杜氏利什曼原虫cDNA文库的构建

目的 :建立杜氏利什曼原虫 cDNA文库 ,以获取个体基因表达产物和研究基因结构。方法 :以杜氏利什曼原虫四川人分离株 m RNA为模板 ,体外合成 cDNA,以噬菌体λgt11DNA为载体构建文库。结果 :共获 2× 10 6重组子 ,插入比例为 4 8%。文库经抗杜氏利什曼原虫前鞭毛体全虫兔抗血清筛选 ,共筛 2× 10 4重组子 ,获 3个阳性表达克隆 ,表达产物的分子量分别为 :136k Da、160 k Da和 148k Da。结论 :已构建成的表达型杜氏利什曼原虫 cDNA文库 ,其插入比例和表达效率均较高。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体表达抗原的Western blot和MALDI-TOF/TOF分析

目的鉴定杜氏利什曼原虫无鞭毛体特异表达抗原。方法培养杜氏利什曼原虫前鞭毛体并体外转化无鞭毛体,其总蛋白经2-DE电泳后以小鼠抗杜氏利什曼原虫无鞭毛体血清进行Western blot,对前鞭毛体与无鞭毛体特异表达抗原蛋白进行MALDI-TOF/TOF串联质谱鉴定。重组表达无鞭毛体特异表达抗原编码基因,以Western blot法对重组蛋白进行鉴定。结果等量的杜氏利什曼原虫前鞭毛体与无鞭毛体蛋白经2-DE电泳均可呈现680~742个蛋白点,Western blot及MALDI-TOF/TOF-MS分析甘油醛3-磷酸脱氢酶与延伸因子2为杜氏利什曼原虫前鞭毛体特异表达抗原,核苷二磷酸激酶为无鞭毛体特异表达抗原。重组核苷二磷酸激酶编码基因表达产物经Western blot证实为杜氏利什曼原虫无鞭毛体特异表达强抗原。结论杜氏利什曼原虫前鞭毛体与无鞭毛体抗原表达存在差异,核苷二磷酸激酶为杜氏利什曼原虫无鞭毛体特异表达强抗原。     

不同种株利什曼原虫的比较蛋白质组学分析

目的观察不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质表达状况。方法制备杜氏利什曼原虫四川SC6株、杜氏利什曼原虫四川SC10株和硕大利什曼原虫5ASKH株前鞭毛体总蛋白,以pH范围3-10的预制胶条进行双向电泳(2-D),考马斯亮蓝染色,PDQust软件分析凝胶,主要差异蛋白点用电喷雾质谱法进行鉴定。结果等量的杜氏利什曼原虫四川SC6株、杜氏利什曼原虫四川SC10株和硕大利什曼原虫5ASKH株前鞭毛体总蛋白均获近700个蛋白点,不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质2-D图谱中,14蛋白点呈恒定差异表达,从中鉴定出10个功能明确的蛋白质,分别具有下列生物功能:糖代谢与磷脂合成(烯醇酶、变旋酶、NADP依耐乙醇脱氢酶、乙醇胺磷酸胞苷酸转移酶),压力反应(细胞内过氧化物酶、锥虫还原蛋白过氧化物酶),细胞膜/细胞骨架(α-微管蛋白、β-微管蛋白),核酸代谢(琥珀酰辅酶A连接酶(GDP形成)、内源性RNA酶L-PSP(pb5)),细胞周期与增殖(延伸因子2)。结论不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质的表达存在不同,为理解不同种株利什曼原虫的毒力、免疫原性和代谢特征提供了新的视角。     

利什曼原虫前鞭毛体体外生长动力学研究

目的观察不同种株利什曼原虫前鞭毛体在体外培养条件下的生长增殖情况，确定其最适体外培养条件。方法分别使用RPMI1640和M199复合培养液，观察温度、pH及新生小牛血清对硕大利什曼原虫、热带利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、墨西哥利什曼原虫、杜氏利什曼原虫前鞭毛体体外增殖速度与增殖周期的影响。结果当培养温度为26℃时，杜氏利什曼原虫前鞭毛体在含和不含新生小牛血清、pH中性、偏碱和偏酸的PMI1640或M199复合培养基中，早期均能生长，且生长周期相对较长，其他种株利什曼原虫前鞭毛体在无血清或偏碱培养基中生长缓慢，增殖周期缩短；培养温度为37℃时，各种株利什曼原虫前鞭毛体均发生沉积，增殖停滞，不同程度地向无鞭毛体转化并发生死亡。结论使用复合培养液培养利什曼原虫前鞭毛体，温度、pH和新生小牛血清均可显著影响增殖速度和生长周期。各种株利什曼原虫前鞭毛体在相同培养条件下增殖速度和生长周期存在差异，可能与其遗传背景不同有关。     

犬血清的免疫复合物去补体用作诊断内脏利什曼的补体结合试验

犬血清经56℃灭活后,常出现抗补体影响补体结合试验(CF)的效果。作者用抗羊红细胞抗体吸收犬血清中的补体后进行CF试验。病犬血清采自感染杜氏利什曼原虫无鞭毛体的雄性牧羊犬。感染后每周或隔周采血,直至12周。血清保存于-20℃。以杜氏利什曼原虫肯尼亚株和巴西利什曼巴拿马亚种新大陆株的前鞭毛体和无鞭毛体,经冻融、     

不同种（株）利什曼原虫毒力相关基因的表达差异

目的 观察不同种（株）利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的毒力相关基因表达情况。 方法 制备杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、热带利什曼原虫、硕大利什曼原虫和墨西哥利什曼原虫等5种7株利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的总RNA,采用半定量RT-PCR法,以α-微管蛋白基因和3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）作为阳性对照,根据GenBank公布的GDP甘露糖焦磷酸酶基因（GDPMP）、A2抗原相关蛋白基因（A2rel）、脂磷酸多糖合成蛋白1基因（LPG1）、脂磷酸多糖合成蛋白2基因（LPG2）、动基体膜蛋白11基因（KMP-11）、胱氨酸蛋白酶C基因（CPC）、亲水性酰化表面蛋白B1基因（HASPB1）、胱氨酸蛋白酶2基因（CPB2）、胱氨酸蛋白酶B2.8基因（CPB2.8）和热激蛋白100基因（CLP b）等毒力相关基因的核苷酸序列,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,分析以上各基因在各种（株）前鞭毛体和无鞭毛体中的表达情况。 结果 各毒力基因在不同种（株）利什曼原虫的前鞭毛体和无鞭毛体中的表达明显不同,HASPB1基因在7个种（株）利什曼原虫的无鞭毛体和杜氏利什曼原虫前鞭毛体中均表达,GDPMP、LPG1、LPG2、CPB2.8、CPB2、A2rel和CLP基因分别在特定种（株）的前鞭毛体和/或无鞭毛体中表达,CPC基因仅在杜氏利什曼原虫SC10株和硕大利什曼原虫无鞭毛体内表达,KMP-11基因在7个种（株）利什曼原虫前鞭毛体或无鞭毛体内均不表达。 结论 毒力相关基因的表达存在种特异性和期特异性。     

山丘疫区杜氏利什曼原虫核糖体基因内转录间隔区的克隆及序列分析

目的　构建我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株前鞭体核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)片段克隆,并进行测序及同源性分析。　方法　提取杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA进行PCR扩增,将扩增出rDNAITS片段克隆入pMD18 Tvector上,双脱氧链末端终止法测序。　结果　扩增出约 1000bp的rDNAITS片段。测序结果表明山丘疫区的2株利什曼原虫L.d.SC10和L.d.6分别为1027bp和1028bp。序列分析结果表明,L.d.SC10和L.d .6有一定差异。　结论　获得了我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株L.d.SC10和L.d.6的前鞭体rDNAITS序列。     

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因。方法PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L．d．SC10H2与四川南坪犬株L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因,将该基因导入pcDNA3．1( ),构建真核表达重组质牲,转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达;RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达,结果2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因。同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting,在相对分子质量(Mr)约20000处检测到阳性杂交信号,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。结论获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L．d．SC10H2和L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因序列,并在NIH3T3细胞中稳定表达。     

热带利什曼原虫的特异性单克隆抗体:期及种特异性抗原的特性

本文报道以热带利什曼大型亚种前鞭毛体膜的单克隆抗体对热带利什曼种团及杜氏利什曼种团各10株共20株原虫的膜或完整的前鞭毛期,进行了间接放射免疫,免疫荧光及免疫沉淀等方法的测定。各种原虫的前鞭毛体是用Schneider’s Drosophlia培养基保存的,无鞭毛体则从感染BALB/c雌性小鼠取得。原虫混悬于pH7.3含40mM NaCl,10mM乙二胺四乙     

杜氏利什曼原虫前鞭毛体排泄因子抗原类型的初步研究

利用丙酮提取的排泄因子抗原与前鞭毛体免疫家兔血清以双向免疫扩散法对一株从新疆喀什地区黑热病人分离的杜氏利什曼原虫,一株自陕北病犬中分离的杜氏利什曼原虫,一株由新疆荒漠地区硕大白蛉吴氏亚种消化道中分离的杜氏利什曼原虫和一株沙鼠利什曼原虫进行抗原分析的结果表明,这四株利什曼原虫的排泄因子抗原具有两种不同的抗原成分——P和G。其中喀什绿洲地区黑热病与陕北犬株利什曼原虫均具有P成分,荒漠型黑热病杜氏利什曼原虫具有P和G两种成分。本文讨论了这一初步分型结果的生物学和流行病学意义。     

人内脏利什曼病:对杜氏利什曼原虫恰氏亚种多肽体液免疫反应特异性的分析

作者用免疫血清对杜氏利什曼原虫前鞭毛体可溶性抗原进行免疫结合分析。从巴西病人分离出的杜氏什曼原虫恰氏亚种前鞭毛体,在双     

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的 克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因。 方法 PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L.d.SC10H2与四川南坪犬株L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因，将该基因导入pcDNA3.1（+），构建真核表达重组质粒，转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达；RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达。 结果 2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因，同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光，表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting，在相对分子质量（Mr）约20 000处检测到阳性杂交信号，表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。 结论 获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L.d.SC10H2和L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因序列，并在NIH3T3细胞中稳定表达。     

杜氏利什曼原虫激活蛋白激酶C受体的基因克隆化与序列分析

目的　克隆杜氏利什曼原虫 (LeishmaniadonovaniLd) 1S株激活蛋白激酶C受体 (RACK ,receptorofactivatedpro teinCkinase)的编码基因 ,为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗的研究奠定基础。方法　体外培养杜氏利什曼原虫 1S株无鞭毛体 ,常规方法提取制备基因组DNA。以硕大利什曼原虫 (Leishmaniaamjor)的RACK基因的核苷酸序列为参照 ,设计并合成利什曼原虫RACK基因序列特异性的引物。以杜氏利什曼原虫的基因组DNA为模板 ,利用多聚酶链反应(PCR)技术 ,扩增获得了杜氏利什曼原虫RACK的全长编码基因。结果　基因序列测定结果表明 ,杜氏利什曼原虫 1S株RACK基因序列长度为 981bp ,开放读码框架由 831bp组成 ,编码产物为 2 76个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫 1S株的RACK基因与来源于硕大利什曼原虫的RACK基因序列同源性达 98% (2 6 4 / 2 6 7)。结论　本研究克隆了杜氏利什曼原虫的RACK基因 ,为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行杜氏利什曼原虫的基因疫苗研究奠定了基础     

草原兔尾鼠（Lagurus lagurus）对利什曼原虫敏感性的初步观察

本文报道了用杜氏利什曼和都兰利什曼两种原虫，进行人工感染草原兔尾鼠的初步结果。杜氏利什曼９１１株腹腔接种动物三个月后剖检，发现以５×１０７个原虫／０．２ｍｌ／只接种的５只鼠，有３只感染；９０１株以５×１０７个原虫／０．２ｍｌ／只无鞭毛体接种４只中有３只感染，前鞭毛体接种７只中４只感染；都兰利什曼原虫前鞭毛体同样剂量接种７只中２只足垫出现皮肤损害，涂片上查到大量原虫，而内脏无感染。提示草原兔尾鼠可能是黑热病的一种敏感的实验动物。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建

目的 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。方法 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1（＋）,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。结果 扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确。结论 成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。     

不同利什曼原虫分离株在培养基中生长繁殖观察

目的　比较我国不同类型内脏利什曼病流行区利什曼原虫前鞭毛体在不同培养基中的生长繁殖情况,为选择合适培养基用于利什曼原虫培养提供实验依据。方法　将3 ×105个KS?2、Cy、JIASHI?5株利什曼原虫前鞭毛体分别接种至1 mL NNN培养基、1 mL M199 + 20%胎牛血清培养基、1 mL M199 + 20%马血清培养基及1 mL 脑心浸液培养基（含血红素）中,22 ℃温箱中无菌静置培养,显微镜下连续观察计数8 d,绘制3株利什曼原虫前鞭毛体的生长曲线。 结果 KS?2、Cy、JIASHI?5株利什曼原虫前鞭毛体均能在NNN培养基、M199 + 20%胎牛血清培养基和M199 + 20%马血清培养基中生长繁殖,在NNN培养基中培养不同时间后的3株利什曼原虫前鞭毛体计数均显著高于M199 + 20%胎牛血清培养基和M199 + 20%马血清培养基（P均 < 0.05）,在这3种培养基中培养不同时间后的KS?2株利什曼原虫前鞭毛体计数均显著高于Cy和JIASHI?5株（P均 < 0.05）。KS?2、Cy、JIASHI?5株利什曼原虫前鞭毛体均不能在脑心浸液培养基中生长繁殖。结论　分离自我国不同类型内脏利什曼病流行区的利什曼原虫在同一培养基中生长增殖速度有差异,同一利什曼原虫分离株在不同培养基中的生长繁殖速度亦有差异。NNN培养基是最适合我国内脏利什曼病流行区利什曼原虫分离株的培养基。     

不同利什曼原虫分离株在培养基中生长繁殖观察

目的　比较我国不同类型内脏利什曼病流行区利什曼原虫前鞭毛体在不同培养基中的生长繁殖情况，为选择合适培养基用于利什曼原虫培养提供实验依据。方法　将3 ×105个KS?2、Cy、JIASHI?5株利什曼原虫前鞭毛体分别接种至1 mL NNN培养基、1 mL M199 + 20%胎牛血清培养基、1 mL M199 + 20%马血清培养基及1 mL 脑心浸液培养基（含血红素）中，22 ℃温箱中无菌静置培养，显微镜下连续观察计数8 d，绘制3株利什曼原虫前鞭毛体的生长曲线。 结果 KS?2、Cy、JIASHI?5株利什曼原虫前鞭毛体均能在NNN培养基、M199 + 20%胎牛血清培养基和M199 + 20%马血清培养基中生长繁殖，在NNN培养基中培养不同时间后的3株利什曼原虫前鞭毛体计数均显著高于M199 + 20%胎牛血清培养基和M199 + 20%马血清培养基（P均 < 0.05），在这3种培养基中培养不同时间后的KS?2株利什曼原虫前鞭毛体计数均显著高于Cy和JIASHI?5株（P均 < 0.05）。KS?2、Cy、JIASHI?5株利什曼原虫前鞭毛体均不能在脑心浸液培养基中生长繁殖。结论　分离自我国不同类型内脏利什曼病流行区的利什曼原虫在同一培养基中生长增殖速度有差异，同一利什曼原虫分离株在不同培养基中的生长繁殖速度亦有差异。NNN培养基是最适合我国内脏利什曼病流行区利什曼原虫分离株的培养基。     

用于免疫诊断的杜氏利什曼种特异性单克隆抗体的生产及鉴定

以杜氏利什曼原虫(WR352,WRI168c或Edmael)前鞭毛体膜伍用弗氏不完全佐剂免疫小鼠的脾细胞与NS-1瘤细胞融合,获16株单克隆抗体。以亲和纯化的~(125)I标记的兔抗鼠抗体的F(ab′)2对利什曼原虫前鞭毛体膜进行间接放射免疫结合试验。前鞭毛体     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体分裂过程的电镜观察

为了探索杜氏利什曼原虫无鞭毛体在巨噬细胞内存活规律,本文用透射电镜对它在巨噬细胞内分裂繁殖特点进行较为详细观察。 材料来自感染灰色地鼠肝、脾组织。 杜氏利什曼原虫无鞭毛体的分裂首先以新鞭毛轴丝形成和动基体DNA纤丝伸长开始,细胞质内出现电子致密的微管形成中心,从此处形成新的鞭毛轴丝,随之新形成的鞭毛轴丝挤进扩张的鞭毛鞘中,使2个     

田鼠巨噬细胞的体外粘附试验不能区分杜氏利什曼前鞭毛体有无感染性

作者用有感染性和无感染性的杜氏利什曼原虫前鞭毛体与田鼠的脾、淋巴结和腹膜渗出物中的巨噬细胞,在体外进行粘附试验。杜氏利什曼原虫IS株按照Stanber法用田鼠保种。前鞭毛体在肝浸胰胨(LIT)培养基或含20%灭活胎牛血清的Schueider培养基中置于27℃培养,当它们静止6～8天后收集。每ml培养基接种10~6个脾的无鞭