MTT法检测黄芪和丹参对人乳腺干细胞体外增殖的影响*☆

目的：文献报道黄芪和丹参均可诱导间质干细胞向神经细胞分化。实验以乳腺癌患者乳腺再生为最终目的，通过MTT比色法分析不同剂量黄芪和丹参对体外分离培养的乳腺成体干细胞增殖的影响。 方法：实验于2006-09/2007-09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室完成。①对象：女性非家族性乳腺癌癌旁病理证实为正常的乳腺组织取自吉林大学第一医院乳腺外科，共24例，患者年龄29～45岁，对治疗及实验均签署知情同意书。②实验方法：取切除的正常乳腺组织，去除血管及脂肪，剪碎至1.0 mm3块，组织块消化培养传代后应用免疫磁珠分离收集MUC-、ESA+标记的细胞，即乳腺成体干细胞，按1×108 L-1密度接种于96孔培养板，无血清培养48h后更换培养基，设立4组：空白对照组不加任何药物；黄芪注射液组分为25，50，100，200 mL/L 4个亚剂量；丹参注射液组分为12.5，25，50，100 mL/L 4个亚剂量；黄芪+丹参复合注射液组分为（25+12.5）,(50+25),（100+50）,（200+100）mL/L 4个亚剂量。③实验评估：各组加入对应药物后培养72 h，加入5 g/L MTT溶液20 μL，再加入二甲基亚砜振荡溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值，分析乳腺干细胞的增殖情况。 结果：①乳腺细胞形态观察：乳腺组织原代培养后形成腺上皮细胞和肌上皮细胞。②乳腺干细胞增殖检测：黄芪注射液以 50 mL/L为界，剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强（P < 0.01），达200 mL/L时产生抑制作用（P < 0.05）。丹参注射液剂量在12.5~100 mL/L范围内变动时，均能够促进乳腺成体干细胞的增殖（P > 0.05）。黄芪与丹参复合注射液以（100+ 50）mL/L为界，复合剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强（P < 0.01），且复合用药效果好于单独用药，当剂量达到（200+100）mL/L时产生抑制作用（P < 0.05）。 结论：丹参和小剂量黄芪均可提高体外分离培养的乳腺干细胞增殖能力，且两药低剂量联合使用促增殖作用更为明显。     

免疫磁珠法分离、培养人脑胶质瘤干细胞

目的建立免疫磁珠法分离，并培养人脑胶质瘤干细胞的方法。方法将术中取得的脑胶质瘤标本，通过剪切、消化和吹打成单细胞悬液，筛网过滤，免疫磁珠分选试剂盒分选出CD133^＋细胞，用神经干细胞无血清培养法培养出具有单细胞克隆能力的细胞球，取第3代进行诱导分化，分化前后用免疫细胞荧光化学方法鉴定肿瘤干细胞及分化后细胞。结果免疫磁珠分选出的CD133^＋细胞，可悬浮生长并形成神经干细胞样细胞球，有较强的增殖能力，干细胞标志物巢蛋白（nestin）阳性，分化后细胞表达神经元小管相关蛋白β-3（β-tubulin3）和星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白质（GFAP）特异性抗原，而巢蛋白、CD133^＋阴性，并具有肿瘤的核型。结论免疫磁珠分选法可避免原代培养中众多细胞混杂生长的发生，能够从大量肿瘤细胞中分离出只占极少比例的肿瘤干细胞，细胞结合磁珠后在体外可以长期培养和传代，进一步证实了肿瘤干细胞的存在，并为胶质瘤干细胞的研究奠定基础。     

腺体组织损伤后体外分离下颌下腺干/祖细胞后的克隆化培养**

背景：体外构建组织工程化人工涎腺需获得分化增殖良好、数量充足的种子细胞，但正常下颌下腺中很难分离出成体干细胞。 目的：利用腺体组织损伤动物模型体外分离下颌下腺干/祖细胞，并进行克隆化培养。 设计、时间和地点：细胞学体外观察，于2006-03/2007-01在遵义医学院贵州省细胞工程实验室完成。 材料：8周龄雄性SD大鼠10只，由解放军第三军医大学动物中心提供。 方法：10只大鼠采用结扎下颌下腺主导管、抑制腺体分泌来建立组织损伤模型，1周后切取腺体组织，酶消化法体外分离下颌下腺干/祖细胞，原代培养10~14 d后，挑取培养皿中形成的小的类圆形、类上皮细胞集落予以纯化，传代后进行单克隆培养。 主要观察指标：下颌下腺干/祖细胞免疫细胞化学染色及免疫荧光染色结果，通过绘制生长曲线分析下颌下腺干/祖细胞体外增殖能力。 结果：实验获得表达层粘蛋白的细胞具有干细胞特征，CD29呈阳性表达表明其具有高黏附、高增殖等组织干细胞特性，角蛋白19的阳性表达提示下颌下腺干/祖细胞呈上皮源性。其生长曲线近似“S”形，体外培养增殖活跃。 结论：实验结果显示，下颌下腺干/祖细胞具有组织干细胞的特征，有望成为组织工程化人工涎腺构建的一类种子细胞来源。     

成体组织来源的Sca-1+CD117-Lin-多潜能干细胞生物学特性分析

背景：关于成体干细胞可塑性机制的解释，目前多数学者接受的观点是多种组织器官内存在的成体干细胞其实并非均一的细胞群体，其中包含着更为原始的多潜能干细胞，但对于多潜能干细胞的起源、鉴别及其生物学特性仍缺乏了解。 目的：探讨从成体组织中能否分离出一群具有独特表型的更为原始的多潜能干细胞。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-03/2008-01在北京协和医学院基础学院组织工程中心完成。 材料：清洁级12.5~14.5 d BALB/C孕鼠10只。 方法：无菌条件下打开BALB/C孕鼠子宫获取胚胎体壁组织，胰蛋白酶消化后贴壁法制成细胞悬液，接种后免疫磁珠分选Sca-1+CD117-Lin-细胞群，当细胞达70%~80%融合时消化传代，取第5代细胞用于实验。 主要观察指标：倒置相差显微镜和扫描电子显微镜观察该类细胞的显微和超微形态，通过生长曲线和细胞周期观察其基本生长特性，采用流式细胞技术分析该群细胞免疫表型，以RT-PCR法检测胚胎干细胞相关抗原的表达情况，通过Von Kossa染色、油红O染色、甲苯胺蓝染色及免疫细胞荧光染色观察其向三胚层细胞分化的潜能。 结果：Sca-1+CD117-Lin-细胞贴壁生长，呈纺锤或短梭形，可在体外快速稳定扩增50代以上；传代后3~7 d为对数生长期，此后即进入平台期生长，倍增时间约为32 h，90.43%细胞处于G0/G1期，G2/M+S期的细胞比例为9.57%；细胞表型稳定，高表达Sca-1，不表达CD117，CD14，CD19，CD31，CD34，CD45和Flk-1，中度表达CD44；胚胎干细胞相关抗原Sox2，Oct-4及Nanog均呈阳性表达；诱导分化实验表明该细胞可以向中胚层来源的成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、外胚层来源的神经胶质细胞以及内胚层来源的肝细胞分化。 结论：从成体组织内可以分离出Sca-1+CD117-Lin-细胞群，其表达胚胎干细胞相关抗原，能够向三胚层分化，是一群更为原始的多潜能成体干细胞。     

干细胞相关因子在大肠癌组织及SW620细胞株的表达

背景：肿瘤细胞有多种干细胞标记的表达,深入研究其表达规律有助于揭示肿瘤发病机制、完善肿瘤干细胞理论。 目的：检测大肠癌实体组织中干细胞相关分子标记CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1与癌旁组织的表达差异,以及CD133免疫磁珠分选阳性与阴性SW620细胞中上述基因的表达差异。 方法：选临床病理诊断清楚的29例大肠癌组织标本提取RNA,RT-PCR检测CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1在大肠癌组织与癌旁对照组织中的表达。CD133免疫磁珠分选SW620,提取CD133细胞与CD133阴性细胞RNA,RT-PCR检测分选后上述基因的表达差异。 结果与结论：29例标本均诊断为低、中分化腺癌或黏液腺癌,干细胞相关分子标记癌组织与癌旁组织表达灰度相对值癌组织表达均高于癌旁组织(P < 0.05)。RT-PCR检测分选后CD133+细胞CD133,CD166,Oct4,Sox2,C-myc,Klf4,Bmi-1表达,结果均高于CD133-细胞。提示,CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1相关干细胞标记可作为大肠癌肿瘤干细胞标记并有望用于诊断检测。     

体外分离培养人皮下脂肪干细胞的生物学特性及影响因素★

目的：研究证实脂肪组织提取物中存在脂肪源性干细胞，并表现出向多谱系细胞分化的特点。对来源于人皮下脂肪组织的脂肪干细胞进行体外培养，观察其形态特点、生物学特性及间充质来源细胞表面相关标志的表达。 方法：实验于2005-11/2007-02在泸州医学院医学分子生物学实验室完成。①对象：行切疤植皮术的正常体质量患者8例，年龄16~45岁，均无传染性疾病，来源于泸州医学院烧伤整形科，实验前征得患者同意。②实验方法：人脂肪干细胞的分离、培养与传代：无菌条件下取患者新鲜的皮下脂肪，I型胶原酶消化+贴壁法获取原代脂肪干细胞，生长至70%融合时传代，观察细胞的形态学变化。当原代细胞的胞质中出现较多透亮液滴后，行油红O染色。将第3代脂肪干细胞冻存，1个月后复苏，观察细胞的生长情况。选择生长状态良好的第3代脂肪干细胞，苏木精-伊红染色观察细胞形态，SABC法检测间充质来源细胞特异性标志波形蛋白的表达，SP法检测间充质干细胞表面相关抗原CD44的表达。取处于对数生长期的细胞，绘制细胞生长曲线，计算细胞倍增时间。 结果：①原代和传代过程中人脂肪干细胞的形态学变化：原代和传代培养的细胞均为长梭形贴壁生长。当原代细胞达到50%融合后，部分细胞由梭形逐渐变为多角形或椭圆形，胞质内出现油红O染色阳性的脂滴。传代细胞中此现象逐渐消失，且经冻存后复苏的活细胞率达80%以上，细胞生长、增殖能力未受影响。②间充质来源细胞表面标志的鉴定：第3代人脂肪干细胞的胞质丰富，HE染色弱嗜碱性，呈淡蓝色；波形蛋白阳性率为(97.1±2.3)%，CD44阳性率为（85.4±3.22）%。③人脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间：传代培养的脂肪干细胞生长曲线呈“S”形，群体倍增时间为62.38 h。 结论：从人皮下脂肪组织分离培养出的脂肪干细胞，在体外扩增和冷冻保存后生物学特性稳定，且具有良好的增殖能力，表达间充质来源细胞表面标志波形蛋白和表面抗原CD44。     

流动优化骨髓间充质干细胞的分化状况

背景：间充质干细胞在成体动物骨髓中含量极低。 目的：观察成年大鼠骨髓间充质干细胞经生理范围流动切应力作用后,其体外生长规律、增殖及定向分化为成骨细胞及脂肪细胞的能力。 方法：在体外取得SD大鼠骨髓原代间充质干细胞,利用平板流室系统加载1 Pa切应力,对其进行培养及扩增,并分别向成骨细胞及脂肪细胞定向诱导。 结果与结论：原代间充质干细胞为长梭形或多角形,集落样生长;经流动加载并传代后细胞生长速度加快,不以集落方式生长,而是均匀分布。细胞体积明显增大,多数为长梭形或多角形;生长曲线显示各代细胞有类似的生长规律;激光共聚焦显微镜显示CD44和CD90阳性,CD31及CD45阴性;向成骨细胞及脂肪细胞诱导14 d后,Von Kossa染色及油红O染色均为阳性,流动优化后骨髓间充质干细胞保持了体外大量增殖及多向分化潜能。     

SD大鼠脂肪源间充质干细胞分离培养特性及影响因素

背景：脂肪源间充质干细胞因为容易大量获得、抽取后残留于供区的脂肪组织仍可扩增、供区的损伤小等优点，成为干细胞生物工程研究的理想种子细胞来源。但是，脂肪源间充质干细胞分离培养有较大困难。 目的：探索脂肪源间充质干细胞的分离培养方法及其生长特性。 方法：分别取4周龄和10月龄不同性别的SD大鼠腹股沟、肩部和腹腔脂肪组织，经细胞培养液洗涤、离心后接种于细胞培养瓶，放置体积分数5%CO2孵箱中培养，分别于24，48，72 h后换液。待细胞密度达到约80%时，用0.25%胰酶-EDTA消化，传代培养。分析SD大鼠的年龄、性别、采集脂肪组织的部位、胶原酶Ⅰ的浓度和消化时间，以及原代细胞的首次换液时间等对脂肪源间充质干细胞培养的影响。 结果与结论：原代脂肪源间充质干细胞呈梭形或多角形。随着传代和培养时间的延长，脂肪源间充质干细胞由多边形、成巢分布，逐渐连接成片，伸展为梭形或多角形。培养48 h后，含脂滴的细胞数量逐渐增多，但仍有90%的脂肪源间充质干细胞始终不表现向脂肪细胞自发分化的趋势。4周龄雌性SD大鼠腹腔脂肪组织在一定条件下传代培养最佳。提示，从SD大鼠腹腔脂肪组织中分离的脂肪源间充质干细胞可在体外稳定传代，SD大鼠的年龄、性别、采集脂肪组织的部位、胶原酶Ⅰ的浓度和消化时间，以及原代细胞的首次换液时间等均影响脂肪源间充质干细胞的分离培养效果。     

绵羊骨髓来源内皮祖细胞的培养与鉴定*☆

背景：当今,组织工程化静脉瓣的研究刚刚起步,种子细胞的选择是其关键,内皮祖细胞可以作为组织工程化静脉瓣体外构建理想的种子细胞。 目的：通过体外培养与鉴定绵羊骨髓来源内皮祖细胞,探讨绵羊骨髓来源内皮祖细胞培养方法,为绵羊组织工程静脉瓣种子细胞选择提供实验基础。 方法：绵羊骨髓经条件培养基进行选择培养获取骨髓单个核细胞,传代扩增后用磁珠分选出CD133+细胞再培养,流式细胞检测确认分前细胞CD133的表达情况;分选传代后绘制细胞生长曲线观察细胞生长能力,用免疫细胞化学检测细胞特异性分子CD133,D34,VWF的表达情况;FITC标记BS-1-lectin和DiI标记ac-LDL标记细胞检测细胞吞噬功能。 结果与结论：绵羊骨髓单个核细胞原代培养2 d细胞开始贴壁,7 d细胞完全融合,传代后第2天进入对数生长期,传代3~5 d形成为典型的铺路石样,传代后第7 d细胞进入增殖平台期;细胞传代后磁珠分选率为12.6%,流式细胞仪检测显示CD133阳性率为12.64%;免疫细胞化学检测显示细胞呈CD133、CD34、血管性血友病因子阳性表达。细胞能同时吞噬FITC-labeled BS-1-lectin,DiI-ac-LDL阳性率达85.3%。证实实验成功地从绵羊骨髓单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞。     

人脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外培养及生物学特性

背景：有研究者提出，脑内存在少量正常的神经干细胞能够向肿瘤组织迁移。这需要对从胶质瘤体外培养得到的肿瘤干细胞与正常的神经干细胞进行鉴别。 目的：从人脑胶质瘤组织中分离脑胶质瘤干细胞进行体外培养，并对其干细胞特性加以鉴定，观察脑肿瘤干细胞的生长特性。 设计、时间及地点：细胞学观察实验，于2007-02/12在解放军第四军医大学细胞工程研究中心完成。 材料：7份肿瘤标本来源于胶质瘤患者，间变性星形细胞瘤标本3份，多形性胶质母细胞瘤标本4份。 方法：将获取的胶质瘤细胞置于含2%B27、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、左旋谷胺酰氨、胰岛素、青霉素和链霉素生长因子的无血清DMEM/F12培养基中，重新悬浮为单细胞悬液，以1×108 L-1接种于含有B27、表皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基中培养分离培养肿瘤干细胞球。取第5代的肿瘤干细胞球，离心后除去原培养基，用含有体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养基接种于放置有多聚赖氨酸包被盖玻片的小平皿中，观察肿瘤干细胞分化情况。 主要观察指标：利用细胞免疫荧光及组织免疫组织化学法检测脑肿瘤干细胞在细胞培养或组织切片中CD133及巢蛋白表达。 结果：在胶质瘤中存在一定量的细胞能在无血清培养基中存活并悬浮生长，并增殖形成克隆性脑肿瘤干细胞球，细胞核较大，核质比例高，具有肿瘤细胞的特性，与原肿瘤组织标本的苏木精-伊红染色比较，肿瘤干细胞分化后的子代细胞中大部分与胶质瘤细胞相似。原代及传代脑肿瘤干细胞表达神经干细胞的特异性标志物巢蛋白和CD133。 结论：人脑胶质瘤中存在一定量的肿瘤干细胞，并能在体外将其分离培养，能够自我更新增殖、诱导分化，表达神经干细胞标志物CD133。