TRAIL诱导HBV转染肝癌细胞BEL-7402凋亡的作用及机制研究

目的　研究肝癌细胞BEL- 74 0 2感染HBV前后,TRAIL诱导其凋亡的敏感度变化及作用机制。方法　构建含1.1倍HBV全基因组的真核表达载体pcDNA3 1.1HBV ,转染人肝癌细胞BEL -74 0 2 ,G4 18稳定筛选,建立HBVadr亚型体外转染的细胞模型。原位末端标记(TUNEL)检测TRAIL诱导的凋亡反应,并通过设立TRAIL联合其可溶性受体sDR5 (sDR5与TRAIL结合后,可特异性阻断TRAIL诱导凋亡) ,以证实该凋亡是由TRAIL特异性诱导的。琼脂糖凝胶电泳(DNAladder)检测染色体DNA的断裂情况。流式细胞术、半定量逆转录聚合酶链反应检测HBV感染前后细胞表面TRAIL各受体的表达。双荧光素酶报告基因系统检测抑制凋亡的核转录因子NF κB的活性。结果　成功构建了包含HBV全基因组的真核表达载体pcDNA3 1.1HBV ,转染BEL 74 0 2、经G4 18稳定筛选后得到HBVadr亚型转染的细胞模型BEL 74 0 2 1.1HBV。TRAIL诱导BEL 74 0 2、BEL 74 0 2 pcDNA3及BEL 74 0 2 1.1HBV的凋亡率分别为30 .5 %、2 9.8%和76 % (P <0 .0 1) ;经sDR5特异性阻断后,凋亡率分别为0 .9%、0 .8%和0 .9% ,证明凋亡是由TRAIL特异性诱导的。TRAIL作用2 4h后,琼脂糖凝胶电泳可见BEL- 74 0 2 1.1H-BV较BEL- 74 0 2、BEL 74 0 2 pcDNA3染色体DNA断裂的现象更为明显。无论RNA水平还     

TWEAK及IFN-γ在诱导表达乙肝病毒的HepG2.2.15细胞凋亡中的协同作用

以转染了HBV全基因组、并稳定表达HBV病毒颗粒的HepG2．2．15细胞为细胞模型，研究新型凋亡分子TWEAK对HBV感染细胞的作用机制。MTT法检测TWEAK和IFN-γ对HepG2．2．15细胞的杀伤效应。流式细胞术(FCM)分析TWEAK和IFN-γ作用后，HepG2．2．15细胞的凋亡率及细胞周期变化。HBsAg和HBeAg ELISA检测试剂盒测定TWEAK与IFN-γ作用24小时后，HBV病毒颗粒的分泌表达状况。TWEAK对于HepG2．2．15细胞有较弱的杀伤效应和诱导凋亡效应，但是与IFN-γ联合作用后，HepG2．2．15细胞的凋亡率显著上调，细胞周期阻滞在G0／G1期，并且TWEAK与IFN-γ能够协同抑制HepG2．2．15细胞病毒颗粒的分泌。TWEAK在IFN-γ的参与下，可以诱导HBV相关的HepG2．2．15细胞发生较强烈的凋亡反应，这提示，在HBV感染者体内的炎症反应环境中，TWEAK极有可能通过与炎性因子的协同效应参与对病毒感染细胞的杀伤效应。     

IFN-γ对TRAIL诱导HBV相关性肝癌细胞凋亡的调节作用

目的：以转染了HBV全基因组、并稳定表达HBV病毒颗粒的HepG2.2.15细胞为细胞模型，探讨IFN-γ对新型凋亡分子TRAIL（TNF相关的诱导凋亡配体）诱导凋亡的影响，并初步探索其发生机制。方法：以流式细胞仪检测IFN-γ和TRAIL作用前，HepG2.2.15细胞的凋亡率，分别用流式细胞术和半定量RT－PCR的方法检测IFN-γ用0、6、12和24h后，细胞表面膜结合型TRAIL和TRAIL受体mRNA的表达。用HBsAg和HBeAg ELISA检测试剂盒测定IFN-γ作用0、6、12和24h后，HBV病毒颗粒的分泌表达状况。结果：TRAIL单独作用、IFN-γ单独作用、TRAIL和IFN-γ联合作用后，HepG2.2.15细胞的凋亡率分别为9．12％、5．84％和46．68％，表明IFN-γ可以显著上调TRAIL诱导的细胞凋亡。IFN-γ作用后，细胞表面膜型TRAIL的表达有显著上调，而部分与TRAIL诱导凋亡相关的TRAIL受体的表达也有不同程度的上调，并且IFN-γ可以抑制HepG2.2.15细胞HBV病毒颗粒的分泌。结论：转染HBV全基因组的HepG2.2.15细胞对TRAIL诱导的凋亡相对耐受,而IFN-γ却可以逆转这种耐受，使其变得对TRAIL诱导的凋亡敏感，其发生机制可能是通过IFN-γ上调细胞表面TRAIL及其受体的表达，以及抑制HBV病毒颗粒的分泌实现的。     

HBV转染增强细胞因子上调PD-L表达

目的 研究HBV转染的肝细胞系(HepG2.2.15细胞)在细胞因子作用下能否上调PD-L表达.方法 应用肝细胞系(HepG2细胞和HepG2.2.15细胞)为模型,用IL-4、IFN-α、IFN-γ(终质量浓度均为10 ng/ml,刺激时间为12 h)作用于上述细胞系,采用RT-PCR技术检测细胞因子作用前后PD-L表达情况.结果 无论是否转染HBV,IFN-α和IFN-γ均能诱导肝细胞系(HepG2细胞和HepG2.2.15细胞)PD-L1表达;而IL-4不能诱导PD-L1表达,IL-4、IFN-α、IFN-γ均能诱导转染了HBV的HepG2.2.15细胞PD-L2表达,仅IFN-γ能诱导未转染HBV的HepG2细胞PD-L2表达.结论 IFN-α和IFN-γ有较强诱导肝细胞系(HepG2细胞和HepG2.2.15细胞)PD-L1表达上调的作用,HBV在细胞因子诱导HepG2.2.15细胞PD-L2表达中具有促进作用.     

合成紫花茄皂苷对体外培养肝癌细胞的增殖抑制作用

目的:探讨合成紫花茄皂苷对人肝癌细胞株BEL-7402的增殖抑制及凋亡诱导作用。方法:采用酸性磷酸酶(ACP)法检测细胞增殖抑制率;电镜观测BEL-7402细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:合成紫花茄皂苷对人肝癌BEL-7402细胞有明显的增殖抑制作用,其72h的IC50为6·5μg/ml。皂苷可引起细胞形态的明显改变。细胞经皂苷作用6h和12h后,凋亡率显著增加。结论:合成紫花茄皂苷对人肝癌细胞的增殖抑制呈浓度相关性,可诱导肿瘤细胞凋亡。     

人羊膜上皮细胞上清液对人肝癌BEL-7402细胞的体外抗肿瘤作用

目的探讨人羊膜上皮细胞(h AECs)上清液对体外培养的肝癌细胞系BEL-7402细胞迁移、增殖与凋亡的影响。方法 BEL-7402细胞随机分为5组,其中对照组不加h AECs上清液,其余4组加入体积分数分别为6.25%、12.5%、25%和50%的h AECs上清液作用24 h后,通过划痕实验、MTT试验和流式细胞术检测BEL-7402细胞迁移、增殖和凋亡;Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达量。结果 h AECs上清液能剂量依赖性地抑制BEL-7402细胞迁移、增殖并诱导凋亡(P0.05);25%和50%h AECs上清液组BEL-7402细胞caspase-3和caspase-8蛋白的切割片断蛋白定量明显高于对照组(P0.05)。结论 h AECs上清液对体外培养的BEL-7402细胞具有一定的抗肿瘤作用。     

阻断Sonic Hedgehog信号对不同人肝癌细胞生长的影响

 目的: 研究阻断Sonic Hedgehog (Shh)信号对不同人肝癌细胞生长的影响,探讨阻断Shh信号抑制肝癌细胞生长的机制。方法: RT-PCR法检测Shh信号分子在3株人肝癌细胞(BEL-7402、Huh7和HepG2)中的表达,并检测Shh阻断抗体作用后BEL-7402细胞Shh信号效应分子表达变化;MTT法检测人肝癌细胞增殖活性;流式细胞术检测人肝癌细胞凋亡;Western blot 检测凋亡相关蛋白表达。结果: Shh信号分子在3株人肝癌细胞中均有表达,Shh阻断抗体可以下调Shh信号效应分子patched (Ptch)、Gli1和Gli2的表达;Shh阻断抗体可以抑制3株肝癌细胞生长,增加G₀/G₁期细胞,并诱导细胞凋亡;Shh阻断抗体作用后,BEL-7402细胞pro-caspase-3、pro-caspase-8和pro-caspase-9蛋白表达水平下降,cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9蛋白表达水平升高。结论: 阻断Shh信号可抑制Shh高表达的人肝癌细胞生长,阻滞细胞周期于G₀/G₁期,并诱导肝癌细胞凋亡。     

MiR-122下调Bcl-2蛋白家族增强BEL-7402/FU细胞对氟尿嘧啶的敏感性

目的:探讨MiRNA-122对肝癌耐药细胞株BEL-7402/氟尿嘧啶(fluorouracil,FU)的FU敏感性的影响及其作用机制。方法:构建miR-122及其阴性对照空载体并稳定转染至BEL-7402/FU细胞中,Western免疫印迹检测miR-122转染组(n=3)、阴性空载体转染组(n=3)和未转染组(n=3)中与耐药相关的Bcl-2和Bcl-XL蛋白表达水平。用3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT)]法检测三组细胞对FU敏感性。结果:与未转染组、阴性空载体转染组比较,miR-122转染组Bcl-2和Bcl-XL蛋白表达明显降低(P<0.05)。MTT结果显示:在不同浓度FU处理下,miR-122转染组的细胞抑制率较未转染组和阴性空载体转染组高(P<0.05)。结论:miR-122能特异性地下调Bcl-2和Bcl-XL表达,可增加BEL-7402/FU细胞对FU敏感性。     

含蟾酥胶囊血清诱导人肝癌BEL-7402细胞株凋亡的机制

目的:探讨含蟾酥胶囊血清诱导人肝癌BEL-7402细胞株凋亡的机制.方法:用血清药理学方法,把含不同浓度蟾酥胶囊的血清加入体外培养的人肝癌BEL-7402细胞,分别孵育24、48 h,显微镜下观察细胞形态学改变;MTT比色检测细胞的存活率;流式细胞仪检测细胞的凋亡率;琼脂糖凝胶电泳测定DNA条带;免疫细胞化学显色检测Bcl-2蛋白的表达.结果:实验组部分细胞凋亡,形态学改变;细胞存活率降低,增殖受到抑制;流式细胞仪检测,可见凋亡峰;孵育48 h,琼脂糖凝胶电泳呈梯状条带(DNA Ladder);免疫细胞化学检测,Bcl-2表达明显降低.结论:蟾酥胶囊诱导人肝癌细胞BEL-7402株凋亡的作用机制可能与下调Bcl-2蛋白表达有关.     

胡椒醛缩氨基均三唑席夫碱对人肝癌细胞分化和凋亡的影响

目的 观察胡椒醛缩氨基均三唑席夫碱对人肝癌细胞BEL-7402的诱导分化和凋亡作用.方法 用不同浓度的1-(3,4-二氧亚甲基)苯甲亚氨基-2-吡啶-3-基-5-甲硫基-[1,2,4]三唑(LH-36)与BEL-7402细胞体外培养.MTT法检测细胞增殖和LH-36对细胞增殖的抑制作用.用Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡变化.免疫细胞化学检测细胞内激活型Caspase-3表达.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测细胞甲胎蛋白(α-FP)和白蛋白(Alb)mRNA表达,以了解细胞分化状态.蛋白质免疫印迹分析P53的表达.可见光法测定超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力.结果 LH-36在0.1 μmol/L～10 μmol/L的浓度范围能抑制细胞增殖,且抑制率随浓度和时间的增加而增高.0.1 μmol/L和1.0 μmol/L的LH-36使细胞α-FP mRNA表达量明显下降,Alb表达量增高,P53的蛋白表达明显增加,SOD活性升高(P＜0.01),而CAT活性降低,差异有显著性(P＜0.01,P＜0.05).药物浓度在10 μmol/L作用48 h,BEL-7402细胞皱缩,呈现凋亡各期改变,Caspase-3阳性细胞明显增加,细胞凋亡率显著高于对照组(P＜0.05).结论 胡椒醛缩氨基均三唑席夫碱对人肝癌BEL-7402细胞具有抗增殖、促分化和凋亡作用,作用可能与过氧化氢的氧化损伤作用有关.     

TLR4通路对polyI:C诱导肝癌细胞凋亡的影响

目的:研究TLR4信号通路活化对polyI:C诱导人肝癌细胞系H7402凋亡的影响,并分析其可能的作用机制。方法:用TLR4激动剂LPS处理H7402细胞24 h后,转染polyI:C刺激24 h,然后利用流式细胞术检测细胞凋亡,荧光定量PCR检测凋亡基因及胞内RNA模式识别受体TLR3、MDA5、RIG-I和LGP2的表达,Western blot检测识别受体的蛋白表达水平。结果:LPS预处理,减弱了polyI:C诱导H7402细胞凋亡的作用。同时,促凋亡基因Noxa的表达水平降低。在此过程中polyI:C的胞内识别受体RIG-I、MDA5的基因和蛋白水平表达下调。结论:LPS可能通过降低H7402细胞内dsRNA识别受体的表达,抑制了polyI:C诱导H7402细胞凋亡的作用。     

肝癌的细胞凋亡及其紫杉醇的诱导作用研究

目的研究肝癌发生过程中原位细胞凋亡活动以及紫杉醇对肝癌细胞系BEL-7404诱导细胞凋亡的作用。方法用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测了肝细胞癌的细胞凋亡,用紫杉醇处理培养细胞BEL-7404、显微镜下进行观察并且进行琼脂糖电泳。结果癌旁组织的原位凋亡细胞增多,紫杉醇处理肝癌细胞可以诱导细胞产生典型的细胞凋亡形态学变化。DNA发生断裂,琼脂糖电泳产生梯形条带。结论在体内肿瘤细胞凋亡降低,细胞分裂可能加快,肿瘤发生。在癌旁组织中细胞凋亡增多,在体外紫杉醇可以诱导肝癌细胞系BEL-7404凋亡。     

Artemis对人肝癌细胞系BEL-7402/5FU DNA损伤的影响

目的探讨转染sh Artemis干扰质粒对人肝癌细胞BEL-7402/5FU DNA损伤的影响。方法将人肝癌细胞分为正常对照组、脂质体对照组、空质粒对照组和转染sh Artemis干扰质粒实验组(sh Artemis实验组);建立DNA损伤模型,分别用0.625、1.25、2.5、5.0和10.0μg/m L的丝裂霉素C作用BEL-7402/5FU细胞24和48 h,MTT法检测细胞活性,Western blot观察磷酸化组蛋白H_2AX(γ-H_2AX)的表达;转染Artemis干扰质粒,检测Artemis、γ-H_2AX表达;彗星实验检测DNA的损伤。结果 0.625、1.25、2.5、5.0和10.0μg/m L的丝裂霉素C作用48h后肝癌细胞活力明显下降(P0.05);丝裂霉素C刺激细胞48 h后,γ-H_2AX的表达量随着药物浓度的增加而增加;转染sh Artemis干扰质粒后,γ-H_2AX的表达量较正常对照组增加(P0.05);sh Artemis实验组较正常对照组拖尾DNA量增加(P0.05)。结论丝裂霉素C能够诱导肝癌细胞损伤;转染sh Artemis干扰质粒促进丝裂霉素C诱导的人肝癌细胞BEL-7402/5FU DNA损伤。     

蟾酥胶囊诱导人肝癌细胞凋亡的研究

目的观察蟾酥胶囊对人肝癌细胞凋亡的诱导作用.方法采用中药血清药理学方法,选择不同浓度含药血清作为实验组,分别与人肝癌BEL-7402细胞共同孵育24h、48h,流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞周期变化及Apo2.7蛋白的阳性表达率;均与10%无药血清组做对照.结果流式细胞仪检测可见,各实验组细胞G1、S期下降,G2/M期升高,产生凋亡峰（sub-G1期）,细胞凋亡率与作用时间、含药血清浓度有一定的时效和量效关系.结论蟾酥胶囊含药血清可以诱导人肝癌细胞BEL-7402凋亡,提示蟾酥胶囊是一种有潜力的治疗肝癌药物.     

双特异性重组腺病毒Ad-HT对肝癌细胞的体内、外抑制效应

目的:探讨双特异性抗肿瘤重组腺病毒Ad-HT对肝癌细胞的体内、外抑制作用和作用方式。方法:运用噻唑兰法检测重组腺病毒Ad-HT对BEL-7402细胞的抑制作用;应用AO/EB染色法、DAPI染色法、Annexin V检测、Caspase检测、线粒体膜电位检测和活性氧检测等多种方法分析Ad-HT对BEL-7402细胞抑制作用的方式和途径;构建C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,瘤内注射重组腺病毒,通过非放射性乳酸脱氢酶细胞毒性检测方法,检测NK活性、CTL活性,利用酶联免疫吸附方法检测IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ等细胞因子水平,探讨Ad-HT对体内实体肿瘤的抑制作用和对免疫系统的影响。结果:Ad-HT能够抑制BEL-7402细胞生长,且其作用具有一定时效和剂效关系趋势;Ad-HT感染导致BEL-7402细胞磷脂膜外翻、细胞核皱缩、细胞膜通透性增加、Caspase酶活性增强、线粒体膜电位下降和活性氧水平升高;Ad-HT实验组模型动物平均期在30天以上,显著高于对照组;另外,Ad-HT具有增强NK和CTL活性,上调IL-2和IFN-γ等细胞因子水平的功能。结论:Ad-HT能够通过诱导细胞凋亡,抑制BEL-7402肿瘤细胞增殖,而这种抑制作用可能通过线粒体途径实现。另外,Ad-HT能够有效延长模型动物平均生存期,活化免疫功能细胞,并使免疫趋向Th1优势。     

含蟾酥胶囊血清诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡并下调Bcl-2的表达

目的 探讨含蟾酥胶囊血清诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡的作用机制.方法 用中药血清药理学方法,不同浓度含药血清加入体外培养的人肝癌BEL-7402细胞,分别孵育24h、48h,显微镜下观察细胞形态学变化,MTT比色法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,琼脂糖凝胶电泳测定DNA梯状条带,免疫细胞化学染色检测Bc...     

蟾酥胶囊含药血清诱导人肝癌细胞凋亡的检测

目的观察蟾酥胶囊含药血清对人肝癌BEL-7402细胞凋亡的诱导作用。方法采用中药血清药理学方法,选择不同浓度含药血清作为实验组,分别与人肝癌BEL-7402细胞共同孵育24h、48h,流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞周期变化及Ap02．7蛋白的阳性表达率;琼脂糖凝胶电泳测定DNA Ladder;均与10％无药血清组做对照。结果流式细胞仪检测可见,各实验组细胞G、S期下降,Q／M期升高,产生凋亡峰(sub-G1期),Apo2．7蛋白表达的阳性峰明显增高,细胞凋亡率与作用时间、含药血清浓度有一定的时效和量效关系;孵育48h,可见DNA Ladder出现。结论蟾酥胶囊含药血清可以诱导人肝癌细胞BEL-7402凋亡,提示蟾酥胶囊是一种有潜力的治疗肝癌药物。     

TCRVβ8.4 基因转染人PBMC对肝癌细胞杀伤活性的研究

目的：探讨转染hTCRVβ8.4基因后健康人PBMC的免疫学特性及其对起源于乙肝病毒的肝癌细胞株BEL-7402杀伤活性的改变。方法：将hTCRVβ8.4基因克隆至真核表达载体pcDNA3．1(-)上，并转染健康人PBMC，流式细胞术检测转染后PBMC中TCRVβ8.4蛋白表达，乳酸脱氢酶释放活性法检测重组质粒转染后PBMC对癌细胞BEL-7402的杀伤活性。结果：TCRVβ8.4在基因转染后淋巴细胞中表达显著增高；与BEL-7402共培养后，基因转染组CD3^ TCRVβ8.4T细胞增殖明显高于对照组；BEL-7402刺激后免疫细胞活化，表达CD122的细胞数量增多，表达CD19(B细胞活化的标志)的B细胞增加；重组质粒转染后，PBMC对肝癌细胞BEL-7402杀伤活性增强；透射电镜观察发现，重组质粒转染的PBMC使BEL-7402凋亡。结论：hTCRVβ8.4基因修饰可显著增强淋巴细胞在超抗原BEL-7402刺激下的增殖及免疫细胞活化，基因修饰后T淋巴细胞杀伤活性明显增强。     

HLA-A2限制性Survivin点突变肽诱导特异性抗肝癌CTL反应

目的 探讨HLA-A2限制性Survivin点突变抗原肽体外诱导CTLs的抗肝癌作用.方法 生物信息学软件BIMAS和SYFPEITHI用来鉴定点突变的HLA-A2限制性Survivin抗原九肽;流式细胞术检测突变肽与HLA-A2分子结合效率;肽体外刺激肝癌患者腹水来源的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)诱导反应性CTLs,用流式细胞术及ELISA检测反应性CTLs释放IFN-γ情况;肽诱导的CTLs与肝癌细胞系HepG2及BEL-7402共孵育,CytoTox 96(R)非放射性细胞毒性检测法检测对肿瘤细胞的裂解情况,倒置相差显微镜观察肝癌细胞形态学变化.结果 生物信息学分析筛选出与MHC分子结合效率评分显著提高的点突变Survivin抗原九肽Sur79M2 (KMSSGCAFL),流式细胞术检测证实负载Sur79M2的T2细胞,HLA-A2表达率显著提高,经Sur79M2体外刺激诱导的CTLs与靶细胞共孵育后能释放较高水平的IFN-γ,Sur79M2诱导的CTLs能通过HLA-A2限制性机制有效杀伤肝癌细胞系HepG2,对HLA-A2阴性的BEL-7402细胞无明显杀伤作用.结论 点突变肽Sur79M2能在体外诱导反应性CTLs产生,该CTLs能以HLA-A2限制性方式有效杀伤肝癌细胞系.     

三氧化二砷对肝癌细胞生长抑制作用差异性探讨

目的:观察三氧化二砷对肝癌SMMC-7721和BEL-7402细胞生长抑制作用差异性并且探讨其可能的作用机理。方法: 应用细胞培养和台盼蓝拒染法观察不同时间和不同浓度的三氧化二砷对肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7402细胞生长的抑制作用,比较生长抑制率的差异并用谷胱甘肽检测试剂盒测定两种肝癌细胞内谷胱甘肽(GSH)的含量。结果: 三氧化二砷浓度为0.50 μmol/L、作用时间为24 h可显著抑制肝癌细胞系BEL-7402的生长,抑制作用呈时间、剂量依赖性;对SMMC-7721细胞,三氧化二砷浓度为2.00 μmol/L、作用时间为24 h才出现抑制细胞生长作用,二者的生长抑制率存在显著差异,0.25-2.00 μmol/L As₂O₃作用72 h后,BEL-7402细胞的生长抑制率均高于SMMC-7721细胞(P＜0.05)。检测SMMC-7721和BEL-7402细胞内GSH含量分别为(50.8±5.2)μmol/g protein和(18.7±1.4)μmol/g protein,存在明显差异。 结论:三氧化二砷抑制肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7402的生长存在显著的差异;BEL-7402细胞对三氧化二砷非常敏感性,可能与其细胞内谷胱甘肽含量较低,细胞的氧化还原解毒系统不足有关。