HBV S基因、PreS2/S基因真核重组载体的构建与鉴定

[目的]构建包含人乙型肝炎病毒(HBV)S基因与PreS2／S基因的重组载体。[方法]设计合成2对寡核苷酸引 物,以adr亚型HBV质粒pHBV DNA为模板,采用PCR法分别扩增HBV S基因、PreS2／S基因片段;用HindⅢ和BamHⅠ双酶 切后,分别连接到质粒pcDNA3.1相应酶切位点,转化宿主菌JM109,分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒。 [结果]酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符。测序结果与文献报道序列及预计结果一致。[结论]成功构建了S基因与 PreS2／S基因的重组载体。     

HBVS基因、PreS2/S基因真核重组载体的构建与鉴定

[目的]构建包含人乙型肝炎病毒(HBV)S基因与PreS2/S基因的重组载体.[方法]设计合成2对寡核苷酸引物,以adr亚型HBV质粒pHBVDNA为模板,采用PCR法分别扩增HBVS基因、PreS2/S基因片段;用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后,分别连接到质粒pcDNA3.1相应酶切位点,转化宿主菌JM109,分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒.[结果]酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符.测序结果与文献报道序列及预计结果一致.[结论]成功构建了S基因与PreS2/S基因的重组载体.     

HBV全基因真核表达载体的构建及表达

目的：为诱导HBV特异性CTL，构建HBV全基因真核表达载体，并对其在细胞中的表达进行了初步研究。方法：以EcoRⅠ酶切pBR322-2HBV和pcDNA3，回收完整的HBV基因片段及线性化的载体pcDNA3，T4 DNA连接酶连接HBV和pcDNA3，转化、筛选，酶切鉴定HBV的插入方向。以脂质体将构建的pcDNA3-HBV转染HepG2肝癌细胞，经G418筛选，ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达，RT-PCR检测转染细胞中PreSl mRNA的表达。结果：经酶切鉴定获得正向插入的pcDNA3-HBV，转染HepG2后，建立了新的肝癌细胞系HepG2．02G，细胞培养上清中可检测到高水平的HBsAg，PreSl mRNA在转染细胞中表达。结论：经体外重组，获得携带全长HBV基因片段的pcDNA3-HBV表达载体，并可在肝癌细胞中稳定表达。     

HBV C区基因真核表达载体的构建及转染

目的构建含乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)增强子Ⅱ(enhancerⅡ,EnhⅡ)、核心启动子区(basal core promoter,BCP)和C区基因的真核表达载体,以研究EnhⅡ、BCP和C区基因的生物功能。方法提取HBV DNA,PCR法扩增EnhⅡ-BCP-C区基因片段;HindⅢ和XbaⅠ双酶切PCR产物,胶回收纯化的DNA片段,连接入载体pBudCE4.1,酶切及DNA测序鉴定重组载体。采用脂质体介导的方法将重组载体DNA转染HepG2细胞和HeLa细胞,酶联免疫吸附试验检测重组载体转染的HepG2细胞、HeLa细胞上清液及细胞裂解物中乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)的表达水平。结果双酶切及DNA测序鉴定,含840 bp HBV EnhⅡ-BCP-C区基因片段的重组载体构建成功。EnhⅡ+BCP+C/pBudCE4.1重组载体转染HepG2细胞24、48 h后的上清液和转染48 h后裂解物中HBeAg表达水平均明显高于pBudCE4.1空载体转染HepG2细胞(均P<0.05),EnhⅡ+BCP+C/pBudCE4.1重组载体转染HeLa细胞24、48 h后的上清液和转染48 h后的裂解物中HBeAg表达水平与pBudCE4.1空载体转染HeLa细胞比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论成功构建HBV EnhⅡ-BCP启动-C基因肝细胞特异表达的真核载体,有利于进一步研究EnhⅡ、BCP和C区基因某些突变位点的生物学意义。     

HBV转录激活蛋白HBx、MHBst78MHBst155真核重组载体构建

目的分别构建人乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白、羧基端截断的中分子表面蛋白MHBst78、MHBst155编码基因的真核重组表达载体,以便进一步研究其转录激活功能及对宿主细胞信号传导通路的影响。方法设计合成3对寡核苷酸引物,以adr亚型HBV质粒pHBVDNA为模板,采用PCR法分别扩增HBVX基因、MHBst78与MHBst155编码基因片段;用HindⅢ,KpnⅠ双酶切HBVⅩ基因;用HindⅢ和BamHⅠ双酶切MHBst78与MHBst155编码基因片段后,分别定向插入到真核表达载体pcDNA3.1相应酶切位点,转化宿主菌JM109,提取质粒,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果酶切重组体显示所切下的片段大小均与预计相符,测序结果与文献报道序列及预计结果一致。结论成功构建了HBVX基因、羧基端截断的HBV中分子表面蛋白MHBst78、MHBst155编码基因的真核重组表达载体,为进一步研究HBV转录激活蛋白HBx、MHBst78MHBst155对宿主细胞信号转导通路的影响奠定基础。     

HBV转录激活蛋白HBx、MHBs^178 MHBs^t155真核重组载体构建

目的 分别构建人乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白、羧基端截断的中分子表面蛋白MHBs^178、MHBs^t155编码基因的真核重组表达载体，以便进一步研究其转录激活功能及对宿主细胞信号传导通路的影响。方法 设计合成3对寡核苷酸引物，以adr亚型HBV质粒pHBV DNA为模板，采用PCR法分别扩增HBVX基因、MHBs^178和MHBs^t155编码基因片段；用HindⅢ，Kpn Ⅰ双酶切HBV X基因；用HindⅢ和Barn HⅠ双酶切MHBs^178与MHBs^t155编码基因片段后，分别定向插入到真核表达载体pcDNA3．1相应酶切位点，转化宿主菌JM109，提取质粒，分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果 酶切重组体显示所切下的片段大小均与预计相符，测序结果与文献报道序列及预计结果一致。结论 成功构建了HBV X基因、羧基端截断的HBV中分子表面蛋白MHBs^178、MHBs^t155编码基因的真核重组表达载体，为进一步研究HBV转录激活蛋白HBx、MHBs^178 MHBs^t155对宿主细胞信号转导通路的影响奠定基础。     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞 …

目的 构建丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ｐｒｅＳ融合蛋白的真核表达载体。方法 用ＰＣＲ方法扩增ＨＢＶｐｒｅＳ和ＨＣＶＥ２蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,用脂质体转染试剂将其转入ＣＯＳ７细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白,结果Ｅ２－ｐｒｅＳ融合蛋白基因包括了全长的ＨＢＶｐｒｅＳ和ＨＣＶＥ２蛋白基因,嵌合基因长度约１．６ｋｂ表达载体在ＣＯＳ７细胞表达出     

钙网蛋白融合HBsAg基因重组腺病毒新型载体疫苗的构建与鉴定

目的:构建表达钙网蛋白(calreticulin,CRT)与乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)融合基因重组腺病毒载体(Ad-CRT/HBsAg),为研发新型乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)治疗性疫苗奠定基础?方法: 采用腺病毒表达系统(ViraPowerTM Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体?首先利用RT-PCR的方法扩增CRT基因,并进一步构建CRT与HBsAg基因融合重组的pJW4303表达载体,在构建过程中给融合基因加上特定的CACC接头,再克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆, 经PCR及测序鉴定正确后, 用重组酶(LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆Ad-CRT/HBsAg?表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒?经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测Ad- CRT/HBsAg载体是否能正确表达目的蛋白?结果:构建的含有CRT/HBsAg融合基因的腺病毒表达克隆,经PCR和测序鉴定构建正确?重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增,获得的病毒滴度为2.68×1011 pfu/ml,且这个重组病毒载体能正确表达CRT/HBsAg融合蛋白?结论:成功构建了CRT/HBsAg融合基因重组腺病毒载体(rAd-CRT/HBsAg),为此重组载体用于治疗HBV慢性感染以及HBsAg阳性肝癌奠定基础?     

乙型肝炎病毒X基因真核表达的载体构建及鉴定

目的:构建HBV X基因与pCDNA3.1相融合的高效真核表达载体,为进一步研究HBV X基因的功能奠定基础。方法:设计并合成HBV X基因的引物,以HBV DNA阳性血清PCR扩增得到HBV X基因全序列;将X基因连接到真核表达载体pCDNA3.1上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBV X基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论:成功构建了HBV X基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

乙型肝炎病毒全基因重组真核表达质粒的构建

目的 构建乙型肝炎病毒（HBV）全基因重组真核表达质粒,旨在转染肝细胞,建立HBV复制状态模型。方法 体外连接HBV（ayw亚型）DNA获得6.4kb的双拷贝DNA片段。然后将其插入pcDNA3载体的EcoRV位点。结果 通过聚合酶链反应（PCR）和酶切筛选和验证获得头尾串联双拷贝HBV全基因重组真核表达质粒。结论 成功构建了HBV全基因重组真核表达质粒。     

乙肝表面S蛋白与人精子相互作用的初步研究

目的：研究乙肝表面S蛋白（HBs）与人精子表面去唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）的结合情况,探讨乙肝病毒（HBV）侵入人精子的早期机制。方法：HBs预先与人精子孵育一定时间后,采用异硫氰酸荧光素标记的ASGP-R单克隆抗体对人精子表面ASGP-R标记,通过流式细胞术考察HBs与该受体结合情况。结果：HBs在浓度25μg／mL时孵育1h,ASGP-R单克隆抗体浓度10μg／mL时,观察到标记的人精子的平均荧光强度显著降低。结论：HBV可能通过HBs与人精子表面ASGP-R受体结合而侵入精子,为进一步研究HBV侵入精子的早期机制提供了初步基础。     

GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

乙型肝炎病毒preS2蛋白在转基因小鼠肝脏中的表达

目的：分析乙型肝炎病毒preS2蛋白在3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠肝脏中的分布及其病理学作用。方法：采用原核显微注射法将质粒pcDNA3.1-preS/S^t注射入小鼠受精卵雄原核，制备转基因小鼠。PCR法在基因组小平筛选3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠首建者（founder）及后代；免疫组织化学法在蛋白水平检测preS2蛋白在这些小鼠中的表达；H－E染色分析转基因小鼠肝组织的病理学变化。结果：以原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，共出生15只新生小鼠，其中存活7只，经PCR检测后获得2只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(preS/S^t）SMMU。免疫组织化学检测发现转基因小鼠肝细胞质中有preS2蛋白表达，H－E染色发现转基因小鼠肝组织中央静脉周围有淋巴细胞聚集。将这2只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F2代。结论：本研究成功建立了稳定遗传3’末端缺失的preS/S基因并表达preS2蛋白的转基因小鼠C57－TgN(preS/S^t)SMMU，它将是体内研究3’末端缺失的preS/S基因的表达产物在体内的生物学作用及其与肝细胞内细胞癌基因的转录激活之间关系的理想动物模型。     

人血管生成素1和VEGF基因腺相关病毒共表达系统的构建

目的 :建立一个可同时表达人血管生成素 1(Angiopoietin 1)和血管内皮生长因子 16 5 (VEGF16 5 )的重组腺相关病毒 (AAV)载体基因转移系统 ,为下一步的研究做准备工作。方法 :利用PCR技术 ,获取目的基因Angiopoietin1和VEGF16 5 ,Angiopoietin 1的上游含有HindⅢ位点 ,下游含有BamHⅠ位点 ,VEGF16 5的上游含有BglⅡ位点 ,下游含有BamHⅠ位点。通过重组DNA技术 ,利用过渡质粒pZero 中含有的BamHⅠ、BglⅡ、HindⅢ、NotⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、SalⅠ、BspHⅠ、KspⅠ酶切位点以及pAAV MCS中含有的相应粘端互补的酶切位点 ,将Angiopoietin 1和VEGF16 5亚克隆进入pAAV MCS。结果 :测序证实Angiopoietin 1和VEGF16 5与GeneBank提供的原始序列完全一致。酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全一致。在新的重组质粒中 ,Angiopoietin 1和VEGF16 5各有一套CMV启动子和PolyA终止子系统。结论 :Angiopoietin 1和VEGF基因AAV共表达系统的构建成功 ,为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。     

A Comparative Study on Serum PreS2 and Polymerized Human Serum Albumin Binding Activity in Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection

Antiserum against PreS2 peptide was raised with a synthetic polypeptide from the rabbits.The anti-preS2 antibody and polymerized human serum albumin were used as reagents in aradioimmunoassay to detect preS2 and polymerized human serum albumin bindingactivity respectively. Both were absent in patients with hepatitis A or HBsAg negative chronic liver di-seases. In biopsy - proven patients with chronic active hepatitis (CAH)B, prevalences of bothmarkers were significantly higher at exacerbation that at remission stage of the disease, and so werein CAH than in chronic asymptomatic HBV carrier (AsC) with normal histology. Besides, the pre-valences were significantly higher in HBeAg positive group than in anti-HBe positive group.However, the polymerized human serum albumin binding activity and the preS2 were undoubtedlynot the same, as the prevalence of the latter was only 56.7% of the former.     

乙型肝炎病毒核心基因克隆及其重组体的构建

【目的】构建含乙型肝炎病毒 (HBV)编码核心蛋白 (HBcAg)的核心 (C)基因的真核表达重组体 ,以进行核酸免疫及相关研究。【方法】以含HBV(ayw亚型 )全基因序列的质粒pHBV1为模板 ,用PCR的方法获得编码HBcAg的C基因片段(nt1889～ 2 45 7) ,该基因片段两端设计了BamHⅠ和EcoRⅠ的限制性内切酶位点 ,以便通过定向克隆将其插入真核表达质粒载体pcDNA3相应的多克隆位点。【结果】经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,以及重组体插入片段的DNA序列测定 ,证实成功地构建了含C基因的真核表达重组体pcDNA3 HBc。【结论】pcDNA3 HBc的构建成功为研究其表达及进行动物免疫研究提供了物质基础。     

口服抑毒调平液对慢性乙型肝炎患者Th_1/Th_2细胞因子的调节作用

目的观察抑毒调平液对慢性乙肝患者Th_1/Th_2细胞因子的影响。方法 60例慢性乙型肝炎(中度)患者按随机双盲原则分为治疗组、对照组(每组30例)。两组分别口服抑毒调平液或安慰剂。收集治疗前、治疗后停药时及停药3月末空腹血清标本,用酶联免疫吸附法检测细胞因子白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-12、干扰素-γ。另选30例年龄、性别与治疗组、对照组无差异的正常人作正常组。结果治疗前治疗组、对照组患者血清IL-2、IFN-γ、IL-12的水平及IFN-γ/IL-4明显低于正常人(P<0.05),IL-4的含量明显高于正常人(P<0.05),治疗组与对照组患者间上述各项指标比较均无显著差异(P>0.05);治疗后停药时、停药3月末治疗组IL-2、IL-12、IFN-γ、IFN-γ/IL-4的值持续增加(P<0.05),IL-4持续下降(P<0.05),而对照组无明显变化(P>0.05)。结论抑毒调平液上调血清中IL-2、IL-12、IFN-γ的含量及IFN-γ/IL-4的比值,下调IL-4的含量,促使Th_1/Th_2分泌的细胞因子比值恢复平衡,至少维持治疗结束后3个月。     

乙型肝炎病毒X基因蛋白诱导人类白细胞抗原DR表达

乙型肝炎病毒(HBV)所致的肝细胞坏死,被认为是与人类白细胞抗原(HLA)有关的MHC限制的T细胞为主的免疫应答的结果。本研究证实,转染HBV基因组或X基因后的人肝癌细胞系可诱导HLAⅡ(即HLA DR)表达。核转录及RNA杂交分析提示表达X基因的细胞其HLA DR mRNA水平增加,X蛋白增加该基因的转录。氯霉索乙酰基转移酶(CAT)基因分析进一步提示,X蛋白通过作用于HLA DR基因上游的调节序列诱导HLA DR表达。结果表明:X蛋白可能通过调节HLA DR表达参与HBV感染的免疫发病机理。     

白细胞介素-2-乙肝病毒前S抗原融合蛋白在真核细胞中的分泌表达

为了协同人白细胞介素-2（IL－2）与乙型肝炎（乙肝）病毒（HBV）前S抗原（preSAg）的生物学功能，探索能打破持续性感染者对HBV表面抗原（HBsAg）的免疫耐受，诱导机体对HB－sAg和preSAg产生体液和细胞免疫应答的基因免疫与治疗药物，用基因重组方法构建了IL－2和HBV完整preSAg的真核表达嵌合基因及表达质粒pCWIIP。pCWIIP转染的Cos－7细胞能分泌表达IL－2－preS融合蛋白，其表达效率与pCIIL－2转染的细胞表达IL－2一致，细胞上清中IL－2活性单位大于3×103u／ml，并用酶免疫实验法（EIA）检测了preSAg，而其细胞裂解液中IL－2活性很低，preSAg未检测到。本文结果说明preSAg2～19位氨基酸序列的滞留效应是可以克服的。该发现不仅为构建带完整preSAg的新型乙肝疫苗和特异性免疫治疗剂提供了理论与实验依据，而且对蛋白质分泌表达调控的研究也有一定意义。     

B1细胞与乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒的感染

病毒性肝炎的发病机制迄今为止尚未完全明确,乙型肝炎病毒(HBV)及丙型肝炎病毒(HCV)所致肝炎可能是肝脏细胞免疫防御反应病毒入侵的结果。B1细胞是新近认识的一种B细胞亚群,CD5分子是其特征性分子标志。CD5+B1细胞是机体防御肝炎病毒入侵的重要天然免疫细胞。CD5+B1细胞与机体内HBV感染的慢性化密切相关。CD81与CD5间通过分子串话机制直接参与HCV对宿主细胞的感染。