小鼠肝癌肿瘤浸润性淋巴细胞抗瘤活性的研究

作者对小鼠肝癌肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)的抗瘤活性进行了初步研究。结果表明,新鲜分离的TIL对自身肝癌细胞的杀伤效应很低,经与IL-2共育后显著提高。培养10～30天达高峰,以后开始下降,灭活自身肿瘤细胞的再刺激,可对抗这种下降趋势。TIL对自身肝癌细胞的杀伤后性明显强于LAK细胞(P<0.01),并且表现为较强的肿瘤特异性,即对自身肿瘤细胞的杀伤明显强于对其它肿瘤的杀伤。将TIL与肿瘤细胞混合(10:1)注入小鼠皮下,肿瘤细胞的生长受到明显抑制。上述结果提示,TIL可望成为肿瘤过继免疫治疗中较LAK细胞更有效的活性细胞。     

脂质体介导的基因转染效率与肺癌细胞的增殖特性的关系

目的：简化粘附性LAK（A－LAK）细胞的制备方法并观察其与苯乙酸（PA）的协同抗瘤作用。方法：采用苯丙氨酸甲酯（PME）处理肝癌患者外周血单个核细胞（PBMC）而制备A－LAK细胞;观察人肝癌SMMC7721细胞株经PA处理后增殖能力的变化;并用经PA预处理的SMMC7721培养上清液作用于A－LAK细胞,观察A－LAK增殖能力与杀伤活性的变化。结果：采用PME制备的A－LAK细胞,其增殖能力显著高于非粘附性LAK细胞（NA－LAK）和常规LAK细胞;肿瘤细胞经PA作用后,生长明显受 到抑制;肿瘤细胞的培养上清液可明显抑制A－LAK的增殖与杀伤活性,而经苯乙酸预处理的上清液则抑制作用减弱。结论：采用PME可 简便快速地制备A－LAK,而苯乙酸可与A－LAK协同发挥抗瘤作用。     

无血清培养基对体外激活的A-NK细胞的支持作用

目的多方面比较无血清培养基AIMV与完全培养基对体外细胞因子激活的NK细胞的支持作用.方法分别用AIMV及完全培养基培养粘附NK细胞(A-NK)和非粘附NK细胞(NA-NK),比较细胞的增殖能力、杀伤肿瘤细胞的能力、表达粘附分子CD11c的能力.结果与完全培养基培养细胞相比,AIMV培养细胞增殖能力、杀伤肿瘤细胞的能力、表达CD11c的能力与之相当;在同一培养条件下A-NK细胞的增殖能力、杀伤活性高于NA-NK细胞.结论无血清培养基可替代完全培养基用于A-NK细胞的培养;A-NK细胞用于治疗肿瘤的过继免疫疗法要优于NA-NK细胞.     

CIK细胞体内外抗肝癌细胞作用

目的：研究肝癌患者CIK（cytokine-induced killer) 细胞的体外杀伤自体肝癌原代细胞的细胞毒活性以及正常人CIK细胞在裸鼠体内的抗肿瘤作用。方法：分别分离获得肝癌患者和下人的外周血单个核细胞（PBMC）,加入细胞因子,体外诱导成CIK细胞,用流式细胞仪对细胞作动态表型分析,并与正常人的CIK细胞作对比。用^51Cr释放法,测定肝癌患者的CIK细胞体外杀伤自体肿瘤细胞的细胞毒性活性。在Balb/c裸鼠皮下接种肝癌细胞BEL－7402,观察CIK细胞对荷瘤鼠的抑瘤作用,并与LAK、PBMC细胞相对比。结果：肝癌患者的CIK细胞体外增殖力强,至培养28天时达到最大增值倍数300多,表型分析结果表明,CD^3 CD56^ 双阳性细胞得到了大量的扩增,其含量由原来的0．23％上升到第21天的17．8％。体外实验表明,肝癌患者的CIK细胞杀伤自体原代肝癌细胞的细胞毒性活性明显高于自体的PBMC细胞。裸鼠体内实验表明,肝癌患者的CIK细胞能够显著抑制肿瘤的生长,其抑瘤率可达84．7％,高于LAK细胞的52．8％及PBMC的37．1％（P＜0．05和P＜0．01）。结论：CIK细胞具有较强的体内外抗肝癌细胞活性,有可能应用于临床上肝癌的过继性免疫治疗。     

人LI-LAK细胞和环磷酰胺对小鼠S_(180)肉瘤的体内外抗瘤作用

本文用人LI—LAK细胞作了对小鼠S_(180)肿瘤细胞的体外杀伤试验,并与环磷酰胺分别及协同对小鼠S_(180)荷瘤鼠体内抗瘤试验。结果表明:人LI—LAK细胞在体内外均有明显的抗小鼠S_(180)肿瘤的作用。经人LI—LAK细胞及环磷酰胺治疗,S_(180)荷瘤鼠存活期显著延长,部分可完全治愈。     

Polyporus sp.MO5多糖的抗肿瘤作用

目的研究真菌Polyporus sp.M05多糖PSM-a体内对荷瘤小鼠S180的抑瘤作用及其机制.方法 MTT法检测PSM-a体外对S180细胞株的增殖抑制作用.建立S180小鼠模型,灌胃治疗,每日检测肿瘤体积并计算瘤体比和抑瘤率.实验结束后处死小鼠,MTT比色法测定小鼠自然杀伤(NK)细胞及淋巴因子活化杀伤细胞(LAK)的杀伤活性.HE染色检测肿瘤组织细胞坏死情况.结果 PSM-a在体外能抑制S180细胞生长;在体内能显著降低荷瘤小鼠的瘤重和瘤体比,250μg/ml的PSM-a对肿瘤抑制率高达80%以上;PSM-a能促进NK细胞及LAK细胞的杀伤活性;病理切片显示PSM-a作用后引起肿瘤组织坏死.结论 PSM-a对S180荷瘤小鼠肿瘤的生长有明显的抑制作用,其机制可能与提高机体免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性有关.     

A-NK/IL-2抗肿瘤作用的新研究

目的研究A-NK/IL-2在完全培养基(CM)和无血清培养基(AIMV)中体外扩增及杀伤肿瘤细胞作用.同时探讨IL-12对于A-NK/IL-2治疗的辅助作用.方法用MIT法比较不同培养条件下的A-NK细胞体外增殖能力,并测定细胞体外杀伤肿瘤细胞的活性.通过做扫描和透射电镜,对A-NK细胞杀伤的肿瘤细胞进行形态学观察.结果不同培养条件下的A-NK细胞均可在短期内大量扩增(P＞0.05),且均有很强的杀伤肿瘤的活性(P＞0.05).被A-NK细胞杀伤的肿瘤细胞的死亡形式是溶解坏死(necrosis)和凋零坏死(apoptosis).结论 AIMV可替代CM用于A-NK细胞的培养.联合应用IL-12激活A-NK细胞可降低IL-2的使用剂量,从而避免IL-2带来的副作用.本研究为A-NK细胞的进一步研究和临床应用推广奠定了理论基础.     

低剂量电离辐射后LAK细胞对动物骨肉瘤治疗作用的研究

目的:探索低剂量电离辐射对LAK细胞治疗动物骨肉瘤的影响.方法:培养的UMR-106细胞接种在月龄大鼠的前胸壁皮下,建立动物骨肉瘤模型.将LAK细胞分别经不同剂量X线辐照后,分别于3、6、9、12、15、18和21d进行细胞计数.采用3H-TdR释放法测定LAK细胞的杀伤活性.winn氏测定法测定LAK细胞对皮下肿瘤细胞生长的影响.结果:大鼠肿瘤发生率达到100％,动物模型建立成功.LAK细胞在第6～9天时,3.25 mGy受照组细胞扩增量明显大于对照组.经0.65、3.25 mGy辐照及未辐照的LAK细胞输入荷瘤小鼠后,其生存期以3.25 mGy组为最长.将骨肉瘤细胞与LAK细胞一并注入小鼠右后肢皮下,30 d后发现,3.25 mGy辐射的LAK细胞小鼠未见肿瘤生长,而0及0.65 mGy辐照的LAK细胞小鼠,可见质量2.0g肿瘤生长,对照组为6.25g.结论:低剂量电离辐射可以使LAK细胞扩增,低剂量电离辐射后LAK细胞的杀伤活性及对骨肉瘤的抗瘤作用均明显增强.     

树突状细胞诱导的LAK细胞对肺癌的生长抑制作用

目的　研究肺癌细胞裂解物负载的树突状细胞 (DC)诱导的淋巴因子激活杀伤细胞 (LAK )对肺腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法　肺腺癌患者手术切除标本接种裸鼠皮下建立肺腺癌移植瘤模型 ,同时将手术切除标本用反复冻融的方法制备肿瘤细胞裂解物 ;同一患者外周血分离得到的单个核细胞中 ,贴壁的细胞加入DC生长因子 (DCGF)培养得DC ,未贴壁的细胞加入rhIL 2培养得LAK细胞。用肿瘤细胞裂解物负载自体DC ,诱导LAK细胞生成DC LAK细胞 ,注射荷瘤裸鼠腋下以观察DC LAK细胞对肺癌移植瘤的生长抑制作用。结果　用肺癌手术标本能成功建立裸鼠移植瘤模型。DC LAK组、LAK组、DC组和生理盐水对照组肿瘤瘤重平均值分别为 0 .47、1.0 5、1.3 0和 1.5 8g ,DC LAK组、LAK组和DC组肿瘤生长抑制率分别为 70 .3 %、3 3 .5 %和 17.9% ,DC LAK细胞具有抑制裸鼠肺癌移植瘤生长的作用而且强于LAK细胞 (P <0 .0 5 )。结论　通过荷瘤裸鼠体内抗瘤实验证实了DC LAK细胞的抗肺癌作用明显高于LAK细胞 ,提示DC LAK细胞治疗是更为有效的抗肺癌生物治疗方法 ,为DC疫苗用于肺癌的临床治疗提供依据     

树突状细胞对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞影响的研究

目的:研究人外周血树突细胞(dendriticcell,DC)对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞的影响,以期获得具有抗原特异性杀伤功能的细胞毒活性细胞,并分别对CIK、LAK和CD3AK的杀伤效果进行比较。方法:采用某一肺腺癌肿瘤患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNC),经体外诱导分别扩增出CIK、LAK、CD3AK和DC细胞,再将靶细胞抗原孵育过的DC同三种细胞共同培养,通过镜下动态观察CIK联合DC对癌性胸腔积液中肿瘤细胞的杀伤活性,并利用MTT法检测CIK联合DC体外杀伤人肺腺癌细胞系(SPC-A1)的活性,同时比较CIK、LAK和CD3AK三种细胞的体外杀瘤活性。结果:CIK-A-DC的杀伤活性最强为92.3%,明显高于单纯CIK的59.7%和DC-CIK的79.8%,(P值分别为0.025和0.042),提示CIK-A-DC细胞对肿瘤杀伤的特异性。而DC-CIK的杀伤活性为79.8%,也高于单纯CIK对照组59.7%,P=0.034,说明DC具有明显增强CIK细胞杀瘤活性的功能。同时,不论从单纯CIK、LAK、CD3AK细胞毒活性,或是从三种细胞联合DC的细胞毒活性比较,CIK细胞较后两种细胞都具有更强的杀伤活性,P值分别为0.038和0.022。联合DC的自体CIK细胞体外杀瘤活性显著增强,CIK细胞的杀伤活性显著高于LAK、CD3AK两种细胞。结论:DC可明显提高自体CIK细胞的体外杀瘤活性。     

蟾酥脂质微球注射液对四种荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用

目的:观察蟾酥脂质微球注射液对荷人肝癌Hep G2、人食管癌EC9706、人结肠癌HCT-8和人胃癌BGC 803瘤株裸鼠肿瘤生长的抑制作用.方法:在BALB/c-nu裸鼠右前肢腋下接种4种人癌细胞株建立荷瘤动物模型,移植10 d后采用均衡法随机分为5组,即蟾酥脂质微球注射液高剂量组(2.50 mg/kg)、中剂量组(1.25 mg/kg)、低剂量组(0.63 mg/kg)以及阳性药组(氟尿嘧啶注射液,1.25 mg/kg)和阴性对照组(等体积脂质微球空白注射液),每组7只裸鼠,给药体积0.2 ml.采用尾静脉注射方法给药,各组动物于分组后每周给药2次,连续给药6次.于给药后动态检测并计算各组肿瘤体积(Vt)、肿瘤相对体积(VRT)、肿瘤增殖率(T/C),末次给药后3 d检测并计算各组肿瘤质量和抑瘤率.结果:各组裸鼠给药前肿瘤体积均无显著性差异.荷人肝癌Hep G2细胞瘤裸鼠给药7 d后,各剂量组肿瘤体积和相对肿瘤体积均较阴性对照组明显降低(P<0.05),末次给药后中、高剂量组T/C值<40%,各剂量组的平均肿瘤质量均较阴性对照组明显降低(P<0.05),高剂量组的抑瘤率为74.07%.荷人食管癌EC9706瘤裸鼠末次给药后,各剂量组肿瘤体积和相对肿瘤体积均较阴性对照组明显降低(P<0.05),中、高剂量组T/C值<40%,各剂量组的平均肿瘤质量均较阴性对照组明显降低(P<0.05),高剂量组的抑瘤率为70.38%.荷人结肠癌HCT-8细胞瘤裸鼠末次给药后,各剂量组肿瘤体积和相对肿瘤体积均较阴性对照组明显降低(P<0.05),高剂量组T/C值<40%,各剂量组的平均肿瘤质量均较阴性对照组明显降低(P<0.05),高剂量组的抑瘤率为52.42%.荷人胃癌BGC 803细胞瘤裸鼠末次给药后,中、高剂量组的肿瘤体积和相对肿瘤体积均较阴性对照组明显降低(P<0.05),各剂量组T/C值>40%,各剂量组的平均肿瘤质量均较阴性对照组明显降低(P<0.05),高剂量组的抑瘤率为47.42%.结论:蟾酥脂质微球注射液具有确切的抑制人肝癌Hep G2、食管癌EC9706、结肠癌HCT-8和胃癌BGC 803瘤株增殖的作用,作用效果以抑制人肝癌Hep G2和人食管癌EC9706瘤株生长作用为最佳.     

CIK细胞体内外抗宫颈癌HeLa细胞活性的研究

目的：探讨细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer,CIK）细胞的体内外抗宫颈癌HeLa细胞活性。方法：收集8名健康献血者和8名宫颈癌患者的新鲜外周血,分别通过常规方法分离外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）,应用相应细胞因子体外诱导分化出CIK细胞,动态观察CIK细胞的体外增殖活性、细胞表型和对HeLa细胞的杀伤活性;在BALB/c裸鼠皮下接种效应细胞,观察宫颈癌患者CIK细胞对接种HeLa细胞的荷瘤鼠的抑瘤作用,同时设淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cells,LAK）和PBMC细胞作为对照。结果：源于健康人和宫颈癌患者的CIK细胞间的增殖活性无明显区别（P〉0.05）。表型分析结果表明,两种来源的CIK细胞中CD3~＋CD56~＋双阳性细胞均得到了大量扩增,宫颈癌患者CIK细胞中CD3~＋CD56~＋双阳性细胞在实验开始前约占0.13%,到实验后第28天上升到25.8%。体外实验表明,宫颈癌患者的CIK细胞杀伤宫颈癌HeLa细胞的细胞毒活性明显高于PBMC细胞。裸鼠体内实验表明,宫颈癌患者CIK细胞能够显著抑制肿瘤的生长,其抑瘤率可达80.6%,高于LAK细胞的59.1%和PBMC细胞的38.3%（P〈0.01）。CIK治疗后肿瘤体积明显比空白对照组缩小（P〈0.05）。结论：宫颈癌患者CIK细胞具有较强的体内外抗宫颈癌细胞活性,有可能用于临床上宫颈癌的过继性免疫治疗。     

Regional administration of natural killer cells in a rat hepatic metastasis model results in better tumor infiltration and anti-tumor response than systemic administration

A syngeneic rat liver metastasis model, the CC531 colon carcinoma cell line in Wag rats, was used to study the homing properties and anti-tumor effects of adoptively transferred, interleukin-2 (IL-2)-activated, cultured natural killer (A-NK) cells. To identify the route of administration that gives the highest tumor infiltration, 1.5 × 10⁸ A-NK cells were dyed with fluorescent rhodamine and injected via 4 different routes into rats, bearing subcapsularly induced (day 10) liver metastases. The routes chosen were: jugular vein, portal vein, hepatic artery and directly into the peritoneal cavity (i.p). The rats were sacrificed 20 hr after administration of A-NK cells. The highest (p < 0.05) infiltration of tumors by A-NK cells was found both at the tumor border and in the tumor center after injection via the hepatic artery: 65 ± 7 A-NK cells/mm² at the tumor border and 26 ± 14 A-NK cells/mm² in the center of the tumor (jugular vein infusion: 32 ± 10 and 9 ± 5 A-NK cells/mm², respectively; portal vein infusion: 36 ± 13 and 7 ± 4 A-NK cells/mm², respectively). No A-NK cells were detected in the liver after i.p. injection. Rats bearing day 5 tumors were injected with 1.5 × 10⁸ A-NK cells via the hepatic artery or via the jugular vein (n = 5 and n = 6 respectively). Regional administration of A-NK cells via the hepatic artery resulted in a significant (p < 0.05) lower weight (35 ± 23 mg) of tumors than did systemic administration (70 ± 10 mg). Our results suggest that both the level of tumor infiltration by adoptively transferred A-NK cells and the therapeutic outcome depend on the route of administration. Int. J. Cancer 75:233–238, 1998. © 1998 Wiley-Liss, Inc.     

胃周淋巴结淋巴因子激活的杀伤细胞抗肿瘤研究

淋巴细胞经白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)体外诱导培养后,可产生明显的杀伤肿瘤细胞活性,此杀伤细胞称为LAK细胞(lymphokine activated killer cells)。本实验取19例胃癌患者胃引流区淋巴结淋巴细胞(gastric drainage lymphnode lymphocytes,GDLNL),在体外经重组白细胞介素-2诱导培养若干天后,对高分化胃腺癌细胞MNK_(28)进行体外杀伤实验。结果提示,无癌转移的淋巴结淋巴细胞在诱导培养3天～2周内,LAK活性较高;而有癌转移的淋巴结淋巴细胞在2周内亦有明显的LAK活性,但较低,以后逐渐升高,3周最高,且至5周时,仍有杀伤肿瘤活性。     

CD_3单克隆抗体激活细胞的体外抗肿瘤作用

目的:观察CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(CD3AK)的体外杀伤肿瘤作用。方法:采用MTT法测定不同时期CD3AK细胞的杀伤活性。结果:培养到第4天的CD3AK细胞已有明显的杀伤活性,第10天达高峰;CD3AK对K562、H7402和MNK45肿瘤细胞的杀伤活性显著高于LAK和NK细胞(P<0.05),对Hela-3肿瘤细胞的杀伤活性略低于LAK细胞。结论:CD3AK是一种广谱、高效的肿瘤杀伤细胞,但它对不同种类的肿瘤细胞的杀伤效应又存在着较大的差异。     

脐血CD3AK细胞治疗恶性肿瘤的临床应用研究

目的:研究用脐血单个核细胞制备CD3AK细胞的抗肿瘤作用,探讨肿瘤生物治疗近期疗效的免疫指标.方法:分离脐血单个核细胞,分别用IL-2和IL-2 CD3Ab诱导LAK和CD3AK细胞,并测其扩增数量和对K562细胞的杀伤活性;测定肿瘤患者用CD3AK细胞治疗前后外周血T淋巴细胞亚群绝对计数的变化情况和外周血单核细胞(PBMC)的NK杀伤活性.结果:脐血LAK细胞和脐血CD3AK细胞均于培养后11天时扩增倍数最高,分别是培养前的18倍、24倍,对K562的杀伤活性分别是培养前的2.6倍和3.2倍;肿瘤患者输注CD3AK细胞一疗程后,其外周血T淋巴细胞亚群绝对计数有明显升高:总T升高66.0%,Th升高68.0%,Ts升高58.0%;其PBMC的NK杀伤活性由63.0%升高到81.0%,平均升高28.0%.结论:1)脐血单个核细胞是LAK细胞和CD3AK细胞良好的前体细胞.2)LAK和CD3AK细胞的数量和杀伤能力在培养的11天时达高峰,而且CD3AK细胞数量和杀伤活性明显优于LAK细胞.3)CD3AK细胞输注能明显提高肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群绝对计数和PBMC的NK活性.4)肿瘤患者的外周血T淋巴细胞计数和PBMC的NK活性测定可望成为肿瘤生物治疗的一个近期疗效参数.     

CIK的体外增殖及体内外杀瘤活性的实验研究

目的:从人骨髓造血前体细胞体外培养扩增树突状细胞(dendritic cells,DCs),测定其表型及T细胞刺激活性.方法:采用Mini-MACS分离技术,从正常人骨髓、脐血分离CD34~ 造血干细胞,体外以重组hGM-CSF,hTNF-α,hIL-3诱导培养2周,流式细胞术检测扩增细胞的表面表型及细胞内IL-12的表达,体外同种混合淋巴细胞反应检测扩增DCs的T细胞刺激活性.结果:从正常人骨髓、脐血分离得到高纯度(>90%)的CD34~ 造血干细胞,经重组hGM-CSF,hTNF-α的共同诱导培养,扩增得到大量DCs,加人hIL-3可以进一步增加DCs产量;FACS检测表明,扩增的DCs表达HLA-DR,CD40,CD54,CD80,CD86分子,细胞内有hIL-12的P35,P40亚基的表达;与外周血单核细胞培养生成的DCs相比,由CD34~ 干细胞扩增的DCs具有更强的激发同种T细胞增殖的能力.结论:人CD34~ 干细胞体外经诱导培养,可以生成大量功能成熟的DCs,从而为进一步开展DCs的基础及临床研究打下了基础.