD90,而不表达造血细胞标志CD45。诱导10d后,GDNF组和维甲酸组均有部分细胞在形态上表现出神经元样改变,免疫荧光染色NSE、NF、PGP9．5、nNOS、VIP阳性,GFAP阴性。GDNF组NF、PGP9．5、nNOS、VIP阳性比例显著高于维甲酸组(75．6％±8．4％比48．5±7．5％；57．7％±6．5％比35．7％±7．2％；46．6％±5．4％比30．5％±6．6％；72．3％±6．7％比40．4％±7．4％；P＜0．01)。结论在体外BMSC可被诱导分化为肠神经样细胞并表达肠神经递质,GDNF在胎肠培养基条件下诱导肠神经样细胞比例高于维甲酸。