Fenton体系、H2O2损伤红细胞膜分子流变性的比较研究

Ｆｅｎｔｏｎ反应体系是由Ｈ２Ｏ２和二价阳离子配制成的反应体系。为区分Ｆｅｎｔｏｎ反应体系和单纯Ｈ２Ｏ２作用分别对红细胞膜脂质及蛋白分子流动性影响的不同,本文通过微吸管法、电子自旋共振波谱仪（ＥＳＲ）、激光拉曼波谱仪等分别对体外Ｆｅｎｔｏｎ反应体系和单纯Ｈ２Ｏ２作用３０分钟后,及恢复３小时后的红细胞膜剪切弹性模量μ、细胞表面指数Ｓｉ、膜整体结构、膜蛋白分子τｐ及脂质分子τｌ相对旋转时间进行了比较分析。结果发现,①Ｆｅｎｔｏｎ反应体系导致了红细胞膜的μ值明显增加,但Ｓｉ无明显改变;②Ｆｅｎｔｏｎ反应体系使红细胞膜中的β胡罗卜素构象的卷曲形式增加,提示膜整体结构改变;③Ｆｅｎｔｏｎ反应体系致使红细胞膜蛋白分子τｐ及脂质分子τｌ明显延长;④恢复３小时后除红细胞膜脂分子τｌ值外,上述改变的可逆性较差;⑤Ｈ２Ｏ２作用只引起红细胞膜τｐ值增加,但并未影响膜脂质分子流动性和红细胞变形性;因此证明Ｆｅｎｔｏｎ反应体系作用后红细胞流变性的改变主要为其中的自由基损伤所致     

姜黄素对H2O2诱导软骨细胞自噬的调控

背景:姜黄素对骨关节炎具有良好的治疗作用,但具体机制还不清楚;研究表明自噬的激活可降低骨关节炎的严重程度。目的:探讨姜黄素对H₂O₂诱导软骨细胞自噬的调控作用。方法:体外培养C57小鼠关节软骨细胞,分为对照组、模型组以及姜黄素不同剂量组(10,20,40,80μmol/L)。模型组给予H₂O₂(1 mmol/L)处理,模拟骨关节炎体内氧化应激状态;姜黄素组中不同浓度姜黄素与软骨细胞培养48 h后,加入H₂O₂,24 h后收集细胞进行检测。CCK-8法检测各组细胞活力;酶联免疫吸附法检测炎症因子白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平;TUNEL染色检测凋亡状况;流式细胞法检测各组细胞凋亡率;Western-blot法检测凋亡相关蛋白(活化半胱天冬酶3、Bax/Bcl-2)、细胞自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白)及自噬相关信号通路蛋白(蛋白激酶B、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)的表达情况;实时荧光定量PCR检测软骨基质降解相关基因(基质金属蛋白酶13、血...     

血管内皮生长因子拮抗H2O2诱导的血管内皮细胞凋亡

目的：探讨血管内皮生长因子（VEGF）预防血管成形术后再狭窄的机制。方法：构件含人VEGF₁₆₅基因的重组腺病毒载体并感染体外培养的血管平滑肌细胞，72 h后收集含VEGF的条件培养液，将对数生长期的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分成对照组、H₂O₂处理组和H₂O₂+VEGF处理组，12 h后采用原位末端标记法和流式细胞术检测各组细胞的凋亡发生情况。结果：H₂O₂处理组细胞凋亡明显多于对照组和H₂O₂+VEGF处理组（P<0.01）。结论：H₂O₂能诱导HUVEC凋亡，而VEGF能部分拮抗上述作用。     

远志皂苷元对H2O2诱导的大鼠海马神经元损伤的影响及其机制

目的: 观察远志皂苷元(senegenin, Sen)对过氧化氢(H₂O₂)诱导的SD大鼠海马神经元损伤的影响并探讨其作用机制。方法: SD大鼠海马神经元培养至第6 d,随机分为正常组、H₂O₂组、Sen+ H₂O₂ 组和Sen组,药物干预后检测细胞存活率、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,并用 Hoechst 33258染色观察细胞核形态变化,荧光定量PCR(real-time PCR)检测神经元凋亡相关基因 bcl-2和bax 的表达,进一步采用Western blotting观察Bcl-2和Bax蛋白表达,酶荧光活性检测试剂盒测定caspase-3的活性改变。结果: 与正常组相比,H₂O₂组细胞存活率降低。与H₂O₂组相比,20 μmol/L Sen+ H₂O₂ 组细胞存活率升高,SOD活性升高,MDA含量下降,并且远志皂苷元能够上调bcl-2 mRNA表达、下调bax mRNA表达,降低caspase-3活性,Western blotting结果进一步表明Bcl-2蛋白表达升高,Bax蛋白表达下降,各指标均有显著差异(P<0.05)。结论: 远志皂苷元对H₂O₂处理的海马神经元有一定保护作用,其机制可能与远志皂苷元增强海马神经元抗氧化能力、调节细胞凋亡相关蛋白从而抑制凋亡有关。     

维生素E对H2O2诱导的人甲状腺细胞凋亡的保护作用

目的研究维生素E对H2O2引起的人甲状腺细胞凋亡的影响。方法取良性甲状腺腺瘤手术中的腺瘤旁正常甲状腺组织进行细胞培养。预防组加VE(50μmol/L)或无血清培养液后再加入不同浓度H2O(2200～800μmol/L),治疗组预先加入不同浓度H2O(2200～800μmol/L)后再加入VE或无血清培养液刺激单层培养的甲状腺细胞,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术(FCM)检测各组甲状腺细胞凋亡率。结果预防组和治疗组单纯200～800μmol/L H2O2作用24 h均可使甲状腺上皮细胞存活率降低、凋亡率升高(P<0.01),并呈浓度效应关系。与相应单纯H2O2处理相比,加入50μmol/L VE预干预及治疗后,细胞存活率升高、凋亡率下降,400、800μmol/L H2O2处理时上述反应尤为显著(P<0.05)。结论维生素E对H2O2诱导的人甲状腺细胞凋亡具有保护作用。     

阿魏酸对H2O2诱导脐静脉内皮细胞表达P-选择素的影响

目的:探讨阿魏酸对H₂O₂刺激脐静脉内皮细胞（HUVECs）表达P-selectin的影响。方法:应用培养的HUVECs经H₂O₂刺激,用FTTC标记抗P-选择素单抗SZ-51-1gG和FCM测定HUVECs表面表达的P-se-lectin,同时观察了阿魏酸对其表达的影响。结果:实验显示正常HUVECs表面表达少量的P-selectin,H₂O₂能刺激培养的HUVECs表面P-selectin表达增高,其中最适的H₂O₂刺激浓度在250-300μmol/L,最适的刺激时间为1.5-2h;随着阿魏酸浓度增加,阿魏酸明显地抑制H₂O₂刺激HUVECs表面P-selectin的表达。结论:H₂O₂能刺激培养的HUVECs表面P-selectin表达增高,阿魏酸明显地抑制其表达。     

热休克蛋白70对H2O2诱发大鼠心肌细胞凋亡的保护作用

目的:探讨热休克蛋白70(HSP₇₀)对心肌细胞凋亡的保护作用。方法:体外培养大鼠心肌细胞同时温度诱导细胞产生HSP₇₀,用过氧化氢(H₂O₂)造成心肌细胞损伤。采用免疫组化、DNALadder、流式细胞仪、细胞色素C氧化酶及琥珀酸脱氢酶比活力的测定、电镜观察等作为检测指标的方法。结果:温度诱导后HSP₇₀在胞浆中大量表达,H₂O₂损伤组与HSP₇₀保护组凋亡率(12.18±1.94,6.42±0.86,P<0.01)、细胞色素C氧化酶比活力(5.824±1.949,10.375±2.513)及琥珀酸脱氢酶比活力(0.884±0.152,1.174±0.214,P<0.01)有显著差异。电镜观察损伤组细胞膜、细胞器损伤明显,并出现凋亡小体。结论:HSP₇₀可延迟细胞凋亡,对心肌细胞具有保护作用。     

CLOCK氧化还原修饰介导内源性H2O2对小鼠细胞呼吸的调节作用

目的 探究生物钟核心转录因子昼夜节律运动输出周期蛋白(CLOCK)介导内源性过氧化氢(H₂O₂)对细胞呼吸的调节作用和机制。方法 利用Seahorse细胞能量代谢分析仪检测Clock^C195S小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)和成体成纤维细胞(MAFs)细胞氧耗能力和糖酵解能力;通过q-PCR检测细胞呼吸关键代谢酶基因表达水平;MEFs进行抗氧化剂Trolox处理后,用Amplex?Red试剂盒检测内源性H₂O₂的含量,并通过生物素碘乙酰胺(BIAM)探针标记检测CLOCK蛋白氧化还原修饰的改变,进一步检测处理后的细胞氧耗能力和细胞呼吸关键代谢酶基因表达水平。结果 Clock^C195S细胞氧耗能力和糖酵解能力下降,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)合成关键酶烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT2)表达降低(P<0.05),NAD含量下降;Trolox处理导致细胞内源性H₂O₂含量降低,Clock^wt     

巨噬细胞增强H2O2抑制人血管内皮细胞和兔血管平滑肌细胞的增殖

目的探讨H2O2处理对巨噬细胞分泌因子的影响,及对血管内皮细胞(VEC)及平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响。方法实验分组:空白对照组,0.5 mmol/L H2O2组,巨噬细胞条件培养基组,巨噬细胞+0.5 mmol/L H2O2条件培养基组。CCK-8测定VEC和VSMC的增殖情况。ELISA检测白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α),以及血管内皮细胞生长因子(VEGF)。Western blot检测增殖核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白cyclinD1的表达,以及血管内皮细胞内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)的表达。结果 VEC中其他3个处理组的增殖水平均低于对照组(P<0.05),而在VSMC中,巨噬细胞组的增殖水平高于空白对照组(P<0.05)。在VEC和VSMC中,巨噬细胞+0.5 mmol/L H2O2组的增殖水平均高于单独0.5 mmol/L H2O2处理组(P<0.05),且低于单独巨噬细胞处理组(P<0.05)。巨噬细胞分泌的IL-6、IL-10、MCP-1随时间和H2O2的浓度增加而增高(P<0.05)。VEC分泌的VEGF在1.0 mmol/L H2O2浓度时有明显增高(P<0.05)。结论氧化应激处理可影响巨噬细胞炎性因子的分泌,进而影响血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖。     

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤在H2O2引起的神经胶质瘤U251细胞损伤中的作用

目的: 探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)在H₂O₂诱导的神经胶质瘤U251细胞损伤过程中的作用。方法: 实验分为4组:正常对照组、10 mmol/L 3-MA组、1 mmol/L H₂O₂组、1 mmol/L H₂O₂ +10 mmol/L 3-MA组。MTT法检测各组的U251细胞增殖率;MDC染色检测细胞自噬空泡的变化;Hoechst 33342染色检测细胞核染色质凝聚变化;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果: 与对照组相比,单独应用3-MA对U251细胞无明显影响。H₂O₂作用组U251细胞增殖率明显降低,细胞内出现自噬空泡,细胞核染色质凝聚,细胞凋亡率增加。3-MA与H₂O₂联合作用于U251细胞时,与单独应用H₂O₂组相比,抑制了H₂O₂引起的胞内自噬空泡的积聚,但细胞凋亡率明显增加。结论: 自噬抑制剂3-MA能够一定程度地抑制H₂O₂诱导的U251细胞自噬,但促进了细胞凋亡,表明自噬在H₂O₂诱导的神经胶质瘤U251细胞损伤过程中很可能起到保护性作用。     

神经氨酸酶对红细胞膜的剪切弹性模量和表面粘度的影响

神经氨酸酶（唾液酸酶）与红细胞发生生物化学作用,分别改变其作用时间和二者的相对作用剂量。以达到不同程度地去掉红细胞的表面电荷。用文宗曜、宗毅等最近提出的一种测量红细胞剪切弹性模量及表面粘度的新方法－新型激光衍射法,分别测量经过各种处理的红细胞的小变形指数（ＤＩ）d和变形恢复过程即松驰过程中变形恢复到最大值（ＤＩ）max一半时间t0.5(即变形恢复半时间）,将测得的结果分别代入红细胞膜的剪切弹性模量（Ｅ）公式和红细胞面粘度（μｍ）公式。计算出经过各种处理后的红细胞的膜煎切弹性模量和表面粘度,并与正常对照组的相应参数作比较,发现二者之间存在明显差异,此差异随处理程度的增加而增大,表现出明显的量效关系。因此有力地证明了神经氨酸酶对红细胞作用后使其剪切弹性模量增大,表面粘度增大,同时也体现了新型激光衍射法在测量红细胞膜的剪切弹性模量增大,表现粘度增大,同时也体现了新型激光衍射法在测量红细胞膜的剪切弹性模量和表面工时有很好的灵敏性,它与国外文献所报道的微吸管法和流室法测得的上近,但操作方便,省时、省力、造价低,因此具有更广泛的应用范围。     

去泛素化酶USP14调控H_2O_2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤

目的:观察抑制泛素特异性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14,USP14)的活性对H_2O_2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤的影响。方法:体外培养H9c2心肌细胞,用H_2O_2(25μmol/L)处理2 h,建立心肌细胞氧化应激损伤模型。将细胞分为对照(control,CON)组、模型组(H_2O_2组)、USP14抑制剂IU1处理组(IU1组)和IU1处理后建模组(IU1+H_2O_2组)。MTS法检测H9c2心肌细胞活力;流式细胞术检测细胞内活性氧簇(ROS)的产生和细胞存活率;Western blot法检测丝裂原活化蛋白激酶家族相关蛋白的表达变化。结果:与CON组相比,H_2O_2组细胞活力、细胞存活率显著降低,细胞内ROS含量、Bax/Bcl-2、P53、p-ERK1/2、p-JNK和p-P38的蛋白水平显著增加(P0.05);与H_2O_2组比较,IU1+H_2O_2组细胞活力、细胞存活率显著增加,细胞内ROS含量、Bax/Bcl-2、P53、p-ERK1/2、p-JNK和p-P38蛋白水平显著降低(P0.05)。结论:抑制USP14活性可以减轻氧化应激条件下H9c2心肌细胞的损伤,其机制可能与抑制丝裂原活化蛋白激酶信号活化和下调凋亡相关蛋白有关。     

Sodium pyruvate protects against H2O2 mediated apoptosis in human neuroblastoma cell line-SK-N-MC

Free radicals are involved in neuronal damage. The present study was aimed to investigate the protective effect of sodium pyruvate—a free radical scavenger against hydrogen peroxide (H₂O₂) induced apoptosis in human neuroblastoma cell line-SK-N-MC. On exposure to H₂O₂ (0.025 mM) cells exhibited apoptosis within 24 h, demonstrating a high caspase 3 activity by 3 h followed by cleavage of PARP that was maximum at 24 h. A break down in the mitochondrial membrane potential was observed 3 h onwards. Sodium pyruvate protected cells significantly (P<0.05) against apoptosis in a dose dependent manner as assessed for cell viability by dye exclusion method and apoptosis by TUNEL. Sodium pyruvate significantly inhibited caspase 3 activity, cleavage of PARP and breakdown of mitochondrial membrane potential. These data suggest that sodium pyruvate protects neuronal damage caused by H₂O₂.     

Q热立克次体67kD蛋白的免疫保护性研究

本文报道Ｑ热立克次体６７ｋＤ膜蛋白抗原对小鼠和豚鼠的免疫原性和免疫保护性的研究。结果表明６７ｋＤ蛋白抗原在体内和体外均能有效地激活实验动物的细胞免疫和体液免疫系统。免疫小鼠和豚鼠对１０３ＩＤ５０Ｑ热立克次体七医株Ⅰ相攻击的保护率均为１００％，体外淋巴细胞增殖试验阳性，免疫动物出现迟发型变态反应，并全部检出特异性抗体。本项研究提示６７ｋＤ蛋白有可能用于制作有效的Ｑ热亚单位疫苗。     

Staphylococcal catalase protects intracellularly survived bacteria by destroying H2O2 produced by the murine peritoneal macrophages

To determine the interrelationship between the hydrogen peroxide (H₂O₂) mediated killing and the potential role of bacterial catalase and SOD in the evasion of host defense, we examined three clinical isolates of Staphylococcus aureus and evaluated their intracellular survival mechanism within murine peritoneal macrophages. Fluorescent microscopy and bacterial colony-forming unit (cfu) count revealed that phagocytic capacity of murine peritoneal macrophages was highest after 2 h of in vitro infection with S. aureus. To understand whether catalase and SOD contributing in the intracellular survival, were of bacterial origin or not, 3 amino 1,2,4 triazole (ATZ) and Diethyldithiocarbamic acid (DDC) were used to inhibit specifically macrophage derived catalase and SOD respectively. Catalase activity from the whole staphylococcal cell in presence of ATZ suggested that the released catalase were of extracellular origin. Scanning electron microscopy revealed the degraded host cell membrane integrity during prolonged infection. Purified bacterial catalase from the intracellularly survived S. aureus recovered after 5 h of infection and its inhibition by ATZ in the zymography strengthened the scope of involvement of these anti-oxidants in the intracellular survival of S. aureus.     

肢体缺血预适应减轻人脐静脉内皮细胞的氧化应激损伤

 目的: 探讨肢体缺血预适应对氧化应激损伤的血管内皮是否具有保护作用。方法: 人脐静脉内皮细胞分为5组:对照组不加任何处理;模型组给予过氧化氢损伤2 h;早期肢体缺血预适应组、晚期肢体缺血预适应组和假肢体缺血预适组这3组分别用5%大鼠早期肢体缺血预适应血清、晚期肢体缺血预适应血清和假肢体缺血预适应血清孵育12 h,再用过氧化氢损伤2 h。检测细胞凋亡情况,培养液中乳酸脱氢酶的活性,内皮细胞表面黏附分子的mRNA水平,血红素氧合酶1的mRNA和蛋白表达情况。结果: 大鼠早期肢体缺血预适应和晚期缺血预适应血清可以减轻人脐静脉内皮细胞氧化应激所导致的细胞死亡,减少乳酸脱氢酶的释放,减少内皮细胞表面黏附分子的表达,并能增加血红素氧合酶1的mRNA和蛋白的表达。结论: 肢体缺血预适应可以减轻血管内皮细胞的氧化应激损伤。     

秋水仙碱对排卵和黄体化过程作用的实验研究

应用光镜、透射电镜及酶组化等手段，观察秋水仙碱对兔排卵过程的作用，结果表明：秋水仙碱２ｍｇ／ｋｇ体内用药可完全抑制人绒毛促性线激素诱发的排卵。秋水仙碱主要抑制排卵前卵泡顶壁血管及胶原纤维的变化，对颗粒细胞黄体化及孕酮的合成和分泌无影响。     

Role of Catalase in H2O2-induced oxidant stress in marsupial erythrocytes

We have examined the catalase activity and H₂O₂-induced oxidant stress on methaemoglobin formation and haemolysis in eight species of marsupials: the black striped wallaby (Macropus dorsalis), bridled nailtail wallaby (Onychogalea fraenata), proserpine rock wallaby (Petrogale persephone), red legged pademelon (Thylogale stigmatica), spectacled hare wallaby (Lagorchestes conspicillatus), whiptail wallaby (Macropus parryi), common brushtail possum (Trichosurus vulpecula), and the koala (Phascolarctos cinereus). The results indicate a significant relationship between the activity of catalase and methaemoglobin formation by H₂O₂.     

Therapeutic use of H2O2-responsive anti-oxidant polymer nanoparticles for doxorubicin-induced cardiomyopathy

Doxorubicin (DOX) is a commonly used anti-neoplastic agent but its clinical use is limited due to serious hepatic and cardiac side effects. DOX-induced toxicity is mainly associated with overproduction of reactive species oxygen (ROS) such as hydrogen peroxide (H₂O₂). We have recently developed H₂O₂-responsive anti-oxidant polymer, polyoxalate containing vanillyl alcohol (PVAX), which is designed to rapidly scavenge H₂O₂ and release vanillyl alcohol with anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-apoptotic properties. In this study, we report that PVAX nanoparticles are novel therapeutic agents for treating DOX-induced cardiac and hepatic toxicity. Intraperitoneal injection of PVAX nanoparticles (4 mg/kg/day) resulted in significant inhibition in apoptosis in liver and heart of DOX-treated mice by suppressing the activation of poly (ADP ribose) polymerase 1 (PARP-1) and caspase-3. PVAX treatment also prevented DOX-induced cardiac dysfunction. Furthermore, survival rate (vehicle = 35% vs. PVAX = 75%; p < 0.05) was significantly improved in a PVAX nanoparticles-treated group compared with vehicle treated groups. Taken together, we anticipate that PVAX nanoparticles could be a highly specific and potent treatment modality in DOX-induced cardiac and hepatic toxicity.