ADAM28反义核酸对人牙乳头细胞内ADAM28表达的影响

目的：探讨金属蛋白酶解离素28（ADAM28）反义核酸对人牙乳头细胞（HDPC）内ADAM28蛋白表达的影响。方法：应用反义核酸技术,设计并合成与ADAM28mRNA特异序列互补的AS-ODN和正义对照S-ODN转染HDPC后,通过免疫细胞化学、PCR和Westernblot检测细胞中ADAM28的表达差异。结果：ADAM28AS-ODN转RT-染HDPC后,在转录、翻译和蛋白水平细胞内ADAM28的表达均明显减弱,统计学分析有显著性差异（P〈0.01）。结论：应用ADAM28AS-ODN可有效封闭HDPC内ADAM28的表达,为进一步研究反义核酸在牙胚组织和细胞中的功能提供实验和理论依据。     

ADAM28真核表达质粒的构建及转染人牙囊细胞后的表达分析

目的:构建金属蛋白酶解离素28(ADAM28)真核表达质粒,转染人牙囊细胞(HDFC)后检测ADAM28在HDFC中的表达分布。方法:采用基因重组技术构建ADAM28真核表达质粒,通过细胞培养、脂质体Lipofectamine2000介导转染HDFC后,应用免疫荧光、RT-PCR及Western印迹检测ADAM28在HDFC中的表达。结果:成功构建并鉴定ADAM28真核质粒,瞬时转染HDFC72h后,检测证实真核质粒转染组的HDFC表达ADAM28蛋白,而2个对照组均无表达。结论:ADAM28在HDFC内能被正确翻译和表达,为进一步探讨其在牙源性细胞中的生物学功能奠定了基础。     

ADAM28基因在牙源性细胞中的表达分布

目的：探讨ADAM28在牙源性上皮和间充质细胞中的表达差异,明确其亚细胞定位情况.方法：采用免疫细胞化学、免疫荧光和RT-PCR技术,从蛋白和基因水平检测ADAM28在人牙乳头细胞（HDPC）、牙囊细胞（HDFC）、牙髓干细胞（HDPSC）、牙周膜细胞（HPDLC）和颈环上皮细胞（HDCLEC）的表达分布.结果：ADAM28在上述五种细胞的胞浆和胞膜上均有强弱不等的阳性表达.结论：ADAM28可能作为一种胞浆蛋白调控着牙源性细胞的增殖与分化,在牙胚发育中起重要作用.     

金属蛋白酶解离素28对人牙乳头细胞生物学特性的影响

目的:探讨金属蛋白酶解离素28(ADAM28)基因对人牙乳头细胞(HDPC)增殖、分化、凋亡的影响,并分析其可能的作用机制.方法:应用细胞培养、基因转染、MTT、流式细胞术(FCM)和酶动力学等方法,探讨ADAM28基因对HDPC生物学特性的影响,采用SPSS12.0软件包中的SNK检验进行统计学分析.结果:成功转染ADAM28真核质粒,真核质粒转染组HDPC的增殖活性、增殖指数、碱性磷酸酶(ALP)分泌活性显著高于空载体组、未转染组,而凋亡细胞百分比显著低于两对照组,P<0.01.结论:ADAM28可显著促进HDPC的增殖和ALP的分泌,显著抑制HDPC的凋亡.     

ADAM28反义核酸对人牙乳头细胞表达细胞外基质蛋白的影响

目的：研究金属蛋白酶解离素28（ADAM28）反义核酸（AS—ODN）转染人牙乳头细胞（HDPC）后，对其表达多种细胞外基质蛋白（BSP、OPN、DSPP、CollagenⅠ／Ⅲ）的影响。方法：采用细胞培养、基因转染、免疫细胞化学和图像分析技术检测ADAM28反义核酸对HDPC表达上述基质蛋白的影响。结果：ADAM28反义核酸转染HDPC后BSP、DSPP、CollagenⅠ的表达明显减弱（P〈0．01），OPN、Collagen Ⅲ的表达无明显变化（P〉0．05）。结论：ADAM28反义核酸可有效封闭人牙乳头细胞内BSP、DSPP、CollagenⅠ的表达，ADAM28基因对BSP、DSPP、CollagenⅠ的表达起显著的正向调节作用。     

ADAM28反义核酸对人牙乳头细胞增殖、分化和凋亡的影响

目的研究金属蛋白酶解离素28（ADAM28）反义核酸（AS-ODN）对人牙乳头细胞（HDPC）增殖、分化、凋亡等生物学特性的影响并分析可能的作用机制。方法采用细胞培养、基因转染、四唑盐（MTr）比色法、酶动力学法和流式细胞术（FCM）检测ADAM28反义核酸转染HDPC后对细胞生物学特性的影响。结果ADAM28 AS-ODN组HDPC的增殖活性、增殖指数、碱性磷酸酶（ALP）分泌活性显著降低,凋亡细胞百分比明显上升。结论ADAM28反义核酸可显著抑制HDPC的增殖和ALP的活性,显著诱导HDPC的凋亡并影响细胞周期的变化。     

ADAM28反义核酸对人牙囊细胞内ADAM28表达的影响

目的探讨金属蛋白酶解离素28(ADAM28)反义核酸对人牙囊细胞(HDFC)内ADAM28蛋白表达的影响。方法应用反义核酸技术,设计并合成与ADAM28 mRNA特异序列互补的AS-ODN和正义对照S-ODN转染HDFC后,通过免疫细胞化学、RT-PCR和Western blot检测细胞中ADAM28的表达差异。结果ADAM28 AS-ODN转染HDFC后,在转录、翻译和蛋白水平细胞内ADAM28的表达均明显减弱,统计学分析有显著性差异(P<0.01)。结论ADAM28 AS-ODN可有效封闭HDFC内ADAM28的表达。     

ADAM28基因原核表达载体的构建和在大肠杆菌中的融合表达

目的:利用消减杂交技术克隆出牙齿发育相关基因ADAM28。方法:本研究为构建ADAM28基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导其表达并纯化出ADAM28蛋白;采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出ADAM28基因的蛋白编码序列,克隆到中间载体pMD18-TVector中产生pMD18-T-ADAM28,再经双酶切得到ADAM28片段定向克隆到pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28;在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达,得到GST-ADAM28融合蛋白,并经SDS-PAGE电泳初步纯化。结果:①成功构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28,并经酶切鉴定、PCR鉴定和测序验证显示插入的ADAM28序列正确,阅读框架完整,未发现突变。②得到初步纯化的GST-ADAM28融合蛋白。经IPTG诱导后出现一条约35.3×103的新蛋白带。结论:ADAM28基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达并纯化,为进一步研究该蛋白质的功能打下基础。     

牙齿发育相关基因adam28多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备及鉴定抗ADAM28的多克隆抗体。方法采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出adam28基因的蛋白编码区序列,克隆到中间载体pMD18-T Vector中,再经双酶切得到adam28片段定向克隆到pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-adam28,在大肠杆菌中用IPTG进行诱导表达,得到GST-ADAM28融合蛋白,经过初步纯化及SDS-PAGE电泳,在35300的新蛋白带处直接割胶,作为抗原免疫新西兰大白兔后获取抗体。结果成功构建融合表达载体pGEX-4T-adam28,得到初步纯化的GST-ADAM28融合蛋白,免疫兔子1个月后,获得免疫血清,盐析法纯化得到多克隆抗体。Western印迹结果显示所得到的抗体具有较高的特异性,ELISA分析证实其效价可达1∶16000。结论成功制备出高效价的抗ADAM28多克隆抗体,为进一步研究ADAM28在牙齿发育中的作用和表达分布奠定基础。     

金属蛋白酶解离素28对人牙髓干细胞生物学功能的影响

目的:探讨金属蛋白酶解离素28(ADAM28)基因对人牙髓干细胞(HDPSCs)增殖、分化、凋亡特性的影响和可能的作用机制.方法:体外分离培养、鉴定人牙髓干细胞(HDPSCs),应用基因重组构建ADAM28真核表达质粒并转染HDPSCs,应用四唑盐(MTT)比色法、酶动力学法和流式细胞术(FCM)检测ADAM28对HDPSCs生物学特性的影响.应用免疫细胞化学和图像分析技术检测ADAM28对HDPSCs表达牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)的影响.采用SPSS13.0软件包的SNK检验进行统计学分析.结果:成功构建并转染ADAM28真核质粒,真核质粒转染组HDPSCs的增殖活性、增殖指数显著低于空载体组和未转染组,碱性磷酸酶(ALP)分泌水平及凋亡细胞百分比明显上升,差异显著(P＜0.05);HDPSCs内DSPP的表达水平显著提高(P＜0.05).结论:ADAM28可显著抑制HDPSCs增殖,促进ALP的分泌活性和HDPSCs内DSPP的表达,显著诱导HDPSCs的凋亡.     

ADAM28反义核酸治疗牙根发育不良疾病的实验研究

目的:探讨金属蛋白酶解离素28(ADAM28)反义核酸(AS-ODN)治疗牙根发育不良疾病(CHTR)的可行性和效果。方法:应用反义核酸技术、基因重组、动物实验和酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测ADAM28 AS-ODN、S-ODN和真核质粒对CHTR的不同效应。结果:用药后AS-ODN组患牙松动度明显减轻,牙周袋深度显著变浅,COL-Ⅱ、IL-1β、PGE2水平均显著下降,呈现炎症愈合趋势;S-ODN组和真核质粒组各项检测结果正相反,炎症呈显著上升趋势。结论:应用ADAM28 AS-ODN(200μmol/L)可有效治疗牙根发育不良疾病,但最佳药物浓度和用药时间还需进一步探讨。     

Influence of ADAM28 on biological characteristics of human dental follicle cells

Objectives

The aim of this study was to investigate the effects of a disintegrin and metalloproteinase 28 (ADAM28) on the biological characteristics of human dental follicle cells (HDFCs) and possible action mechanism.

Methods

Eukaryotic expression plasmid containing ADAM28 coding region and ADAM28 antisense oligodeoxynucleotides (AS-ODN) with FITC labelling were constructed and synthesised by gene clone and recombination. Then we respectively transfected them into HDFCs by Lipofectamine 2000 system and detected their effects on proliferation, differentiation and apoptosis of HDFCs by MTT assay, cell cycle detection, ALP activity and Annexin V-FITC/PI analysis. Finally we observed the effects of ADAM28 AS-ODN on HDFCs expressing extracellular matrix (ECM) proteins by immunocytochemical staining.

Results

ADAM28 eukaryotic plasmid was constructed and identified successfully, and could be correctly translated and expressed in HDFCs, furthermore overexpression of ADAM28 promoted the HDFCs proliferation and inhibited specific differentiation of HDFCs, while inhibition of ADAM28 exerted the opposite effects and induced apoptosis. Moreover ADAM28 could significantly inhibit the secretion of OPN and type III collagen of HDFCs.

Conclusions

ADAM28 might actively participate in the network regulation which associates HDFCs proliferation, differentiation, apoptosis with matrix mineralisation during tooth development by interacting with multiple signal molecules.     

ADAM28在成骨样细胞MC3T3-E1中的表达

目的:研究ADAM28在成骨样细胞MC3T3-E1中的表达。方法:采用细胞培养,免疫组化和免疫荧光染色方法检测ADAM28在成骨细胞中可能存在的机制。结果:ADAM28成功表达于小鼠MC3T3-E1成骨样细胞上,免疫组化和免疫荧光检测显示:ADAM28在MC3T3-E1上表达阳性,对照组与实验组间p<0.01,有显著性差异;荧光显微镜下,可见实验组显示较强的绿色荧光,阳性表达明显。结论:ADAM28可能通过参与成骨细胞的生物学活动来促进其细胞的增殖分化。