HBx基因下调p21对HepG2细胞增殖与凋亡的影响

目的:构建转基因细胞模型HepG2/HBx,观察HBx基因对HepG2细胞增殖、周期和凋亡的影响, 探讨细胞周期蛋白P21在其中的作用和意义.方法:应用脂质体转染和G418筛选构建稳定表达HBx的转基因细胞HepG2/HBx,RT-PCR和Western blot鉴定HBx mRNA与蛋白的表达.分别以四唑蓝(MTT)比色法、流式细胞术检测HepG2/HBx细胞及对照组HepG2与HepG2/pcDNA3.1细胞(转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞)的增殖、周期和凋亡.另半定量RT-PCR检测各组细胞中细胞周期蛋白P21与抑癌基因p53mRNA的表达.结果:HepG2/HBx细胞中有HBx mRNA和蛋白的表达.HepG2/HBx细胞生长速度加快.HepG2/HBx中G0/G1期细胞比例较对照组显著减少(43.34%±3.11%vs57.69±4.28%,P<0.01),S期细胞比例明显增加(28.69%±1.17%vs22.41%±1.99%,P<0.05),同时还发现与对照组相比其凋亡率也显著降低(1.19%±0.06%vs 5.43%±0.42%, P<0.001).细胞周期蛋白p21 mRNA在HepG2/HBx细胞中的表达较对照组细胞显著降低(0.16±0.05vs0.78±0.15,P<0.001),而p53表达则无显著变化.结论:HBx基因可下调细胞周期蛋白P21mRNA的表达,可能参与HBx基因加速HepG2细胞周期进程、促进细胞增殖以及抑制细胞凋亡的作用.     

HepG2与HepG2．2．15细胞中P53表达及细胞生物学活性的差异

目的观察HBV对肝癌细胞生物学活性的影响，探讨HBV导致原发性肝癌发生的机制。方法用Western blot方法检测HepG2细胞以及稳定转染了HBV质粒的HepG2．2．15细胞中P53蛋白的表达情况，观察二种细胞某些生物学活性，如细胞周期、细胞凋亡的差异及细胞生长曲线以及裸鼠成瘤情况。结果HepG2．2．15细胞中P53蛋白表达水平及细胞凋亡率均高于HepG2细胞，细胞周期检测发现处于“S”期的细胞HepG2．2．15多于HepG2，细胞生长曲线显示其生长速度快于HepG2细胞，并且具有成瘤性。结论HBV在细胞内复制对细胞的凋亡与增殖均具有增强作用，其对细胞凋亡的促进作用可能通过使P53稳定性增强，进而使其活性增强。HBV感染的细胞存在凋亡与增殖的抗衡，当细胞增殖占优势时，则易于生成肿瘤。     

辛伐他汀抑制HepG2细胞增殖作用的机制

目的 体外观察辛伐他汀对人肝癌细胞HepG2增殖、细胞周期及细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p21蛋白表达的影响.方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察辛伐他汀对HepG2细胞增殖的影响,用流式细胞仪检测辛伐他汀对细胞周期的作用,用免疫细胞化学法观察辛伐他汀对细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p2l蛋白表达的影响.对数据进行析因设计与单因素方差分析.结果 体外辛伐他汀可抑制HepG2细胞的增殖(F浓度=1264,P＜0.001 ;F时间=17.466,P＜0.001;F浓度*时间=35.053,P＜0.001).辛伐他汀处理组G0/G1期细胞增多,但细胞凋亡不明显;体外辛伐他汀可增强HepG2细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p21蛋白的表达(F=512.133,P＜0.001).结论 体外辛伐他汀对HepG2细胞增殖有抑制作用,该作用可能与其使细胞生长阻滞于G0/G1期及增强细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p21蛋白表达有关.     

脂氧合酶抑制剂对HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨脂氧合酶抑制剂对HepG2细胞增殖及凋亡的影响及其相关机制。方法应用不同浓度脂氧合酶抑制剂去甲二氢愈创木酸（NDGA）处理HepG2细胞，利用MTY比色法、生长曲线、细胞克隆形成观察NDGA对HepG2细胞的增殖作用，H-E染色、流式细胞术观察细胞凋亡并行细胞周期分析，细胞免疫化学或Western印迹技术测定Caspase-3、增殖细胞核抗原（PCNA）、野生型（wt）P53、c-erbB-2蛋白表达水平变化。结果NDGA对HepG2细胞具有明显生长抑制作用，不同浓度NDGA（50、100、150、200μmol／L）处理HepG2细胞72h的抑制率分别为27．34％、41．76％、57．08％和69．17％，其IC50值为109．13μmol／L；细胞克隆形成率分别为21．63％、17．33％、12．53％、7．97％，明显低于对照组的31．70％。同时NDGA可诱导HepG2细胞凋亡，与细胞周期被阻滞于G1／S期有关。细胞免疫化学、Western印迹分析显示NDGA对HepG2细胞的PCNA、c-erbB-2蛋白表达有抑制作用，并可促进Caspase-3、wtP53蛋白表达。结论NDGA对HepG2细胞有较强的细胞毒作用且以剂量、时间依赖方式抑制细胞增殖，并诱导凋亡，使细胞周期阻滞于G1／S期。此作用与改变某些原癌基因、抑癌基因的蛋白表达水平有关。     

肝衰竭患者血浆对HepG2细胞增殖的抑制及表皮生长因子的调控作用

目的:探讨肝衰竭患者血浆(liver failure plasma,LFP)抑制HepG2细胞生长、增殖的机制及表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对其抑制作用的调控作用.方法:通过用50%LFP与HepG2细胞共同培养(肝衰竭组),以相同浓度正常人血浆(正常对照组)作对照.采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、Hoechst法分别观察不同时间点细胞增殖率及凋亡率,并用Western blotting法检测细胞周期蛋白Cyclin D1、细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin-dependent kinase4,CDK4)表达.进一步观察不同浓度EGF对LFP培养的HepG2细胞生长及增殖的刺激作用.结果:50%LFP对HepG2细胞生长及增殖有明显的抑制作用,且呈时间依赖性.EGF对正常对照组HepG2细胞的生长及增殖有明显促进作用,但仅大剂量EGF对肝衰竭组HepG2细胞生长和增殖有一过性刺激作用.与EGF刺激正常对照组比较,肝衰竭组各时间点细胞增殖仍受到明显抑制.LFP与HepG2细胞培养后,细胞凋亡率无明显增加(P>0.05).随着作用时间的延长,LFP抑制HepG2细胞内Cyclin D1、CDK4的表达.结论:LFP对HepG2细胞生长及增殖具有较强的抑制作用,但并不明显诱导其凋亡.大剂量EGF对LFP培养的HepG2细胞增殖虽有一过性刺激作用,但并不能逆转其抑制作用.LFP抑制HepG2细胞生长和增殖的机制可能与其抑制细胞内Cyclin D1、CDK4的表达有关.     

人宫颈癌基因小干扰RNA抑制HepG2细胞生长的作用及其机制

目的 利用RNA干扰技术探讨人宫颈癌基因(HCCR)对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制. 方法 构建表达HCCR小干扰RNA的真核表达质粒pRIV2-siHCCR,将其转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量PCR、Westem blot检测HCCR及其相关基因的表达,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖状态,流式细胞术观察细胞凋亡与细胞周期变化. 结果 成功构建真核表达质粒pRIV2-siHCCR,其表达的HCCR siRNA可有效抑制HepG2细胞内HCCR的表达,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡增加.Western blot结果显示HCCR小干扰RNA作用HepG2细胞后,细胞内P53蛋白的表达降低,P15蛋白的表达明显升高,而PTEN、P16、P27蛋白水平没有明显改变. 结论 HepG2细胞中HCCR蛋白下调后,细胞增殖受到抑制,凋亡细胞增多,其作用机制可能与蛋白质P53、P15有关.     

应用短发夹状RNA研究HBV X 基因表达对三氧化二砷诱导HepG2细胞凋亡特性的影响

目的应用shRNA(短发夹状RNA)介导的RNA干扰研究HBV X基因表达对三氧化二砷(As2O3)诱导HepG2细胞凋亡特性的影响.方法用噻唑蓝(MTT)还原法分析经2.0μmol/L As2O3处理的HepG2细胞和表达HBV X基因的HepG2-X细胞的生长抑制率.以未处理细胞为对照,流式细胞术分析细胞凋亡比和细胞周期,采用Caspase3/cpp32活性比色试剂盒测定As2O3处理后细胞裂解物中Caspase3的活性.应用脂质体介导HBX序列特异性shRNA表达载体pXi-1、pXi-2和序列无关对照pXi-3转染HepG2-X,再次分析细胞凋亡比、细胞周期和Caspase3活性的变化.结果MTT法表明2.0μmol/L As2O3处理36小时具有理想的细胞生长抑制率.As2O3作用后细胞凋亡比明显增高(P＜0.05),G2/M期细胞增多(P＜0.05).不同HBV X基因表达水平的细胞As2O3诱导的细胞凋亡比有统计学差异(P＜0.05),HepG2-X与HepG2比较,其As2O3诱导的细胞凋亡比下降,且细胞裂解物的Caspase3活性下降(P＜0.05),但应用序列特异性shRNA抑制HBV X基因表达后凋亡比和Caspase3活性可再次增高,而作为对照的序列无关的shRNA则无此效应,但这种效应与细胞周期无关.结论As2O3可诱导HepG2细胞凋亡.表达HBV X基因后As2O3诱导的HepG2细胞凋亡比和Caspas3活性下降,特异性shRNA抑制HBV X基因表达后则无此效应,但这种效应与细胞周期无关.     

小干扰RNA抑制MDM2对HepG2细胞的影响及机制

目的探讨小干扰RNA对HepG2细胞泛素蛋白链接酶(MDM2)基因表达的干扰效应和增殖影响的分子机制。方法建立装载靶向MDM2基因小干扰RNA(siRNA)的表达载体;用脂质体法将此表达载体转染HepG2细胞株,以转染阴性对照质粒组作对照;采用RT-PCR检测MDM2,p53,Bcl2和p21基因的表达;MTT法检测细胞增殖抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,划痕实验检测细胞迁移能力的改变。结果转染siRNA MDM2后的HepG2细胞MDM2和Bcl2基因表达明显减低,而p53和p21基因表达被明显增强,与空白组比差异具有显著性。siRNA MDM2明显抑制了HepG2的增殖并诱导其凋亡,同时使细胞迁移能力明显下降。但转染阴性对照质粒组未出现基因的表达变化和增殖抑制及凋亡。结论 siRNA MDM2可明显抑制HepG2增殖诱导其凋亡,并减弱肿瘤细胞迁移力。可能与抑制MDM2,增强p53表达,从而影响细胞周期和凋亡相关的基因表达变化有关。     

蒺藜皂苷对人卵巢癌细胞SKOV3增殖的影响

目的 探讨蒺藜皂苷(STT)对体外培养的卵巢癌细胞株SKOV3增殖的影响及机制.方法 选择对数生长的卵巢癌细胞株SKOV3分为空白对照组,实验组加STr.采用MTr法检测细胞活性,流式细胞术(FCM)测定各组SKOV3肿瘤细胞凋亡率及细胞周期变化;应用免疫组化检测SKOV3 Bcl-2和Bax蛋白表达变化.结果 与对照组相比,实验组对卵巢癌细胞的增殖具有明显的抑制作用(P＜0.05).细胞周期分析显示,实验组使卵巢癌细胞的S期细胞比例减小,G1期细胞比例增大(P＜0.05).STr能够降低Bcl-2蛋白表达(P＜0.05),增加Bax蛋白表达(P＜0.01).结论 STT能明显抑制卵巢癌细胞的增殖,其机制可能与细胞周期发生停滞有关,并通过影响细胞周期及下调Bcl-2蛋白和增加Bax蛋白的表达而诱导细胞凋亡.     

抑癌基因Smad4对HepG2生长的影响及其机制探讨

目的研究抑癌基因Smad4对人肝癌细胞株HepG2．生长的影响，并探讨其作用机制。方法采用脂质体瞬时转染法转染PFTX-5Smad4质粒至人肝癌细胞株HepG2（实验组），以转染空质粒PFTX-5的HepG2细胞为对照组，野生型HepG2细胞为空白组，利用免疫印迹（Westernblot）和逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测Smad4及血管内皮生长因子（VEGF）表达的变化；用MTT法检测细胞增殖及用FITC—AnnexinV、碘化吡啶（propidiumiodide，PI）双染后流式细胞仪（FCM）检测细胞周期和凋亡情况，Westernblot检测细胞周期素D1（CyclinD1）表达差异。结果PFTX-5Smad4瞬时转染到肝癌细胞后，实验组与对照组和空白组相比，Smad4mRNA和蛋白表达明显上升（P〈0．05），而VEGFmRNA和蛋白的表达显著降低（P〈0．05）。实验组细胞CyclinD1表达明显下降（P〈0．05），细胞周期时相分布出现合成前期（G。／G．期）阻滞。实验组细胞凋亡率明显升高（P〈0．01），增殖受到明显抑制。结论Smad4高表达可能通过降低肝癌细胞中VEGF的表达，抑制eyclinD1转录合成，并诱导强烈的G1期阻滞和细胞凋亡，对细胞的增殖有明显的抑制作用，为进-步研究肝癌生长增殖机制提供了实验基础。     

槲芪癥消汤对人肝癌细胞株HepG2.2.15增殖和凋亡的影响

目的:研究槲芪癥消汤对体外培养的人肝癌细胞株HepG2.2.15的增殖、凋亡、迁移能力、细胞内p53基因及蛋白表达量的影响,揭示该方可能的抗肿瘤机制。方法:应用不同浓度的槲芪癥消汤处理细胞,MTT法测定细胞增殖抑制率,Transwell检测细胞侵袭能力、流式细胞术检测细胞凋亡情况、rt-qPCR及Western blot检测细胞内p53的RNA及蛋白的表达变化。结果:槲芪癥消汤对HepG2.2.15细胞增殖有明显的抑制作用,使细胞的侵袭能力明显下降,并可促进细胞凋亡,同时细胞内p53的RNA及蛋白表达量明显增加,与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:槲芪癥消汤能抑制肝癌HepG2.2.15细胞的增殖、侵袭,促进其凋亡,可能与促进细胞内的p53基因表达有关。     

丙型肝炎病毒核心区蛋白对 HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响

目的　研究丙型肝炎病毒核心区 (HCV C)蛋白对肝癌细胞HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响。方法　首先运用基因重组技术构建含有HCV C基因的真核表达质粒pcDNA3.1( ) ,然后利用脂质体介导将重组真核表达质粒转染HepG2 ,经G4 18筛选获得稳定转染HepG2细胞 (HCV C转染HepG2细胞 ) ,经逆转录 聚合酶链反应技术 (RT PCR)和间接免疫荧光法证实其中有HCV C蛋白表达。然后进行如下实验 :( 1)利用四甲基偶氮唑蓝比色 (MTT)法检测HCV C转染HepG2细胞、空白质粒转染HepG2细胞和未转染HepG2细胞的生长增殖率 ;经流式细胞术(FACS)检测 3组细胞的细胞周期 ;( 2 )经流式细胞术检测细胞凋亡率 ;( 3)经端粒重复扩增 酶联免疫吸附试验 (TRAP ELISA)法检测上述 3组细胞端粒酶活性表达情况。结果　 ( 1)HCV C转染HepG2细胞增殖率显著高于空白质粒转染HepG2和未转染HepG2细胞增殖率 ;HCV C转染HepG2细胞S期所占百分率高于未转染HepG2细胞S期所占百分率 ;( 2 )HCV C转染HepG2细胞凋亡率显著低于无HCV C转染细胞凋亡率 ;( 3)上述 3组细胞端粒酶活性之间差异无显著性。结论　 ( 1)HCV C蛋白具有抑制细胞凋亡的作用 ;( 2 )HCV C蛋白促进HepG2从G0 /1期进入S期 ,从而可能促进细胞生长增殖 ,抑制细胞凋亡 ;( 3)HCV     

The inhibition effect and its molecular mechanism of human cervical cancer oncogene siRNA on hepatocarcinoma cells

OBJECTIVE: To evaluate the effect and the possible mechanism of HCCR siRNA on cell proliferation and apoptosis of hepatocarcinoma cells. METHODS: pRIV2-siHCCR plasmids, which express small interfering RNA of HCCR were constructed and transfected into HepG2 cells. The mRNA and protein expressions of HCCR were detected by real time PCR and Western blot. The proteins p15, p16, p27, p53, and PTEN were detected by Western blot. The cell proliferation and apoptosis were observed by MTT and FACS. RESULTS: The plasmid pRIV2-siHCCR was constructed successfully. Real time PCR and Western blot analysis showed that the HCCR siRNA effectively inhibited HCCR expression in HepG2 cells after pRIV2-siHCCR transfection. MTT method confirmed that HepG2 cell proliferation was suspended, while the cell apoptosis was increased much more than that in the control group. After the transfection with the plasmid of pRIV2-siHCCR into HepG2 cells, the expression of p53 protein was decreased, and P15 increased; and levels of PTEN, p16, and p27 were evidently not changed. CONCLUSION: After being transfected with HCCR siRNA expression plasmid, the cell proliferation of HepG2 was arrested, while the apoptosis of HepG2 cells increased. Our results demonstrate the potential role of p53 and p15 in HCCR signaling.     

The role of XPB in cell apoptosis and viability and its relationship with p53, p21 and c-myc in hepatoma cells

BACKGROUND: Accumulation of DNA damage has been implicated in hepatocarcinogenesis. XPB plays a pivotal part in repairing damaged DNA. However, up to now, the biological effect of XPB on hepatoma cells remains elusive. MATERIALS AND METHODS: Here, we investigated the role of XPB in the apoptosis and the viability of hepatoma cells by using the terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end-labelling and cell viability assay; we also investigated their relationship with p53, p21(waf1/cip1) and c-myc by using the RT-PCR and Western blot. RESULTS: Compared with the control cells HepG2/pcDNA3.1 or HepG2, XPB-transfected HepG2 cells (HepG2/pcDNA3.1-XPB) displayed lower viability, weaker activity and higher apoptosis index. At the same time, an increased expression of p21(waf1/cip1) mRNA, protein and p53 protein in addition to a decreased expression of c-myc mRNA and protein were detected in HepG2/pcDNA3.1-XPB cells. CONCLUSIONS: Our results indicated that XPB could inhibit the proliferation of hepatoma cells and had a positive effect on the expression of p53 and p21(waf1/cip1) but a negative effect on c-myc.     

罗格列酮对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的配体罗格列酮（RSG）在体外对人肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法应用CCK-8比色法检测不同浓度（25、50、100、200μmol/L）RSG对肝癌HepG2细胞增殖的影响;应用Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率及分析细胞周期;实时荧光定量PCR法观察Bcl-2、Bax的mRNA表达;免疫细胞化学法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果RSG对肝癌HepG2细胞的增殖抑制率与浓度呈正相关。肝癌HepG2细胞的凋亡率与RSG浓度呈正相关;与对照组比较,加药组S期细胞百分率降低,G1期细胞百分率升高（P均〈0.05）。100、200μmol/L RSG组的凋亡细胞较对照组明显增加,且浓度越高增加越显著。RSG干预肝癌HepG2细胞后,Bcl-2的mRNA及蛋白表达在肝癌细胞中下调,而Bax的mRNA及蛋白在肝癌细胞中表达上调。结论RSG可通过激活PPARγ、调节Bcl-2和Bax的水平而在体外抑制肝癌细胞生长,并诱导其凋亡。     

siRNA干扰纤维蛋白原α链基因对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

背景：纤维蛋白原（FG）是由肝细胞合成、分泌的糖蛋白。除凝血和纤溶外,FG在细胞增殖、血管发生、肿瘤的发生、进展和转移中亦发挥重要作用。肝细胞癌患者血浆FG水平显著高于健康人。目的：观察以RNA干扰技术抑制FG仅链（FGA）基因对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法：构建FGAsiRNA干扰质粒,将重组质粒pU6．FGAsiRNA稳定转染入人肝癌细胞株HepG2,同时设置空质粒载体pU6转染组作为对照。以RT－PCR、蛋白质印迹法在mRNA和蛋白质水平验证干扰效果,以CCK－8实验和流式细胞术检测各组HepG2细胞的增殖和凋亡情况。结果：FGAsiRNA转染组HepG2细胞FGAmRNA和蛋白表达明显低于空载体转染组,细胞增殖显著受抑（P〈0．001）,细胞凋亡显著增加（P〈0．001）。结论：RNA干扰技术能有效下调人肝癌细胞的FGA表达,抑制肿瘤细胞生长增殖并促进其凋亡。FGA可能成为肝细胞癌治疗的潜在靶点之一。     

Guggulsterone induces apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells through intrinsic mitochondrial pathway

AIM: To investigate the effects of guggulsterone on the proliferation and apoptosis of human hepatoma Hep G2 cells in vitro and relevant mechanisms.METHODS: Human hepatocellular carcinoma Hep G2 cells and normal human liver L-02 cells were treated with different concentrations of guggulsterone(5-100 μmol/L) for 24-72 h. Cell proliferation was tested by MTT assay. Cell cycle and apoptosis were investigated using flow cytometry(FACS). Bcl-2 and Bax m RNA and protein expression was detected by real-time PCR and Western blot, respectively. TGF-β1, TNF-α, and VEGF contents were determined by ELISA.RESULTS: Guggulsterone significantly inhibited Hep G2 cell proliferation in a dose- and time-dependent manner. FACS showed that guggulsterone arrested Hep G2 cell cycle at G0/G1 phase. Guggulsterone induced apoptosis was also observed in Hep G2 cells, with 24.91% ± 2.41% and 53.03% ± 2.28% of apoptotic cells in response to the treatment with 50 μmol/L and 75 μmol/L guggulsterone, respectively. Bax m RNA and protein expression was significantly increased and Bcl-2 m RNA and protein expression was decreased. ELISA analysis showed that the concentrations of TGF-β1 and VEGF were significantly decreased and TNF-α concentration was increased.CONCLUSION: Guggulsterone exerts its anticancer effects by inhibiting cell proliferation and inducing apoptosis in Hep G2 cells. Guggulsterone induces apoptosis by activation of the intrinsic mitochondrial pathway.     

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨shRNA干预磷脂酰肌醇蛋白多糖（GPC）-3基因转录对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法将GPC-3-shRNA插入pGPU6／GFP／Neo质粒,转染人肝癌tlepG2细胞,以Western Blot和荧光定量PCR分别分析GPC-3蛋白和mRNA表达;以nTr法分析HepG2细胞增殖;以流式细胞术、Annexin—V—PE／7-AAD及细胞凋亡-DNA ladder等分析细胞周期及细胞凋亡率。结果shRNA1转染HepG2细胞,GPC-3mRNA沉默效率为89．3％,与GPC-3蛋白下调一致;以shRNA转染HepG2细胞,增殖抑制率为71．1％;细胞周期阻滞在G1期,细胞凋亡率达65．6％。结论资料显示shRNA干预GPC-3基因转录,可显著抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。