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2.
目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒载体,使CD基因只能在端粒酶阳性的细胞表达.方法:采用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定.分别将腺病毒感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,MTT法检测受染细胞的存活率.结果:构建的重组腺病毒中带有hTERT启动子及CD基因.用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P<0.01).结论:本实验构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力. 相似文献
3.
目的:构建靶向结肠癌细胞的人端粒酶逆转录酶HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒并对该表达体系进行鉴定。方法:根据GenBank中的HTERT启动子(HTERTp)序列设计引物,以人胚肾293细胞提取基因组DNA为模板,PCR扩增HTERTp,并将HTERTp序列克隆入pDC312质粒中,构建成HTERTp调控的腺病毒质粒pSG—HTERTp;NK4 cDNA酶切并回收克隆至pSG—HTERTp载体中,构建成pSG—HTERTp/pA—NK4穿梭质粒,脂质体法在293细胞中包装重组腺病毒;噬斑分析法筛选单克隆重组腺病毒;RT-PCR检测NK4基因的转录;Western Blot检测NK4蛋白的表达。结果:成功构建出成功构建出HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒,滴度为4.5×10^9空斑形成单位(pfu)/mL,且PCR扩增及western bolt电泳均呈阳性表达。结论:成功构建出HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒,为进一步研究NK4基因的作用机制打下实验基础。 相似文献
4.
目的:构建在人端粒酶逆转录酶(hTERT)核心启动子引导钠碘转运体(NIS)基因的重组腺病毒。方法:PCR扩增目的片断;通过荧光分析实验,选取启动效果最好的hTERT启动子片断;建立3个重组腺病毒:Ad—hTERT—NIS、Ad—CMV—NIS及Ad—CMV-TPO,培养胶质瘤细胞系U87、U251及细胞系MRC-5(正常人胚胎成纤维细胞系),然后转染病毒并进行westem bolt分析等实验。结果:胶质瘤细胞U87及U251中端粒酶为阳性,hTERT启动子片段204启动效率比较其他片段效率高。该启动子片段可以引导NIS基因的靶向性表达。结论:成功构建在hTERT核心启动子引导NIS基因的Ad—hTERT—NIS及重组腺病毒Ad—CMV—NIS和Ad-CMV—TPO,该重组腺病毒转染胶质细胞U87和U251后能成功表达NIS及TPO基因。 相似文献
5.
目的构建由具有肿瘤特异性启动作用的端粒酶逆转录酶启动子(mTERT-promotor)驱动m4-1BBL(CD137Ligand)基因的腺病毒载体。方法用PCR和RT-PCR的方法,分别从C57BL/6小鼠组织中克隆mTERT启动子和共刺激分子m4-1BBL基因,通过T载体和转移载体将目的基因亚克隆到腺病毒载体上,293A细胞包装成病毒颗粒rAD-mTERT-m4-1BBL,流式细胞仪检测m4-1BBL基因在Hepa1-6及L929细胞上的表达。结果通过PCR检测、直接测序证实目的基因克隆成功并亚克隆到表达载体上,细胞免疫化法证实病毒包装成功,流式细胞仪检测发现重组腺病毒载体rAD-mTERT-m4-1BBL能特异性地在肿瘤细胞Hepa1-6上高表达m4-1BBL。结论由mTERT-promotor驱动m4-1BBL基因的具有肿瘤特异性的腺病毒载体构建成功,为下一步进行体内外抗肿瘤实验打下了基础。 相似文献
6.
目的探讨由人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒对卵巢癌细胞的选择性杀伤作用。方法将自行构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的重组腺病毒分别感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,通过MTT法检测受染细胞的存活率,观察分析腺病毒载体对细胞的杀伤作用。结果用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P<0.01)。结论本实验构建的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力。 相似文献
7.
hTERT启动子调控下HSV-tk/GCV系统对人卵巢癌细胞系Skov3的杀伤作用 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 探讨hTERT启动子驱动下的HSV-tk/GCV系统对人卵巢癌细胞系Skov3的体外杀伤作用。方法 应用分子生物学方法构建hTERT启动子调控下的tk基因真核表达载体pBTdel-279-tk,并应用脂质体转染法将之转入Skov3、正常人卵巢上皮细胞(NOEC)和人胚肺成纤维细胞中,加入GCV,用MTT法和流式细胞术检测pBTdel-279-tk/GCV系统对各种细胞的杀伤作用;应用RT-PCR法检测pcDNA3-tk和pBTdel-279-tk转染前后卵巢癌细胞和正常细胞中tk基因的表达情况。结果 pBTdel-279-tk/GCV对端粒酶阳性的卵巢癌细胞有明显的杀伤作用,而对端粒酶阴性的正常细胞则无;hTERT启动子系统诱导卵巢癌细胞凋亡的效能与CMV启动子近似,两者差别无显著性意义。pcDNA3-tk转染后,在Skov3细胞和NOEC中均可探测到tk基因;而pBTdel-279-tk转染后只有Skov3可探测到tk基因,NOEC中则无。结论 hTERT启动子调控下的tk基因治疗是一种新的卵巢癌靶向治疗方法,具有更高的特异性和高效性。 相似文献
8.
目的 构建携带人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量. 相似文献
9.
目的构建含Survivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并进行鉴定,为肿瘤基因治疗的研究奠定基础。方法应用分子克隆技术将Survivin启动子连接至pLRIGl-GFP上构建出pEGFP-Surp-LRIGl,将其与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbhge3通过Lipofectamine2000共转染至人胚肾293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl。Ad-Surp-LRIGl在人胚肾293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度。结果 pEGFP-Surp-LRIGl经酶切鉴定正确,扩增得到的Ad-Surp-LRIGl经PCR扩增证实为Survivin启动子驱动的LRIG1重组腺病毒,滴度为2.3×1010pfu/ml。结论成功构建出含有Sur-vivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并鉴定正确,可用于下一步膀胱癌基因治疗的研究中。 相似文献
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目的 构建鼠源性内皮抑素(mEndostatin)重组腺病毒真核表达载体,为下一步研究其在体外表达及动物实验研究提供基础。方法 以mEndostatin质粒为模板通过PCR方法扩增回收mEndostatin,并在其5'端引入M-成瘤蛋白信号肽。将mEndostatin连接到腺病毒载体pCA13中,构建pCA13-mEndo表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒pBGHE3通过Lipofectamine 2000共同转染293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-mEndo。纯化后重组腺病毒Ad-mEndo在293细胞大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化、测定其滴度。结果 扩增得到的mEndostatin经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序证实为鼠源性内皮抑素,重组腺病毒Ad-mEndo的滴度为6.3×1010 pfu/ml。结论 该实验为今后研究重组腺病毒mEndostatin用于恶性肿瘤的基因治疗打下了基础。 相似文献
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目的:应用 AdEasyTM 腺病毒载体系统构建含人 NME1基因的重组腺病毒,检测 NME1基因在肺癌细胞的表达。方法从人肝脏标本克隆带有 KpnⅠ,XhoⅠ双酶切位点的 NME1cDNA,利用细菌体内同源重组法将 NME1正向连接至腺病毒载体上,测序鉴定正确后,于 QBI-293A 细胞中包装扩增,TCID 50法检测重组腺病毒滴度,重组腺病毒转染至肺癌细胞 GLC-82,检测 NME1在细胞内表达。结果肝脏组织克隆出470bp 条带,测序与 NME1编码序列相符,测得重组腺病毒滴度为10^10 TCID 50/ mL ,免疫实验显示 NME1在 GLC-82细胞成功表达。结论成功构建含人 NME1基因的重组腺病毒并转染肺癌细胞,检测到 NME1在肺癌细胞中正常表达。 相似文献
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目的构建小鼠白介素-10(mIL-10)重组腺病毒真核表达载体,为其体外表达及动物体内试验研究提供依据。方法以pORF5-mIL-10质粒为模板通过PCR方法扩增回收mIL-10,将其定向连接到腺病毒载体pSGCMV中,构建pSGCMV-mIL10质粒。此质粒与5型腺病毒质粒pBGHE3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,经同源重组产生重组复制缺陷型腺病毒Ad5-mIL-10。纯化后Ad5-mIL-10在293细胞大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测定其滴度。结果扩增所得mIL-10经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序均证实为小鼠白介素-10,重组腺病毒Ad5-mIL-10经PCR鉴定正确,滴度达2.5×1010pfu/ml。结论成功构建了Ad5-mIL-10重组腺病毒载体系统,为研究IL-10在临床移植中的免疫学作用及基因治疗奠定基础。 相似文献
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目的构建同时表达具有抗原表位FLAG标记的骨形态发生蛋白2(BMP2)目的蛋白和报告分子绿色荧光蛋白(GFP)的新型腺病毒真核细胞表达载体。方法将去除翻译终止密码子并添加新的酶切识别住点XhoI的BMP2基因定向连入腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV—IRES—hrGFP-1。携带BMP2*基因的重组腺病毒穿梭质粒经酶切鉴定、PmeI酶切线性化后转化BJ5183-AD-1大肠杆菌,利用细菌内同源重组机制将BMP2+和GFP基因连同其顺势表达元件重组入腺病毒基因组质粒。用PacI酶切去除其质粒成分,暴露腺病毒基因组的反向末端重复序列,转染293细胞,进行腺病毒的包装,完成新型腺病毒载体AdCMV—BMP2+-IRES—GFP-1的构建。作为阳性对照,同时制备多年来广为应用的BMP2腺病毒表达载体AdCMV—BMP2。以两种载体感染骨髓基质细胞,通过RT—PCR和荧光显微镜分别检测骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白表达情况;通过碱性磷酸酶活性检测判断BMP2诱导成骨分化作用。结果突变后骨形态发生蛋白2基因序列、重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒质粒酶切图谱符合预定设计。感染骨髓基质细胞后,新型腺病毒载体可同时表达报告分子GFP和具有诱导成骨分化活性的BMP2。结论成功构建表达BMP2的新型腺病毒载体。 相似文献
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目的构建含PTEN基因的重组腺病毒载体,为PTEN进行肺腺癌的基因治疗奠定基础。方法用PTEN引物VT415和VT416扩增PTEN基因后,分别用EcoRⅠ+SalⅠ双酶切PCR-PTEN和PSUCMV,回收并纯化PTEN cDNA小片断和PSUCMV的大片断,使两者连接获得含有PTEN基因的重组穿梭质粒载体PSUCMV-PTEN;采用细胞内同源重组方法构建PTEN基因重组腺病毒载体,将质粒PSUCMV-PTEN与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbghe3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,经PCR鉴定,扩增病毒,氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩,测定病毒滴度。结果经双酶切和PCR进行鉴定,经鉴定正确的腺病毒命名为VSUCMV-PTEN,TCID_(50)法测定病毒滴度为1.0×10^10pfu/ml。结论成功构建了含PTEN基因的重组腺病毒载体Ad-PTEN,为下一步体内外实验证实PTEN对肺癌的抑制作用研究打下基础。 相似文献
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目的 构建携带人血管内皮生长因子 16 5 (hVEGF165)基因的重组腺病毒载体。方法 将hVEGF165cDNA亚克隆到腺病毒中间载体pACCMV·pLpA ,再与pJM17共转染人胚肾 2 93细胞 ,获得载hVEGF165基因的复制缺陷型重组腺病毒 ,感染体外培养的兔主动脉血管平滑肌细胞 (VSMC) ,通过RT PCR和Westernblot检测VEGF表达情况 ,并观察表达产物VEGF对人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)增殖的影响。结果 重组腺病毒感染VSMC 4 8h后有VEGFmRNA转录及蛋白质的表达 ,并呈剂量依赖性地促进HUVEC增殖。结论 构建的重组腺病毒载体在VSMC中能够有效表达目的基因 ,且能有效促进HUVEC增殖 ,为hVEGF165基因的实际应用奠定了基础。 相似文献
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Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector Containing the hVEGF165 Gene 总被引:3,自引:0,他引:3
Thedevelopmentofgene therapieshas renderedits clinical application feasible.Vascular endothelialgrowth factor( VEGF) hasbeen approved to be usedfor clinical trials.VEGF plays an important role inangiogenesis and prevention of restenosis[1-8] ,butthelow efficiency of plasmid vector restricts its clinicalapplication.In this study,the h VEGF165c DNA wassubcloned into p ACCMV .p Lp A and subsequentlythis recombinant was co- transfected into 2 93cellswith p JM1 7to obtain the replication- … 相似文献
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目的应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠窖蛋白-1(caveolin-1)编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-caveolin-1。方法将质粒pTRE2-caveolin-1中的小鼠caveolin-1编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-caveolin-1,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组。筛得的病毒质粒pAd-caveolin-1经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒。荧光显微镜观察绿色荧光表达。扩增并纯化病毒,测定病毒滴度和重组病毒插入片段的序列。结果重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带caveolin-1基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,caveolin-1基因测序鉴定与GenBank中公布序列一致。重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/mL。结论应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-caveolin-1,通过该系统携带的绿色荧光蛋白(GFP)标记基因可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究caveolin-1在牙齿发育中的作用奠定了基础。 相似文献
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目的构建EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cD-NA,采用剪接式重叠延伸(spliced overlap exetension,SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack-CMV质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因Z2A真核表达载体pAd-Z2A。经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-Z2A。结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到长31kb和4.5kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;从感染重组腺病毒vAd-Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体,为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。 相似文献
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目的:利用细菌内同源重组法构建含人肿瘤特异性抗原的腺病毒质粒。方法:设计NY-ESO-1 cDNA扩增引物,从pET15b-NY-ESO-1质粒中扩增NY-ESO-1的DNA序列,与pShuttle-IRES-hrGFP-2进行连接,PCR和EcoRⅤ酶切鉴定重组质粒pShuttle-NY-ESO-1-EGFP,经Pm eⅠ酶切线性化后,转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-NY-ESO-1-EGFP;质粒经PacⅠ酶切鉴定,DNA测序。结果:线性化的pShuttle-NY-ESO-1-EGFP转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183大肠杆菌,重组质粒经酶切获得一大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,PCR反应扩增出了340 bp的片段。结论:用细菌内同源重组法成功地构建了含NY-ESO-1的重组腺病毒质粒,为进行表达NY-ESO-1的重组腺病毒的制备及肿瘤特异性抗原NY-ESO-1的核酸疫苗在肿瘤方面的研究奠定了基础。 相似文献