深低温冻存对SLE患者外周血CD34+ 阳性细胞活性的影响

目的探讨深低温冻存对系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血CD34^＋细胞活性的影响。方法ClinMACS磁性分选系统分选CD34^＋细胞。采用5％二甲基亚砜,6％羟乙基淀粉和4％人血白蛋白作冷冻保护剂,-80℃直接冻存。观察不同时相复温后的细胞台盼兰拒染率、CFU—GM计数以及移植后造血恢复时间。结果SLE患者与正常人脐血CD34^＋细胞冻存后1～90d,细胞活性无明显差异。SLE患者与非自身免疫性疾病患者同样方法冻存造血干细胞,移植后造血恢复特征相似。结论-80℃深低温保存对SLE患者造血干细胞活性无影响。     

免疫磁珠分选系统在急性髓系白血病干细胞分离中的应用

目的：采用免疫磁珠分选系统（MACS）分离人白血病骨髓CD34^＋、CD38^-干细胞群。方法：收集人白血病骨髓，Percoll密度梯度离心分离单个核细胞，CD34、38磁性标记，MACS分离纯化CD34＋、CD38^-干细胞群，流式细胞仪检测其纯度和分选前后CD34^＋、CD38^-百分比，计算回收率。结果：分选后的CD34^＋、CD38细胞纯^-度达72．6±3．2％，回收率85．8±1．2％。结论：免疫磁珠分选系统是一种有效的白血病干细胞分离提纯方法，所得细胞纯度比较高。     

免疫磁珠法纯化小鼠CD34^＋造血干细胞

目的 探讨免疫磁珠法（MiniMACS)能否用于纯化小鼠骨髓CD34^ 造血干细胞。方法 应用免疫磁珠纯化小鼠骨髓CD34^ 细胞，流式细胞仪（FACS）评估纯化效率，检测纯化后的细胞活力。结果 纯化后CD34^ 细胞纯度81．5％（范围76．80％－85．38％），回收率47．54％（范围40．50％－54．31％），纯化前后细胞活力不受影响（P＝0．169）。结论 应用MiniMACS纯化小鼠骨髓可获得高纯度CD34^ 细胞，并不影响细胞活力。     

多发性硬化患者造血干/祖细胞及其亚群富集纯化的研究

目的：获得高纯度造血干／祖细胞(HSC／HPC)及其亚群,用于多发性硬化(MS)造血干细胞移植治疗和生物学特性的研究．方法：用免疫磁珠法(MiniMACS)从MS患者骨髓中富集CD34^ 细胞后再用荧光激活细胞分选(fluorescent acti—vated cell sorter,FACS)纯化CD34^ ／CD38^ 和CD34^ ／CD38^-细胞亚群．结果：MiniMACS分选的CD34^ 细胞群纯度达91％,FACS分选的CD34^ ／CD38^-和CD34^ ／CD38^ 两细胞亚群纯度可达98％以上．结论：MiniMACS和FACS两者结合可迅速大量纯化HSC／HPC及其重要细胞亚群,可用于临床MS造血干细胞移植、基因治疗和研究HSC／HPC及其亚群生物学特征．     

总有核细胞和CD34＋细胞数对脐血移植效果的分析

目的探讨总有核细胞和CD34’细胞数量在脐血移植中选择合适脐血的预示作用。方法分析不同总有核细胞数（TNc）和CD34＋细胞数输入量、供受者人类白细胞抗原（HLA）不相合数间脐血移植效果的差异,评价TNC和CD34＋细胞数的作用。结果89例白血病患者植入75例。植入率为84．3％。中性粒细胞（ANC）≥0．5x10’几、血小板≥20x106／L、血小板≥50x109／L的时间分别为17d、34d和46d。TNC输入量与移植植入率呈正相关,与生存率无关。CD34＋细胞输入量与移植植入率和生存率有正相关性。供受者HLA配型不相合位点数差异对移植后的植入率和生存率无影响。结论脐血是一种替代骨髓造血干细胞应用于白血病患者移植的较好来源。TNC和CD34＋细胞数输入量对移植效果存在正性影响作用,是脐血移植中选择合适脐血的重要参考指标。     

﹣80°C冰箱长期冻存外周血造血干细胞研究

目的对外周血造血干细胞活性在深低温（-80℃）下保存3年的效果进行评价。方法对30例经MCS＋血细胞分离机采集所得的外周血造血干细胞加入细胞冻存保护剂分别予以-196℃液氮冻存和-80℃冰箱深低温冻存,并检测和比较冻存前后单个核细胞（mononuclear cells,MNC）、CD34＋细胞的计数及细胞回收率,细胞活性。结果 -80℃冰箱冻存组MNC、CD34＋细胞冻存3年与冻存前比较差异均无统计学意义冻存3年后MNC回收率与冻存1年后比较差异无统计学意义。3年后-80℃冰箱冻存组干细胞与-196℃液氮冻存组比较,差异无统计学意义。结论 -80℃冰箱深低温保存法快速、简便、安全、费用低廉,可有效用于外周血造血干细胞长期保存。     

大鼠骨髓Thy-1.1+干细胞的分选与表型研究

目的采用免疫磁珠分选系统（MACS）分离大鼠骨髓Thy-1.1^＋干细胞群，研究Thy-1.1^＋干细胞与肝脏分化潜能相关的表型特征。方法收集大鼠胫骨、股骨骨髓细胞．Percoll密度梯度离心分离单个核细胞，Thy-1．1单抗标记，间接免疫磁珠系统分离纯化Thy-1.1^＋干细胞群，流式细胞仪检测其纯度，锥虫蓝拒染法检测细胞活力，计算回收率。同时流式检测分选前细胞及分选后Thy-1.1^＋干细胞的表型。结果经MACS分选后Thy-1.1^＋细胞比例由56．65％升至94．20％；分选后的细胞活力为99．62％，与分选前的99．79％无明显差异；MACS分选Thy-1.1^＋细胞的回收率为64．65％。Thy-1.1^＋细胞不表达CD34和c-kit；高表达β2微球蛋白（β2M）和CD45；部分表达Flt-3。分选前后CD34^＋和c—kit^＋比例无显著差异；β2M^＋的比例由93．38％下降至86．39％（P〈0．05）；CD45^＋和Fit-3^＋的比例则由67．18％、14．36％升高至分选后的81．12％和58．72％（均P〈0．01）。结论MACS方法能有效分选大鼠骨髓Thy-1.1^＋干细胞群，所得细胞纯度高，细胞活力保持好。大鼠Thy-1．1抗原与CD34、c—kit分子无明显相关性；而与CD45、Fit-3有一定的正相关性；与β2M呈一定的负相关性。     

胎盘问充质干细胞对骨髓、脐血、胎盘不同来源造血干细胞的体外扩增支持作用比较

目的研究胎盘间充质干细胞（PDMSC）对骨髓、脐血、胎盘来源的CD34^＋造血干细胞体外扩增的支持作用。方法用酶消化方法从胎盘组织分离出贴壁细胞。流式细胞仪测定。用免疫磁珠法从骨髓、脐血、胎盘的单个核细胞里分离出CD34^＋细胞,建立以HPDMSC饲养层的CD34^＋细胞培养体系,并以无饲养层的培养体系作为对照。结果人胎盘中可以分离出hpdmscs,并可以证明其为间充质干细胞。以HPDMSCS作为以上三种来源的造血干细胞的滋养层,对胎盘来源的造血干细胞支持作用明显优于其他两组,脐血次之,骨髓来源的造血干细胞最差。结论胎盘间充质干细胞具有体外造血支持作用,可以作为骨髓、脐血、胎盘不同来源造血干细胞体外扩增的滋养层,尤其适于胎盘来源的造血干细胞。     

-80℃冻存外周血干细胞21例分析

目的：探索一种操作简单、干细胞回收率和存活率高、成本低廉的外周血浆存方法。方法：采用终浓度为5％二甲基亚砜（DMSO），3％羟乙基淀粉（HES）和4％人血白蛋白（HSA）的干细胞保护剂直接－80℃冰箱冰存外周血干细胞，并检测不同时相点（1、3、6、9、12个月）外周血干细胞的细胞活性，单个核细胞（MNC）和CFU－GM、CD34^ 细胞的回收率。结果：随着保存时间的延长，观察到12个月时，冻存干细胞的细胞活性、MNC回收率和CD34^ 细胞回收率分别为86．46％、88．58％、87．65％，与冻存1个月相比无统计学差异（P＞0．05），足以保障干细胞移植后造血重建的成功。结论：5％DMSO，3％HES和4％HAS作为干细胞冷冻保护剂直接－80℃冰箱冻存外周血干细胞是一种简便、实用、安全、可靠、成本低的外周血干细胞冻存方法，具有广泛的临床推广价值。     

人胎盘源间充质干细胞对脐血单个核细胞体外生长的支持作用

目的探讨人胎盘源问充质干细胞（PMSCs）对脐血单个核细胞（MNCs）体外生长的支持作用。方法将人胎盘组织经胶原酶消化、贴壁培养获得人PMSCs，用流式细胞仪检测细胞表面标志。以密度梯度离心法分离脐血MNCs和传代后的PMSCs进行共培养，通过细胞计数和流式细胞仪分别检测细胞的生长情况。结果从人胎盘组织中成功分离和培养PMSCs，经流式细胞仪检测其表型为CD29^＋,CD44^＋,CD105^＋、CD106^＋、CD166^＋、CD34^-,CD45^-、HLA—DR^-。人PMSCs＋脐血MNCs共培养组的细胞总数和CD45^＋细胞数在各培养时间点均明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。在培养第7天，CD45^＋、CD14^＋及CD19^＋细胞数共培养组也明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。结论人PMSCs可以作为滋养层细胞有效支持脐血MNCs的体外生长。     

脐血造血细胞的冷冻保存方法的比较

目的：比较程控降温和－70℃冰箱直接保存脐血造血细胞对细胞活性的影响及免疫磁珠分离法对细胞生物学活性的影响。方法：用密度梯度离心法分离出脐血中单个核细胞后，采用联合冷冻保护剂经程控降温后存放于液氮和直接存放于－70℃冰箱两种方法冷冻保存一个月，从细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率等方面比较这两种冷冻方法的优劣。另外，用免疫磁珠分离法正性分选脐带血中CD34＋细胞，流式细胞仪计数分选前后的CD34细胞的纯度及回收率，并分别进行分选前后的细胞培养。结果：细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率在冷冻的两组间差异不显著。用免疫磁珠分选后CD34＋细胞纯度达88.3%，回收率为46.2%，分选后的CD34＋细胞比分选后CD34－细胞的细胞活力及集落形成能力明显要高。结论：两种方法均可对脐血造血细胞进行保存。免疫磁珠分选法能够提供高纯度的造血干细胞，其分选过程不会影响细胞的活力及集落形成能力，为CD34＋细胞分选和移植的临床应用提供实验依据。     

脐血造血细胞的冷冻保存方法的比较

目的 :比较程控降温和 - 70℃冰箱直接保存脐血造血细胞对细胞活性的影响及免疫磁珠分离法对细胞生物学活性的影响。方法 :用密度梯度离心法分离出脐血中单个核细胞后 ,采用联合冷冻保护剂经程控降温后存放于液氮和直接存放于 - 70℃冰箱两种方法冷冻保存一个月 ,从细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率等方面比较这两种冷冻方法的优劣。另外 ,用免疫磁珠分离法正性分选脐带血中CD34+细胞 ,流式细胞仪计数分选前后的CD34+细胞的纯度及回收率 ,并分别进行分选前后的细胞培养。结果 :细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率在冷冻的两组间差异不显著。用免疫磁珠分选后CD34+细胞纯度达 88.3% ,回收率为 4 6 .2 % ,分选后的CD34+细胞比分选后CD34 细胞的细胞活力及集落形成能力明显要高。结论 :两种方法均可对脐血造血细胞进行保存。免疫磁珠分选法能够提供高纯度的造血干细胞 ,其分选过程不会影响细胞的活力及集落形成能力 ,为CD34+细胞分选和移植的临床应用提供实验依据     

Transwell培养体系中人AGM区基质细胞支持脐血CD34+细胞造血

[目的]探讨Transwell系统中人胚主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐带血造血干/祖细胞的造血能力长期维持及扩增的作用.[方法]采用免疫磁珠方法分离人脐带血CD34 细胞,接种于底层铺有人AGM区基质细胞的Transwell培养板的Inserts中,非接触共培养7～35 d,每星期取样检测细胞总数,用半固体培养基分析CFU-C及HPP-CFU集落形成数,流式细胞术检测CD34 、CD34 CD38-细胞百分率.[结果]在Transwell中非接触共培养条件下,人AGM区基质细胞培养体系较胚胎躯干基质细胞和无饲养层培养体系对有核细胞总数、CFC和CD34 细胞均具有明显的扩增作用,共培养14 d的CD34 、CD34 CD38-造血干/祖细胞均获得峰值扩增(2.62±0.8和2.15±1.04,P<0.05),而MNC总数和CFC均在21 d获得最大扩增(32.5±4.3和4.2±0.6倍,P<0.05).克隆分析发现CFU-Mix、CFU-GM、BFU-E在共培养4～5星期后均仍然可见.原始祖细胞HPP-CFC在3星期也得到2.23倍的扩增,较空白及hFT对照组均有显著性差异(P<0.05),并在共培养35 d后仍可见HPP-CFU集落形成.[结论]人AGM区基质细胞hAGM-S3/hAGM-S4均具有造血支持作用,在非接触共培养条件下中可长期维持脐血中造血干/祖细胞的多系造血能力和高增殖潜能达21～35 d,对脐血CD34 /CD34 CD38-细胞数也有一定程度的扩增作用.     

不同的冻存方法对脐血CD34~+细胞的影响

目的 :研究不同冻存方法对脐血CD34+ 细胞的影响 ,探讨脐血CD34+ 细胞先分离后冻存的可能性 ,以寻找脐血保存的更好方法。方法 :对 31份脐血采用全脐血直接冻存 ,分离为单个核细胞冻存 ,和分离为CD34+ 细胞冻存 ,3种不同的冻存方法 ;用造血祖细胞培养技术、活细胞染色技术、流式细胞技术等方法研究冻存前后脐血造血祖细胞活性的变化。结果 :冻存后细胞活度下降 ,集落形成率下降 ,以全脐血冻存组为甚 ;CD34+ CD38- 比例冻存后增高。结论 :先分离后冻存法可行 ,且具有减小冻存体积 ,对造血祖细胞损伤较小的特点 ;早期造血祖细胞可能更能耐受冻存处理     

海藻糖对脂肪细胞冻存后存活率的影响

目的：探讨海藻糖作为冻存保护剂对脂肪组织冻存后存活率的影响。方法：抽吸成年女性腹部或大腿脂 肪颗粒,经离心纯化后,分3组：海藻糖组、胎牛血清+10%DMSO组、生理盐水组。于–196 ℃下冻存3个月后,用HE 染色、葡萄糖转移法、肌酸激酶法检测脂肪细胞存活情况。结果：海藻糖组及胎牛血清+10%DMSO组脂肪细胞活性 均高于生理盐水组(P<0.05);海藻糖组与胎牛血清+10%DMSO组脂肪细胞活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论：海 藻糖作为冻存保护剂能明显保持冷冻脂肪细胞活性,脂肪组织冷冻保存3个月后可用于临床移植。     

人脐带间充质干细胞对脐血CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠体内造血重建的影响

目的 探讨人脐带间充质干细胞对脐血CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠体内造血重建的影响.方法 将3.5×10~5个脐血CD34~+细胞单独(单移植组)或与5.0×10~6个人脐带间充质干细胞共同(共移植组)输入经~(137)Cs 3.0Gy照射后的NOD/SCID小鼠体内,观察移植后6周内小鼠外周血象的变化情况.于移植后第6周处死小鼠,采用流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏及外周血人源细胞(hCD45~+)含量,并分别检测小鼠骨髓中人源淋巴系(CD3/CD19)、粒系(CD33)、单核系(CD14)、血小板(CD61)、红系(CD235a)等各系血细胞比例,比较间充质干细胞共移植对CD34~+细胞植入率的影响.结果 移植后3周,两组小鼠外周血象开始有不同程度恢复;移植后6周,共移植组外周血白细胞和血小板计数均已达高峰,明显高于单移植组(P<0.05),两组小鼠的红细胞计数差异无统计学意义(P>0.05).移植后6周,共移植组骨髓及外周血中人源细胞hCD45~+CD34~+比例分别为(42.66±2.57)%和(4.74±1.02)%,明显高于单移植组的(25.27±1.67)%和(1.19±0.54)%(P=0.006).移植后6周,共移植组小鼠骨髓内的CD19~+、CD33~+、CD14~+、CD61~+和CD235a~+细胞比例均明显高于单移植组(P<0.05),CD3~+T淋巴细胞比例明显低于单移植组(P=0.003);CD19~+B淋巴细胞得到优势扩增,明显高于其他各系血细胞比例(P<0.05).结论 脐带间充质干细胞与脐血CD34~+细胞共移植可促进造血干细胞的植入,缩短CD34~+细胞移植后造血恢复时间.     

脐血造血干/祖细胞体外扩增后端粒酶活性的表达

目的 探讨脐血造血干／祖细胞在不同细胞因子支持的体外扩增过程中端粒酶活性的表达及意义。方法 应用PCR—ELISA方法检测脐血造血干／祖胞体外扩增前后的端粒酶活性、细胞扩增倍数及免疫表型的变化。结果 新分离的脐血CD34^ 细胞表达弱的端粒酶活性，体外培养7d，细胞端粒酶活性达最高，干／祖细胞扩增倍数也明显增高，随着培养时间的延长，细胞分化成熟，端粒酶活性减低。结论端粒酶的活性的升高与造血干／祖细胞的扩增相一致；从临床应用价值来看，脐血CD34^ 细胞体外扩增时间应以7d内为宜；IL-3促分化能力大于G-CSF。     

4℃冰箱保存骨髓及外周血造血干细胞

目的　为骨髓造血干细胞 (BMSC)及外周血造血干细胞 (PBSC)的短期保存建立简便有效的方法。方法　采用自体血浆为骨髓单个核细胞 (BMMCs)及外周血单个核细胞 (PBMCs)冷藏营养液 ,直接置BMMCs及PBMCs于 4℃冰箱中保存 ,分别在当天至第 7d选择性测其细胞活力 ,CD+ 3 4 细胞阳性率及粒 -单系造血祖细胞 (CFU -GM )集落形成能力。结果　BMMCs及PBMCs置 4℃冰箱保存 3d后 ,台盼兰拒染率、CD+ 3 4 细胞回收率和CFU -GM回收率分别达 80 %以上 ;保存 4d后 ,上述三项指标仍达 70 %以上。结论　当患者接受高剂量化疗时用此方法能在 4d内安全地保存BMSC或PBSC。     

脐血CD_(34)~+细胞体外扩增的实验研究

目的　探讨脐血造血细胞体外扩增及其移植的最佳时期。方法　用免疫磁珠法分离纯化人脐血CD+34细胞 ,从CD+34细胞不同体外培养系中取样检测细胞总数、CD+34细胞百分率和CFC(包括CFU -GM和BFU-E)。结果　A组 (加rhSCF、rhIL - 3、rhG -CSF、rhEpo及rhTPO)与B组 (加rhFL、rhIL - 3、rhG -CSF、rhEpo及rhTPO)对各阶段造血细胞扩增效果无显著差异 ,C组 (加rhSCF、rhFL、rhIL - 3、rhG -CSF、rhEpo及rhTPO)各项结果均显著优于A组 (P <0 0 1)和B组 (P <0 0 1) ,rhCSF与rhFL有明显的协调效应 ;培养 7d时开始增多 ,培养 14d进入高峰 ,培养 2 1d开始下降 ,培养 2 8d明显下降。结论　C组能明显扩增人脐血造血细胞 ,培养 7～ 14d造血细胞达高峰 ,为移植最佳时间。