miR-92a-3p靶向调控PTEN对神经母细胞瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的:探讨微小RNA-92a-3p （micro RNA-92a-3p, miR-92a-3p）靶向调控PTEN对神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法:采用miR-92a-3p mimics及其抑制基因（inhibitor）分别转染至SH-SY5Y细胞,根据实验需要分为miR...     

MiR-483-3P下调RIOK3蛋白表达促进神经母细胞瘤的增殖和迁移

目的探讨microRNA-483-3P(miR-483-3P)对神经母细胞瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力的影响,预测并验证miR-483-3P的靶基因及其对靶基因的影响。方法 miRNA微阵列芯片结果发现miR-483-3P在神经母细胞瘤中表达上调,差异倍数显著,并居于差异表达miRNA的首位。利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将化学合成的miR-483-3P inhibitor、miR-483-3P inhibitor的阴性对照序列分别瞬时转染人人神经母细胞瘤SH-SY-5Y细胞株中,RT-qPCR技术检测各组中miR-483-3P的表达水平,CCK-8法检测各组癌细胞的增殖情况,Transwell小室实验检测各组癌细胞的体外侵袭和迁移能力。利用生物信息学软件预测miR-483-3P的靶基因并用荧光素酶报告基因检测实验、Western blot实验加以验证。结果与癌旁正常组织相比,miR-483-3P在神经母细胞瘤中高表达(P0.01);与阴性对照组相比,癌细胞转染miR-483-3P inhibitor后,miR-483-3P表达显著下调(P0.01),细胞的增殖情况和体外迁移能力均降低(P0.05)。生物信息学软件预测出RIOK3是miR-483-3P的靶基因之一,当细胞转染了miR-483-3P inhibitor后荧光酶活性升高(P0.01)。与阴性对照组相比,当细胞转染了miR-483-3P inhibitor后在蛋白质水平RIOK3表达升高(P0.01)。结论.RIOK3是miR-483-3P的靶基因之一,miR-483-3P能下调RIOK3的表达并显著促进神经母细胞瘤细胞的增殖和体外迁移。     

微小RNA-17-5p在小儿肾病综合征发病中的作用及其机制研究

目的 分析微小RNA-17-5p（miR-17-5p）在小儿肾病综合征（NS）发病中的意义及其通过激活素A（ActA）/Smads通路对肾足细胞凋亡的影响。方法 选取2018年3月至2019年3月收治的55例NS患儿为NS组,另选取50例同期体检的健康儿童为正常对照组,比较两组外周血miR-17-5p表达情况。培养人肾足细胞株,分别转染含miR-17-5p反义寡核苷酸重组质粒（抑制组）、含无意义随机序列的对照载体（阴性对照组）,未处理的人肾足细胞为空白组。比较各组细胞凋亡情况,以及转染后细胞miR-17-5p、ActA mRNA、Smads mRNA和相关蛋白表达情况。结果 NS组外周血miR-17-5p水平高于正常对照组（P < 0.001）。与空白组和阴性对照组比较,抑制组细胞凋亡率、miR-17-5p相对表达量更低,ActA、Smad2、Smad3三者的mRNA及蛋白相对表达量更高（P < 0.001）。结论 miR-17-5p在小儿NS外周血的含量升高,低表达miR-17-5p能抑制人肾足细胞的凋亡,其机制可能与上调ActA、Smad2、Smad3三者的mRNA及蛋白表达有关。     

微小RNA-17-5p在小儿肾病综合征发病中的作用及其机制研究

目的 分析微小RNA-17-5p（miR-17-5p）在小儿肾病综合征（NS）发病中的意义及其通过激活素A（ActA）/Smads通路对肾足细胞凋亡的影响。方法 选取2018年3月至2019年3月收治的55例NS患儿为NS组,另选取50例同期体检的健康儿童为正常对照组,比较两组外周血miR-17-5p表达情况。培养人肾足细胞株,分别转染含miR-17-5p反义寡核苷酸重组质粒（抑制组）、含无意义随机序列的对照载体（阴性对照组）,未处理的人肾足细胞为空白组。比较各组细胞凋亡情况,以及转染后细胞miR-17-5p、ActA mRNA、Smads mRNA和相关蛋白表达情况。结果 NS组外周血miR-17-5p水平高于正常对照组（P < 0.001）。与空白组和阴性对照组比较,抑制组细胞凋亡率、miR-17-5p相对表达量更低,ActA、Smad2、Smad3三者的mRNA及蛋白相对表达量更高（P < 0.001）。结论 miR-17-5p在小儿NS外周血的含量升高,低表达miR-17-5p能抑制人肾足细胞的凋亡,其机制可能与上调ActA、Smad2、Smad3三者的mRNA及蛋白表达有关。     

耐药性癫痫患儿外周血microRNAs的表达差异分析北大核心CSCD

目的研究耐药性癫痫患儿外周血microRNAs(miRNAs)的表达,为早期识别儿童耐药性癫痫寻找有诊断价值的生物标志物。方法回顾性研究。收集2018年1月至2019年6月在郑州大学第一附属医院儿科神经专科门诊的癫痫患儿组成的耐药性癫痫组(R组)、药物反应性癫痫组(F组)和同期儿童保健门诊体检健康的儿童组成的健康对照组(J组)的外周全血标本各5例,采用高通量测序法检测每个标本miRNAs的表达;以相同条件再次收集R′组(5例)、F′组(7例)和J′组(6例)儿童的外周全血标本,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)验证11个候选miRNAs在3组中的表达;受试者工作特征曲线(ROC)分析7个目标miRNAs区分耐药性癫痫和药物反应性癫痫患儿的功效,在线数据库预测并筛选7个目标miRNAs的靶基因,并对候选靶基因进行基因组百科全书(KEGG)和基因功能(GO)分析。3组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。结果与F组比较,R组共68个差异表达miRNAs,其中22个miRNAs表达上调,46个miRNAs表达下调。qPCR结果显示,11个候选miRNAs中有7个(let-7f、miR-99a-5p、miR-99b-5p、miR-125a-5p、miR-125b-5p、miR-142-5p、miR-100)表达和高通量测序结果一致。ROC曲线分析发现,当miR-99a-5p、miR-99b-5p、miR-125a-5p、miR-125b-5p、miR-142-5p、miR-100的临界值分别大于0.56、1.00、3.17、2.24、2.09、0.59时,这些miRNAs均有较高的曲线下面积(AUC)(≥0.871)、敏感性(≥80.0%)及特异性(≥85.7%),有望成为诊断儿童耐药性癫痫的生物学标志物,其中miR-125b-5p诊断耐药性癫痫最优。生物信息学分析发现miR-125b-5p可能参与调控的信号通路有缺氧诱导因子-1信号通路、胰岛素信号通路、调控干细胞多能性信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、鞘磷脂信号通路、神经营养蛋白信号通路、哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白信号通路。结论耐药性癫痫患儿外周全血中miRNAs的表达谱和药物反应性癫痫患儿比较存在明显差异,miR-125b-5p有望成为诊断儿童耐药性癫痫的生物学标志物。     

呼吸道合胞病毒感染对气道上皮细胞表皮生长因子受体、紧密连接相关蛋白及黏蛋白表达的影响

目的 探讨呼吸道合胞病毒（RSV）感染气道上皮细胞后对表皮生长因子受体（EGFR）、紧密连接相关蛋白occludin及E-cadherin、黏蛋白MUC5AC表达的影响,并探讨可能的机制。方法 体外实验分两组,以人气道黏液上皮细胞NCI-H292细胞为研究对象,紫外线下灭活的RSV加入NCI-H292细胞培养基中作为对照组,迅速解冻的RSV感染NCI-H292细胞为RSV感染组。48 h后通过Western blot法检测occludin、E-cadherin、磷酸化EGFR（p-EGFR）及EGFR的蛋白表达水平;采用细胞免疫荧光技术观察两组细胞occludin、E-cadherin的分布及表达;采用RT-PCR法检测两组MUC5AC mRNA的表达。结果 RSV感染组occludin、E-cadherin的蛋白表达水平较对照组下降（P < 0.05）。RSV感染组p-EGFR及EGFR蛋白的表达水平较对照组升高（P < 0.05）。RSV感染组MUC5AC mRNA表达水平较对照组增加（P < 0.05）。结论 RSV可破坏气道上皮细胞间的紧密连接,促进黏蛋白的分泌,影响气道的屏障功能。EGFR的磷酸化在上述过程中起重要作用。     

TGFBR1和FGF9蛋白参与miRNA-140-5p调控肾母细胞瘤细胞的增殖过程

目的 本研究拟探讨rniRNA-140-5p在肾母细胞瘤增殖过程中的调控作用以及TGF-BR1和FGF9蛋白参与此过程的作用机制.方法 采用miRNA芯片技术分析肾母细胞瘤患儿肿瘤组织和瘤旁正常组织的miRNA表达谱,结合生物信息学预测和文献报道,选取表达差异显著的miR-NA-140-5p作为研究对象,扩大样本进行Real-time PCR验证;MTS方法检测miRNA-140-5p对细胞增殖率的影响;双荧光素酶实验验证miRNA-140-5p的直接下游靶基因;Western-blot法检测TGF-BR1蛋白表达;ELISA法检测细胞上清中FGF9蛋白表达.结果发现与瘤旁组织相比,miRNA-140-5p在肾母细胞瘤组织和瘤旁正常组织的相对表达量分别为1.69±0.83和6.37±3.25,肾母细胞瘤组miRNA-140-5p的表达量明显降低(P＜0.05).在肾母细胞瘤细胞株G401及SK-NEP-1中,发现过表达miRNA-140-5p可有效降低G401及SK-NEP-1的增殖率,将miRNA无关序列(miRNA-con)转染组细胞增殖率设为100％,与其相比,转染miRNA-140-5p的G401细胞组的增殖率为(87±15)％比(100±20)％,SK-NEP-1细胞组为(91±12)％比(100±9)％,组间比较,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).利用生物信息学软件对miRNA-140-5p直接下游靶基因进行预测,结合肾母细胞瘤相关基因,选择TGFBR1和FGF9基因为miRNA-140-5p的直接下游靶基因;通过双荧光素酶实验证实miRNA-140-5p可直接靶向TGFBR1和FGF9基因.将miRNA-con转染组TGFBR1蛋白表达量设为1,与其相比,过表达miRNA-140-5p的G401及SK-NEP-1细胞内,TGFBR1蛋白表达量降低(G401细胞降为0.67;SK-NEP-1细胞降为0.87)(P＜0.05).与miRNA-con转染对照组相比,G401及SK-NEP-1细胞上清中FGF9蛋白表达量下降,G401组为(478.66±66.32) pg/ml比(535.64±78.53) pg/ml,SK-NEP-1细胞组为(486.57±71.01)pg/ml比(601.26±77.68) pg/ml,组间比较,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论 患儿肾母细胞瘤中miRNA-140-5p表达量低于瘤旁正常组织,miRNA-140-5p影响肾母细胞瘤细胞的增殖,TGFBR1和FGF9蛋白可能参与了miRNA-140-5p调控肾母细胞瘤细胞增殖的过程.     

MiR-124-1促进大鼠骨髓间充质干细胞神经分化的实验研究

目的：探讨miR-124-1在大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）神经分化中的作用。方法：构建大鼠miR-124-1慢病毒载体及Anti-rno-miR-124* Inhibitor载体,体外感染大鼠MSCs,筛选最适感染复数（MOI）。实验分为对照组（未行感/转染组）、miR-124-1+组（感染miR-124-1慢病毒）及miR-124-1-组（转染Anti-rno-miR-124* Inhibitor）。采用β-巯基乙醇诱导MSCs分化为神经细胞。倒置荧光显微镜下观察感染后荧光表达情况,MTT法检测感/转染后各组细胞存活率;免疫细胞化学法、RT-PCR法、Western blot法检测各组诱导6 d后神经细胞标记物β3微管蛋白（β3 tubulin）、神经微管结合蛋白（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达变化。结果：倒置荧光显微镜下观察大鼠miR-124-1慢病毒感染成功,MOI值为30。miR-124-1+组慢病毒载体感染MSCs 2 d后,实时定量PCR显示miR-124-1的表达显著上调（P<0.01）;Anti-rno-miR-124* Inhibitor载体转染24 h后,细胞存活率下降,实时荧光定量PCR显示转染后miR-124-1的表达显著下降（P<0.01）。β-巯基乙醇可诱导MSCs分化为神经细胞,miR-124-1+组诱导6 d后细胞的β3 tubulin、MAP-2表达率显著高于其他两组（P<0.01）,miR-124-1-组β3 tubulin、MAP-2的表达率显著低于对照组（P<0.01）;各组GFAP表达率均较低（<1%）。结论：miR-124可能促进大鼠MSCs的神经分化。     

脓毒症患儿血浆微RNA表达及其与炎症细胞因子的相关性北大核心CSCD

目的探讨儿童脓毒症患者血浆微RNA（miRNA）的表达及其与炎症细胞因子的相关性和临床意义。方法选取2012年4月至2013年3月深圳市儿童医院儿童重症监护病房（PICU）住院的40例脓毒症患儿为研究对象,其中男27例、女13例,中位年龄0．75（0．52,1．90）岁,其中严重脓毒症16例。选取20例手术后全身性炎症反应综合征（SIRS）患儿和15名健康儿童分别作为SIRS组和对照组,通过实时荧光定量PCR（qRT—PCR）方法检测血浆miR-21、miR-125b、miR-132、miR-146a、miR-155、miR-223表达量。受试者工作特征曲线（ROC）评价表达差异的血浆miRNA、降钙素原（PCT）和c反应蛋白（CRP）等指标对脓毒症的预测价值。利用流式液相多重蛋白定量技术（CBA）检测患儿血浆肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-10水平。正态分布的多组计量资料采用单因素方差分析,以LSD-t检验进行组间两两比较。非正态分布的资料多组间比较采用Kmskal—Wallis日检验,两组问采用Mann—WhitneyU检验。结果各组间年龄、性别差异均无统计学意义,具有可比性。各组血浆miR-21、miR-12513、miR-132、miR-155表达水平差异均无统计学意义（均P〉0．05）。脓毒症组miR-146a、miR-223表达水平均高于SIRS组和对照组[（5．7±3．5）×10^-5比（2．4±1．6）×10^-5和（2．6±1．2）×10^-5,（12．5±7．7）×10^-4比（8．3±3．4）×10^-4和（5．3±2．2）×10^-4,均P〈0．01],SIRS组miR-223水平高于对照组（P〈0．01）。严重脓毒症组miR-146a表达水平较-般脓毒症组高[（7．1±3．3）×10^-5比（4．6±2．6）×10^-5,P〈0．01]。脓毒症组和SIRS组CRP、PCT水平均高于对照组,脓毒症组PCT高于SIRS组（均P〈0．05）。miR-146a、miR-223和PCT、CRP预测脓毒症的ROE曲线下面积（AUC）分别为0．815（95％C1：0．708-0．922）,0．678（95％CI：0．537～0．818）,0．706（95％CI：0．571～0．842）和0．588（95％CI：0．427～0．748）。脓毒症组血浆IL-10、IL-10／TNF—α水平均高于SIRS组和对照组（均P〈0．01）,且IL-10、IL-10／TNF-α和miR-146a、miR-223水平均呈正相关（r=0．545、0．305和0．562、0．373,P=0．000、0．008和0．000、0．001）。结论脓毒症患儿血浆miR-146a、miR-223表达上调,与IL—10、IL-10／TNF—α水平正相关,有望作为脓毒症早期诊断和判断病情严重程度的标志物。     

RNA干扰趋化因子受体4基因表达对神经母细胞瘤体外侵袭能力的影响

目的 构建趋化因子受体4(CXCR4)小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,研究其对体外神经母细胞瘤侵袭能力的影响.方法 选择CXCR4高表达的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系,设计合成人CXCR4基因不同靶点的能编码siRNA的3条双链DNA序列,克隆到真核表达载体pSilencerTMneo中构建siRNA表达载体,体外脂质体介导转染SH-SY5Y细胞,用半定量RT-PCR分析CXCR4基因mRNA的变化,用免疫组织化学和Western blot分析CXCR4蛋白表达,Transwell小室检测细胞的侵袭能力.结果 成功构建了CXCR4-siRNA表达载体,转染后半定量RT-PCR检测神经母细胞瘤细胞CXCR4 mRNA丰度分别为siR1转染组0.32±0.09、siR2转染组0.35±0.13和siR3转染组0.33±0.11,相对于对照组0.58±0.13表达下降(P＜0.05);转染后免疫组化检测神经母细胞瘤细胞CXCR4的蛋白表达分别为siR1转染组75.98±4.81、siR2转染组75.52±3.95和siR3转染组76.35±6.51,相对于对照组92.196±3.89表达下降(P＜0.01);转染后Western b1ot检测神经母细胞瘤细胞CXCR4的蛋白表达分别为siR1转染组0.1103±0.0023、siR2转染组0.1203±0.015和siR3转染组0.1308±0.0018,相对于对照组0.4832±0.0012表达下降(P＜0.01);且转染后神经母细胞瘤细胞侵袭能力较对照组53.11±3.72降低(P＜0.05),siR1转染组为25.48±2.81、siR2转染组为30.89±2.77、siR3转染组为18.83±1.79.结论 CXCR4-siRNA表达载体通过降低CXCR4基因的蛋白表达能显著抑制神经母细胞瘤细胞的体外侵袭能力,有望为神经母细胞瘤的基因治疗开辟新途径.

Abstract：

Objective To explore the effect of silencing chemokine receptor type 4 (CXCR4) by siRNA on the invasion capability of neuroblastoma cell line SH-SY5Y in vitro. Methods Three siRNAs targeting CXCR4 were chemically synthesized and transfected into SH-SY5Y cells. The transfection efficiency was observed under fluorescence microscope. CXCR4 expression at mRNA and protein levels were detected by semi-quantitative RT-PCR and Western blotting. The invasion capability of the cells was evaluated by Boyden Chamber in vitro. Results Compared with control groups, after the SH-SY5Y cells being transfeeted with the three CXCR4 targeting siRNAs, CXCR4 mRNA in transfected cells significantly decreased (0. 32 ± 0. 09, 0. 35 ± 0. 13 and 0. 33 ± 0. 11 vs 0. 58 ± 0. 13, P＜0. 05 ), CXCR4 protein detected by immunohistochemistry was decreased (75. 98 ± 4. 81, 75. 52 ± 3. 95and 76. 35 ± 6. 51 vs 92. 196 ± 3. 89, P＜0. 01 ), CXCR4 protein detected by Western blotting was also decreased (0. 1103 ± 0. 0023, 0. 1203 ± 0. 0015 and 0. 1308 ± 0. 0018 vs 0. 4832 ± 0. 0012, P＜0. 01 ).The invasion capability of the SH-SY5Y cells was decreased 48 hours after the cells were transfected (25.48±2.81, 30.89±2.77 and 18.83± 1.79 vs 53. 11 ±3.72, P＜0.05). Conclusions Silencing CXCR4 by siRNA decreases the invasion capability of SH-SY5Y cells.     

SNHG7-miR-653-5p-STAT2反馈通路在神经母细胞瘤进展中的调节作用研究CSCD

目的研究lncRNA SNHG7在神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)进展中的作用,以及SNHG7-miR-653-5p-STAT2反馈通路在神经母细胞瘤进展中的调节作用。方法从青岛大学附属医院收治的NB患儿体内获得92对NB组织及相邻非肿瘤组织。采用qRT-PCR检测SNHG7在神经母细胞瘤肿瘤组织及细胞中的表达情况。采用Kaplan-Meier分析神经母细胞瘤患儿的总体存活率。采用比色法(MTT法)和集落形成法检测SNHG7对SK-N-SH和SH-SY5Y细胞的作用。采用Transwell侵袭及迁移试验检测SK-N-SH和SH-SY5Y细胞的侵袭和迁移能力。采用荧光素酶检测miR-653-5p和SNHG7、STAT2之间的作用。采用RIP测定及RNA下拉测定检验SNHG7和miR-653-5p在NB中的相对表达情况。采用Spearman相关分析探究SNHG7与miR-653-5p、STAT2的相关性。结果qRT-PCR显示,92对NB组织及相邻非肿瘤组织中,肿瘤组织(n=53)中SNHG7的表达量高于非肿瘤组织(n=39)。SNHG7高表达的NB患儿(n=53)总生存期随月份的增加而逐渐降低,SNHG7低表达的NB患儿(n=39)总生存期随月份的增加也逐渐降低,两组差异有统计学意义(P=0.004)。细胞功能试验:①MTT法和集落形成法检测结果显示,SNHG7的下调对SK-N-SH和SH-SY5Y细胞的存活和增殖有明显抑制作用;②Transwell试验检测结果显示,敲低SNHG7可明显抑制SK-N-SH和SH-SY5Y细胞的细胞迁移和侵袭能力(P<0.05);③荧光素酶检测显示,miR-653-5p能降低SNHG7-WT(野生型)的荧光素酶活性,且miR-653-5p与STAT2-WT(野生型)之间存在特异性的相互作用。Spearman相关分析显示:①NB组织中SNHG7与miR-653-5p表达水平呈负相关(r=-0.281,P=0.007);②STAT2的表达量与NB组织中miR-653-5p表达水平呈负相关(r=-0.295,P=0.004),STAT2的表达量与NB组织中SNHG7表达水平呈正相关(r=0.296,P=0.004)。结论SNHG7通过miR-653-5p/STAT2通路促使NB进展,这为NB提供了一个新的治疗靶点和预测预后的生物标志物。     

miR-876-5p通过靶向FOXM1对儿童髓母细胞瘤细胞增殖的影响

目的:探讨微小核糖核酸876-5p(micro ribonucleic acid-876-5p, miR-876-5p）通过靶向叉头盒蛋白M1(forkhead box M1,FOXM1）对儿童髓母细胞瘤（medulloblastoma ,MB）细胞增殖的影响。方法:收集2018年1月至2020年10月在湖南省儿童医院...     

microRNA-145对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞上皮间充质转化的影响

目的研究micro RNA-145(miR-145)对转化生长因子(TGF)-β1诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)上皮间充质转化(EMT)的影响。方法人工合成miR-145基因序列,构建真核重组质粒p CMVmiR-145。以未处理HK-2细胞为对照组;以TGF-β1处理HK-2细胞为TGF-β1组;以p CMV-myc空白质粒转染后经TGF-β1处理HK-2细胞为TGF-β1空白质粒组;以p CMV-miR-145质粒转染后经TGF-β1处理HK-2细胞为TGF-β1+miR-145组。采用实时荧光定量PCR检测miR-145表达。采用Western blot检测TGF-β/Smad信号传导蛋白TGF-β1、Smad3、Smad2/3、p-Smad2/3,以及EMT生物标记物蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)和I型胶原蛋白(ColⅠ)的表达水平。采用ELISA法检测培养细胞上清液中FN和Col I的含量。结果miR-145表达质粒构建成功,重组质粒有效转染TGF-β1诱导HK-2细胞。与对照组比较,TGF-β1+miR-145组细胞中miR-145表达上调(P0.01);与对照组和TGF-β1+miR-145组比较,TGF-β1组和TGF-β1空白质粒组细胞中miR-145表达均下降(P0.01)。与TGF-β1组和TGF-β1空白质粒组比较,TGF-β1+miR-145组细胞内TGF-β1、Smad3、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表达量减少(P0.05);α-SMA、FN、ColⅠ蛋白表达亦明显减少(P0.05);TGF-β1+miR-145组培养液上清中FN、ColⅠ含量减少(P0.05)。结论 miR-145参与TGF-β1处理HK-2细胞EMT的调控。miR-145可能通过抑制TGF-β依赖的Smad信号通路活性,从而抑制肾小管EMT。     

表皮生长因子受体对哮喘小鼠气道重塑的影响及机制

目的：探讨哮喘小鼠气道重塑与表皮生长因子受体（EGFR）、肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF）的关系以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂（AG1478）对气道重塑的干预作用。方法：建立哮喘小鼠气道重塑模型,对肺组织切片行Masson和过碘酸雪夫（PAS）染色分别显示胶原沉积和气道黏膜杯状细胞增生情况。应用免疫组化和RT-PCR方法分别检测HB-EGF的蛋白和EGFR、HB-EGF mRNA表达的变化。结果：哮喘组出现气道重塑的特征性改变,HB-EGF、EGFR表达水平增高。AG1478干预组较哮喘组气道重塑有所改善,EGFR、HB-EGF表达降低（P<0.05）。结论：EGFR参与哮喘小鼠气道重塑,其酪氨酸激酶抑制剂AG1478可缓解气道重塑过程。AG1478可能通过下调EGFR及HB-EGF的表达以及抑制依赖于EGFR下游的细胞信号转导级联反应来缓解哮喘气道重塑过程。［中国当代儿科杂志,2010,12（2）：137-140］     

miR-92a-3p在小鼠胚胎神经管闭合中的作用及机制

目的探讨miR-92a-3p与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)之间的相互作用,以及两者在神经管畸形(neural tube defect,NTD)中对细胞迁移的影响。方法 实验动物采用C57BL/6J小鼠,孕鼠随机分为NTD组与对照组,每组30只,NTD组采用全反式维A酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导NTD模型,于E9.5采集胚胎样本。实验所用细胞系为小鼠神经干细胞C17.2,转染NOX4过表达质粒、miR-92a-3p模拟物/抑制剂、模拟物对照/抑制剂对照。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测胚胎和C17.2细胞中miR-92a-3p表达,采用蛋白质印迹法检测NOX4的表达。通过双荧光素酶报告基因实验明确miR-92a-3p对NOX4的结合及靶向调控关系。采用细胞划痕实验与Transwell实验观察miR-92a-3p和NOX4对细胞迁移活动的影响。统计学方法采用单因素方差分...     

反义寡核苷酸抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞血管内皮生长因子mRNA表达及其生物效应的研究

摘要 目的 研究血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸（ASODN）转染对神经母细胞瘤LA-N-5细胞VEGF mRNA表达的影响以及对肿瘤细胞增殖、分化的影响。方法 用LipofectamineTM2000介导的VEGF ASODN和错义寡核苷酸（MSODN）转染LA-N-5细胞，半定量RT-PCR检测各组细胞VEGF165和VEGF121 mRNA转染前后不同时间表达的变化；MTT法测定转染后各组细胞的生长曲线及抑制率。结果 半定量RT-PCR检测结果显示，在转染后72 h VEGF165和VEGF121 mRNA的表达：ASODN组为0.346±0.029和0.227±0.036，ASODN+LipofectamineTM2000组为0.275±0.035和0.165±0.017。ASODN组和ASODN+LipofectamineTM2000组均显著抑制VEGF mRNA的表达，ASODN+LipofectamineTM2000组抑制作用较ASODN组更强（P<0.05）；转染后ASODN组和ASODN+LipofectamineTM2000组细胞增殖显著受抑，在48 h时抑制率最高，分别为（39.92±2.74）%及（55.80±2.52）%,ASODN+LipofectamineTM2000组对细胞增殖的抑制作用较ASODN组更为明显（P<0.05）。MSODN组、MSODN+LipofectamineTM2000组对LA-N-5细胞增殖抑制作用与对照组差异无统计学意义（P>0.05）。结论 VEGF ASODN可抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞VEGF在mRNA水平的表达，并能抑制神经母细胞瘤LA N 5细胞的增殖和分化，LipofectamineTM2000能明显增强VEGF ASODN的抑制效果。     

miR-34b甲基化在白血病细胞增殖中的影响北大核心CSCD

目的 研究miR-34b在白血病细胞株的表达及其启动子区CpG岛甲基化状态,探讨miR-34b甲基化对白血病细胞增殖的影响.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测8种白血病细胞株（U937、HL-60、MV4-11、M2R、K562、Raji、CCRF、DAMI） miR-34b的相对表达量,选择同期20例非血液病患儿骨髓细胞作为对照并与其比较.采用甲基化特异PCR检测miR-34b在8种白血病细胞株miR-34b的甲基化程度,选择同期23例非血液病患儿骨髓细胞作为对照并与其比较.地西他滨（5-aza-2-dC）处理HL60及K562细胞,检测其甲基化状态及miR-34b的相对表达量.采用脂质体转染hsa-miR-34b到K562细胞、通过流式细胞仪检测转染效率、CCK-8法检测各时期hsa-miR-34b转染组细胞增殖情况并与未转染组、阴性对照转染组比较.结果 miR-34b在非血液病患儿骨髓细胞、白血病细胞株组的相对表达量分别为5.22±1.15、0.03±0.03,白血病细胞株组与非血液病患儿骨髓细胞相比,差异有统计学意义（t=4.538,P＜0.叭）.8种白血病细胞株均出现甲基化现象,其甲基化阳性率为100％;23例非血液病患儿骨髓细胞,无一例出现甲基化现象.5-aza-2-dC处理白血病细胞株HL-60及K562后,其甲基化条带均明显减弱,miR-34b的相对表达量均明显升高,分别为处理前的49.5倍和18.8倍.脂质体转染hsa-miR-34b到K562细胞其转染效率为61％,CCK-8法检测hsa-miR-34b转染组各时期均出现细胞增殖抑制作用,与阴性对照转染组相比,差异有统计学意义（48 h：t=9.303,P＜0.01;72 h：t=65.617,P＜0.01;96 h：t =36.878,P ＜0.01;120 h：t=18.748,P＜0.01）.抑制率分别为12.2％、45.7％、32.5％、22.9％,其中72 h抑制作用最明显.结论 启动子区CpG岛甲基化使miR-34b在白血病细胞株表达降低,导致细胞增殖抑制作用减弱,可能是白血病发生或发展的原因之一.     

RNA干扰抑制神经母细胞瘤细胞MYCN基因的初步研究

目的对RNA干扰抑制神经母细胞瘤细胞（LAN-5）MYCN基因表达进行初步研究。方法体外化学合成针对MYCN基因的小干扰RNA（siRNA），经脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染神经母细胞瘤细胞，以无关siRNA和未转染的细胞为对照，采用SYBR绿色荧光染料Ⅰ的实时荧光定量RT-PCR检测siRNA的抑制效果。结果脂质体转染siRNA效率可达84.83％，化学合成的siRNA可抑制神经母细胞瘤细胞MYCN基因mRNA表达，转染72h后抑制率达58．3％。结论化学合成的siRNA可以有效抑制神经母细胞瘤MYCN基因的表达，为神经母细胞瘤基因治疗开辟了新的途径。     

凋亡相关蛋白Survivin、Fas在肾母细胞瘤中的表达及其临床意义

目的 探讨凋亡相关蛋白Survivin、Fas在肾母细胞瘤发生发展中的作用，为其预后判断及治疗方案制定提供依据。方法 选取30例术前均未化疗的肾母细胞瘤石蜡包埋和15例正常肾组织标本，应用免疫组织化学方法检测Survivin、Fas蛋白在上述标本中的表达。结果 Survivin蛋白在肾母细胞瘤中表达率为53．3％，高于正常肾组织0；Fas蛋白在肾母细胞瘤中表达率为36．6％，低于正常肾组织80．0％，二者均有统计学差异（P均〈0．05）。Survivin蛋白在预后不良（UH）组及预后良好（FH）组表达率分别为83．3％、45.8％，在晚期及早期病例组中表达率分别为83．3％、33．3％，在有转移组与无转移组之问的表达率分别为87．5％、40．9％，差异均有统计学意义（P均〈0．05）。Survivin蛋白阳性患儿2年生存率为69．2％，明显低于阴性表达患儿（100％）（P〈0．05）。结论 小儿肾母细胞瘤组织中存在Survivin蛋白高表达及Fas蛋白低表达，二者协同参与肾母细胞瘤的发生和发展；Survivin可作为肾母细胞瘤预后的重要指标。     

p38丝裂原活化蛋白激酶调节急性淋巴细胞性白血病CEM细胞株糖皮质激素受体功能的分子机制研究

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）对地塞米松（DEX）诱导急性淋巴细胞性白血病CEM细胞株凋亡过程中糖皮质激素受体α（GRα）功能的影响。方法台盼蓝拒染法绘制增殖曲线;流式细胞仪解析细胞凋亡;Western blot检测糖皮质激素受体蛋白及磷酸化p38MAPK蛋白表达。结果（1）p38MAPK特异阻滞剂SB203580预处理后继续培养24-72h,细胞的增殖率分别由单用DEX时的62．3％、35．5％、11．6％升至82．8％、54．7％和48．1％（P〈0．01）;（2）5μmol／LDEX处理CEM细胞36h时,亚二倍体细胞为26．2％,显著高于对照组（P〈0．01）。SB203580预处理后,亚二倍体细胞由26．2％降至7．1％（P〈0．01）;（3）5μmol／L的DEX处理CEM细胞后,GRα总蛋白的表达水平从12h开始分别上调至117％（12h）、121％（24h）、122％（36h）、125％（48h）。未与DEX结合的GRα主要存在于细胞浆中,细胞核GRα与细胞浆GRα之比为0．27。从6-48h,GRα的胞核与胞浆之比分别为0．48、0．59、0．95、2．16、4．08;（4）5μmol／LDEX处理CEM细胞后,p-p38MAPK蛋白在15min时即隐约可见,1h开始表达增强并持续增强至6h,之后减弱至48h仍可见。SB203580预处理后,未检测到p-p38MAPK蛋白的表达;（5）SB203580预处理后,GRα的核浆比例由4．08降至0．43（P〈0．05）,GRα总蛋白无明显变化。结论DEX在诱导CEM细胞凋亡时上调GRα的蛋白表达水平并促进转位人核。p38MAPK信号转导通路的活化促进了GRα转位人核。