TGF-β1壳聚糖微球的制备及其缓释效果研究

目的:制备转化生长因子β1(TGF-β1)壳聚糖微球,并研究其体外缓释效果。方法:采用乳化交联的方法制备壳聚糖微球,然后吸附TGF-β1获得TGF-β1壳聚糖微球。利用酶联免疫吸附的方法(ELISA)动态检测7 d内TGF-β1壳聚糖微球的缓释效果,并绘制释放曲线。结果:壳聚糖微球形态较好,粒径为(8.6±2.8)μm。TGF-β1壳聚糖微球在缓释实验的前12 h内释放速度较快,随后释放趋于平稳。7 d内微球的TGF-β1释放率为42.6%。结论:TGF-β1壳聚糖微球的制备工艺简单可行,成球性好,具有良好的缓释效果。     

包载 rhBMP-2和 SDF-1的双层纳米微球的构建及体外释药研究

目的：构建搭载基质细胞衍生因子1（SDF-1）和人骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）的双层纳米微球缓释系统,研究其体外释药特性。方法：用“乳化-溶剂挥发法”制备聚乳酸／壳聚糖（PLA ／CS）双层纳米微球,通过正交试验获得最佳制备参数;动态光散射法测定纳米微球的粒径,电镜观察纳米微球的形态;在乳化过程中将 rhBMP-2和 SDF-1依次加入纳米微球中,计算其包封率和载药量,透析袋扩散法检测其体外缓释效果。结果：制备的双层纳米微球外形圆整,表面光滑,平均粒径为（542．33±14．38）nm,微球之间无粘连。rhBMP-2包封率为（82．41±1．05）％,载药量为（24．67±0．43）ng／mg;SDF-1包封率为（75．58±0．84）％,载药量为（22．63±0．41）ng／mg。药物释放持续至少30 d,呈“双相释放”。第30天时累计释放的 rhBMP-2和 SDF-1分别为72．85％和91．01％。结论：成功制备了包裹 SDF-1和 rhBMP-2的双层载药微球,形态良好,包封率较高,体外缓释效果较好。     

生长因子缓释微球的制备及对人牙周膜成纤维细胞作用的研究

目的：制备重组人胰岛素样生长因子缓释明胶微球（rhIGF-Ⅰ-GMs）,观察其一般性质、体外释药特性、对人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）的增殖及Ⅰ型胶原合成的影响。方法：改良乳化冷凝聚合法制备rhIGF-Ⅰ-GMs,扫描电镜（SME）观察其一般性质;ELISA法测定rhIGF-Ⅰ的含量,计算微球包封率和载药率及绘制微球体外释药曲线。体外培养HPDLFs,四唑盐比色法（MTT）和羟脯氨酸试剂盒消化法动态观察rhIGF-Ⅰ和rhIGF-Ⅰ-GMs梯度含量分别对HPDLFs增殖及Ⅰ型胶原合成的影响。结果：微球表面光滑圆整,球体均匀度好,平均粒径为（12.51±3.53）μm,冻干粉剂为白色粉末状,再分散性良好,微球载药量和包封率分别为920ng/g和92.0%,体外7d内药物缓释72.5%;rhIGF-Ⅰ和rhIGF-Ⅰ-GMs均明显促进HPDLFs增殖及Ⅰ型胶原分泌（P〈0.05）;rhIGF-Ⅰ-GMs较单独应用rhIGF-Ⅰ的效果更加显著（P〈0.01）,呈浓度及时间依赖性。结论：rhIGF-Ⅰ-GMs及其冻干粉剂制备良好;rhIGF-Ⅰ-GMs通过对rhIGF-Ⅰ的缓释作用促进HPDLFs增殖及Ⅰ型胶原分泌的效果明显优于单独使用rhIGF-Ⅰ。     

自体来源富血小板血浆对大鼠牙髓细胞增殖作用的研究

目的:初步探讨富血小板血浆及之中生长因子对大鼠牙髓细胞增殖的作用.方法:采用Landesberg 法制备PRP,ELISA测定PRP中两种主要生长因子:转化生长因子(TGF - β1)和血小板源性生长因子(PDGF -AB)的浓度;CCK-8法观察5％、10％PRP在48h时对牙髓细胞的增殖作用;在5％PRP中加入TGF-β1抗体和PDGF-AB抗体分别拮抗TGF-β1和PDGF-AB的作用并观察对细胞增殖的影响.结果:所制备的PRP中血小板含量为1790.58±388.08×109个/L,ELISA的方法测定PRP中TGF-β1及PDGF-AB的浓度分别为3.080 ng/ml和10.706 ng/ml.CCK-8法测定5％和10％PRP对牙髓细胞均有增殖作用(P＜0.05,与对照组相比);屏蔽生长因子可以明显改变5％PRP对大鼠牙髓细胞的增殖作用(P＜0.05);拮抗PDGF-AB组比拮抗TGF - β1组降低增殖作用明显(P＜0.05).结论:本实验制备的PRP含有高浓度的TGF - β1及PDGF-AB,不同浓度的PRP均能有效促进牙髓细胞增殖;屏蔽PDGF-AB明显降低5％PRP对大鼠牙髓细胞的增殖作用.     

钛表面羟磷灰石/壳聚糖-转化生长因子-β1缓释微球复合涂层的制备及其对成骨细胞黏附与增殖的影响

目的 探讨在钛表面制备羟磷灰石（HA）/壳聚糖（CS）-转化生长因子-β1（TGF-β1）缓释微球复合涂层及其对成骨细胞黏附与增殖的影响。方法 通过物理-化学-生物改性联合方式制备HA/CS-TGF-β1 缓释微球复合涂层。运用扫描电镜（SEM）、X射线衍射仪（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）等分析涂层的形貌和物相;使用CCK-8及免疫荧光检测其对成骨细胞的细胞毒性及细胞黏附和增殖的影响。结果 成功制备HA/CS-TGF-β1缓释微球复合涂层,该涂层制备具有超亲水性,体外释药稳定且时间长,成骨细胞在此复合涂层的钛片上生长无抑制,且对细胞的黏附与增殖具有促进作用。结论 HA/CS-TGF-β1缓释微球复合涂层在体外对于成骨细胞的黏附与早期增殖有明显的促进作用,具有良好的运用前景。     

转化生长因子β1壳聚糖不对称膜的制备及其对小鼠成牙本质细胞增殖的影响

目的制备转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)壳聚糖不对称膜,研究其对小鼠成牙本质细胞(MDPC-23)生长和增殖的影响.方法用自然干燥法和冷冻干燥法,复合TGF-β1壳聚糖微球,制备TGF-β1壳聚糖不对称膜,利用扫描电镜进行形态学观察.TGF-β1壳聚糖不对称膜与小鼠成牙本质细胞共培养,2 d后扫描电镜观察细胞在材料上的黏附、生长,并绘制7 d内的细胞生长曲线.结果壳聚糖不对称膜为双层结构,具有致密膜和多孔层,孔径60-160 μm,孔隙率为83.26%,与水的结合能力为15.6g水/g多孔膜.TGF-β1壳聚糖微球均匀分布于多孔层的孔隙中.MDPC-23在TGF-β1壳聚糖不对称膜的多孔层黏附生长,细胞的增殖能力显著提高,培养7 d,细胞数量由(2.03±0.04)×104增至(18.31±0.60)×104.结论壳聚糖不对称膜具有理想的物理性能,复合TGF-β1壳聚糖微球后形成TGF-β1三维缓释系统,可促进细胞的增殖.     

电纺羧甲基壳聚糖复合rhBMP-2生长因子纤维膜的制备

目的：利用静电纺丝技术以羧甲基壳聚糖复合生长因子（rhBMP-2）缓释微球制备牙周组织再生引导膜。方法：将载有生长因子的钙藻酸盐微球与主体羟基磷灰石（CCS/nHA）羧甲基壳聚糖混合利用静电纺丝技术制得具有＂串珠＂丝状结构的复合纤维膜,并观察微球及纤维膜的体外释药过程。结果：电纺技术制备出具有一定力学强度的缓释微球的纤维膜。体外释药在50hr时纤维膜释放速率78%,较微球的释放速率96%缓慢,之后各自接近平缓释放。结论：用静电纺丝技术平台制备缓释再生引导膜是可行的,这一技术为牙周组织再生术的完善和发展提供新的研究空间,其生物学性能尚需进一步研究。     

rhBMP-2-mPEG-PLA纳米缓释微球缓释凝胶的制备及体外释放实验研究

目的制备一种改性后的rhBMP-2聚乳酸缓释纳米微球(rhBMP-2-mPEG-PLA-Ns),并研究其理化性能和体外释放研究,以用于将来的骨创伤修复。方法运用复乳法制备mPEG-PLA缓释微球,利用透射电子显微镜观察微球表面形态,激光粒度分布测试仪测试纳米微球粒径。采用ELISA法测定微球包封率及载药量,并选择动态透析释药法测定其体外释放率。结果微球表面光滑、圆整,纳米球体粒径均匀。纳米微球的粒径在45⁵0 nm,粒径分布范围较窄。包封率和载药量分别为(78.2±1.81)%和((2.24±0.24)×10-5)%,体外释放试验中,没有发现突释现象,24 h释放率为23.47%,微球在21 d后释放度达78.56%。结论 rhBMP-2-mPEG-PLA缓释纳米微球具备良好的理化特性和缓释效果,为后续药物在口腔方面的应用打下良好的基础。     

载VEGF/VAN多层海藻酸钠-壳聚糖微球的制备及其体外抗感染能力和稳定性研究

目的:制备载有血管内皮生长因子(VEGF)和万古霉素(VAN)的多层海藻酸钠(SA)-壳聚糖(CS)微球,并讨论其体外抗感染能力和稳定性。方法:采用滴注法和层层自组装技术制备多层载药微球;纸片法实验检测微球体外抗感染能力;分别采用ELISA法和紫外分光光度法测定微球中VEGF和VAN的载药量和包封率;微球经过不同条件处理后,通过SEM观察微球表面和截面形态,并分别测定不同条件处理后微球内VEGF和VAN的有效释放量的变化。结果:肉眼观制备出的微球呈类球形;VEGF和VAN的载药量分别为6.63×10^-5%和1.39%,包封率分别为72.1%和3.37%;微球溶解后,溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌环直径为(12.61±1.01) mm;不同条件处理后,微球直径约为900~1100 μm,表面完整,存在少许褶皱,截面呈致密网状结构;不同条件处理后微球内VEGF和VAN的有效释放量均有一定下降。结论:本实验制备的载VEGF/VAN多层微球粒径均匀,对金黄色葡萄球菌具有一定抑菌效果,需低温(-80 ℃)且避光储存。     

骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米缓释载体的制备及性能测定

目的 制备负载骨形态发生蛋白2（BMP-2）的壳聚糖纳米球,测定纳米球粒径、zeta电位、形态、体外降解和体外释放性能,探讨负载BMP-2的壳聚糖纳米球作为缓释载体的可行性。方法以壳聚糖（chitosan）和三聚磷酸钠(tripolyphosphate )为原料,采用离子交联法制备壳聚糖纳米球。应用纳米粒度分析仪及zeta电位测定仪检测微球粒径、分布及zeta电位,透视电镜下测定其表面形态。Elisa法测定包封率、载药率及体外释放率。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果离子交联法制备的BMP-2壳聚糖纳米球成球形好,球形较规则,分散较均匀,无团聚,表面较光滑;平均粒径为150.85 nm,分散指数PI=0.37,Zeta电位为+35.42 mV,包封率为(68.24±3.83)%,载药率为(56.83±2.26)%。体外释药试验显示,BMP-2可从壳聚糖纳米微球中缓慢释放,释放行为符合双相动力学规律,释放过程可达30 d。结论以壳聚糖和三聚磷酸钠为原料,可成功制备具有良好缓释能力的BMP-2纳米球,为组织工程骨的进一步应用提供依据。     

富血小板纤维蛋白体外释放TGF-β和PDGF-AB影响因素的探讨

目的探讨不同方法对制备的富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）释放生长因子的影响。方法对志愿者进行静脉采血,分别以不同离心速度（2500r/min、3000r/min、3500r/min）、离心时间（10min、15min、20min）和除水方法（快速除水和缓慢除水）制备PRF,收集PRF所释放的生长因子,通过ELISA法比较不同方法所获得的PRF释放的TGF-β和PDGF-AB的浓度差异。结果以3000r/min的离心速度制备的PRF释放TGF-β和PDGF-AB含量显著高于其他两组;10min组和15min组制备的PRF释放TGF-β含量高于20min组,而PDGF-AB含量10min组显著高于其他两组;两种除水方法制备的PRF释放TGF-β和PDGF-AB含量无统计学差异（P〉0.05）。结论不同离心速度、离心时间对PRF的特性存在一定的影响,而快速除水和缓慢除水对PRF特性的影响无显著性差异。     

富血小板血浆促进人牙髓细胞增殖的实验研究

目的探讨不同浓度富血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP)对人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)的增殖作用。方法两步离心法制备PRP,通过ELISA的方法测定PRP中两种主要生长因子血小板源性生长因子(PDGF-AB)和转化生长因子(TGF-β1)的浓度;用四唑盐比色法(MTT)观察5%、10%、20%PRP在2d、4d时对牙髓细胞的增殖作用,并探讨这种作用是否依赖于胎牛血清(FBS)的存在。结果所制备的PRP中血小板的浓度大于1000×109个/L,为全血中的4倍以上,经ELISA的方法测定PRP及贫血小板血浆(Platelet poor plasma,PPP)中PDGF-AB、TGF-β1的浓度分别增加4倍以上。MTT法测定不同浓度组的PRP对牙髓细胞均有增殖作用,以10%PRP增殖效应最明显,P值均<0.05;4d时PRP对细胞的增殖作用明显强于2d时,P值<0.05;10%PRP组较10%胎牛血清组增殖作用明显,P值<0.05。结论本实验制备的PRP含有较高浓度的PDGF-AB及TGF-β1,不同浓度的PRP均能有效促进牙髓细胞增殖,以10%PRP浓度增殖效应最明显;并且这种增殖作用并不依赖于胎牛血清的存在;随着时间延长,PRP对细胞增殖作用增加。     

TGF-β1促进rhBMP-2对成骨前体细胞增殖分化的观察

目的:观察TGF-β1对rhBMP-2促进成骨前体细胞(MC3T3-E1)增殖和分化能力的影响。方法:MC3T3-E1加入不同浓度的rhBMP-2和TGF-β1+rhBMP-2进行组织学观察,用MTT法检测细胞增殖,通过ELISA检测细胞ALP含量。结果:随着加入rhBMP-2浓度的增加,MC3T3-E1细胞的增殖逐渐增加,TGF-β1+rhBMP-2组增加更为显著(P<0.05)。TGF-β1+rhBMP-2组和rhBMP-2组在rhBMP-2浓度为25、50、100μg/L间存在统计学意义(P<0.05)。随着rhBMP-2浓度的增加,ALP值逐渐增加,TGF-β1+rhBMP-2组ALP值升高更为显著(P<0.01),TGF-β1+rhBMP-2组和rhBMP-2组在rhBMP-2浓度为25、50μg/L间有统计学意义(P<0.05)。结论:TGF-β1可促进rhBMP-2对MC3T3-E1的增殖和成骨分化作用。     

压力作用时间对人牙周膜成纤维细胞合成TGF-β1的影响

目的:探讨压力作用不同时间对人牙周膜成纤维细胞表达TGF-β1的影响.方法:本实验采用细胞加载装置,对人牙周膜成纤维细胞施加1.0MPa的压力,分别持续1Omin、30min、50min、通过酶联免疫吸附实验,分别检测细胞受力后6h、12h、18h、24h时TGF-β1的含量.结果:加载1Omin组在细胞受力后的各个时段TGF-β1含量与对照组相比无显著性差异(P>0.05).加载30min组(0.51±0.06)和加载50min组(0.46±0.06)TGF-β1含量在细胞受力后的第12h同对照组(0.78±0.08)相比明显降低(P<0.05).结论:在一定加载时间内,人牙周膜成纤维细胞合成TGF-β1量随着压力作用时间的延长而有所降低.     

三七总皂苷对兔BMSCs的成骨分化及TGF-β1表达的影响

目的:观察三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)对兔骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)成骨分化及TGF-β1在基因水平表达变化的影响。方法:体外分离培养兔BMSCs,观察不同浓度PNS(50、100、200 mg/L)对兔BMSCs的影响,采用MTT法检测细胞增殖,茜素红染色观察钙结节形成,qRT-PCR检测TGF-β1表达水平。结果:各浓度PNS培养下的细胞增殖无明显差异(P>0.05);100、200 mg/L PNS组的钙结节数量和TGF-β1的表达水平均高于阴性组(P<0.05)。结论:PNS可促进兔BMSCs的成骨分化并刺激其分泌TGF-β1,但无明显促细胞增殖作用。     

HGF在人牙周膜成纤维细胞中的表达

目的：观察HGF在人牙周膜成纤维细胞中的表达及探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）、白细胞介素-1β（IL-1β）与HGF之间的关系。方法：分别采用IL-1β梯度浓度、最佳干预浓度和TGF-β1梯度浓度干预第5代人牙周膜成纤维细胞,并运用酶联免疫技术检测人牙周膜成纤维细胞的上清液中HGF的表达。结果：经IL-1β单独作用,人牙周膜成纤维细胞的上清液中HGF的含量较空白对照组高,并优选出IL-1β的最佳干预浓度为10 ng/mL。当一定浓度的TGF-β1和10 ng/mL的IL-1β联合干预人牙周膜成纤维细胞,该细胞上清液中HGF的含量较单独IL-1β作用组低。结论：TGF-β1能够抑制IL-1β诱导的人牙周膜成纤维细胞分泌HGF。     

不同骨内植入材料对巨噬细胞活性的影响

目的：研究不同骨植入材料对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7活性的影响。方法：在钛（Ti）、医用不锈钢（SS）和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）材料表面及细胞培养板（PSC）上培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7,在不同时间用cck-8法测定细胞增殖情况,实时荧光定量PCR法测定单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、转化生长因子-β1（TGF-β1）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA表达水平。结果：小鼠巨噬细胞系RAW264.7在各种材料上均能良好生长,无明显细胞毒性。Ti和PSC组细胞增殖速率明显高于SS和PMMA组。各组材料表面巨噬细胞MCP-1mRNA表达随时间减少,PMMA组表达较高。除钛组外,其余各组巨噬细胞TGF-β1mRNA表达水平随时间增加,12h和24h时钛组表达较高。TNF-αmRNA的表达水平随时间增加,Ti组和PSC组显著高于SS和PMMA组。结论：骨内植入材料表面的巨噬细胞增殖活性和基因表达受不同材料和接触时间的影响。     

NOS与TGF—β1在牵张成骨中的相关性研究

目的：利用种植型牵张器增高兔下颌牙槽嵴,研究一氧化氮合酶（NOS）与转化生长因子-β1（TGF-β1）在牵张成骨过程中的相关性。方法：雄性日本大耳白兔24只,随机分为牵张术后1天、1周、2周、4周、6周组和空白对照组,每组4只。随机选取一侧下颌骨行牵张成骨术。分离处死后的兔下颌骨,行免疫组化观察。对免疫组化染色切片通过高清晰彩色病理图像分析仪测量灰度值,计算染色强度。利用SPSS13．0软件包进行方差分析和Spearman相关分析,并拟合曲线关系,建立相关回归方程。结果：在牵张成骨中,eNOS与TGF-β1呈正相关（P〈0．01,r=0．538）,iNOS与TGF一8。不存在相关性（P〉0．05,r=0．283）;eNOS与TGF—β1的曲线拟合回归方程为YeNOS=24．246-1．914XTGF-β1＋0．182XTGF-β1^2-0．004XTGF-β1^3。结论：TGF—β1在牵张成骨过程中可能起调控作用,对eNOS起正性调控作用,通过调控eNOS来完成对iNOS的调控,iNOS又通过NO浓度的变化完成对TGF-β1的反作用。