MMP-1及TIMP-1在人退变椎间盘髓核中的表达

目的测定MMP-1及TIMP-1在人退变椎间盘髓核中的表达,探讨其在人椎间盘退变发生、发展中的作用。方法选取2009～2010年青海大学附属医院骨科腰椎间盘突出症手术切除髓核标本25例及外伤致胸腰椎骨折切除髓核15例作为对照组。采用免疫组化法检测退变椎间盘髓核细胞中MMP-1及TIMP-1表达。结果在椎间盘髓核细胞中MMP-1的表达病例组的阳性率高于对照组（P〈0.01）;椎间盘髓核细胞中TIMP-1的表达病例组阳性率高于对照组（P〈0.01）。结论退变椎间盘髓核细胞中MMP-1及TIMP-1表达升高,退变椎间盘髓核细胞中MMP-1/TIMP-1失调,在椎间盘突出的发生、发展中发挥重要作用。     

TGF-β1基因转染修饰人退变腰椎间盘髓核细胞

目的　探讨对人退变腰椎间盘细胞以外源性生长因子TGF-β1进行基因修饰的可能性,同时检测相应编码蛋白的表达情况.方法　髓核细胞取自8例因腰椎间盘退变手术病人,在体外进行原代培养,并分作3组.将构建好的分别携带增荧光绿色蛋白EGFP基因（报告基因）和TGF-β1基因的腺病毒载体Ad/CMV-EGFP、Ad/CMV- TGF-β1直接转染细胞,对转染情况进行观察.结果　第一组（Ad/CMV-EGFP转染组）经荧光显微镜下观察有特异性绿色荧光表达,并持续4周,表示外源基因转入成功；第二组（Ad/CMV-TGF-β1转染组）经组化染色证明产生TGF-β1,转染率约30%,而作为对照的第三组则染色基本阴性.结论　采用腺病毒载体可以将TGF-β1基因转染修饰腰椎退变椎间盘细胞,并能表达相应的生长因子TGF-β1,为今后腰椎间盘退变疾病的基因治疗提供了实验基础.     

构建shRNA慢病毒载体抑制U937细胞株VEGFR-1基因的表达

目的构建针对血管内皮生长因子受体1（vascular endothelial growth factor receptor 1, VEGFR-1）基因的siRNA前体表达载体．鉴定其对U937细胞株VEGFR—j基因干扰效率。方法体外设计并合成针对VEGFR-1基因的慢病毒shRNA干扰载体．通过PCR及测序证实载体构建成功。将慢病毒颗粒以最适滴度转染人单核白血病细胞株U937．应用Real—TimePCR、Western印迹法检测抑制效率。结果构建的慢病毒载体的序列通过PCR、测序等鉴定,与设计序列相同。Real—TimePCR检测显示U937细胞干扰组VEGFR-1mRNA表达率下降75．98％,Western印迹法显示U937细胞干扰组VEGFR-1蛋白表达量较空白载体对照组明显减少。结论构建的shRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制U937细胞株VEGFR—1基因的表达。     

Survivin、TGFβ3和TIMP1基因重组慢病毒多表达载体构建及其表达活性检测

目的应用Gateway技术构建生存素(Survivin)、人转化生长因子β3(TGFβ3)和基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)慢病毒多表达质粒,并检测其表达活性。方法应用Gateway技术,以自剪切多肽2A串联Survivin、TGFβ3、TIMP1的3段外源基因,并克隆到慢病毒多表达质粒上,通过RT-PCR和Western-blot技术分别检测质粒转染293T细胞后目的基因mRNA和蛋白质表达水平。结果 RT-PCR和Western-blot检测结果显示,慢病毒多表达质粒成功表达了3种目的基因,且其mRNA和蛋白质表达水平较空载体对照组、PBS对照组明显升高,差异有显著性(F=17.87~69.11,q=6.94~15.47,P<0.05)。结论成功构建了慢病毒多表达质粒pLenti6.3-Survivin-P2A-TGFβ3-T2A-TIMP1,为下一步病毒的制备以及体内实验提供了基础。     

BMP-7与IL-6对人髓核细胞ColⅡ与TIMP-1基因表达的影响

目的探讨不同浓度BMP-7与IL-6作用于体外培养的人髓核细胞对Ⅱ型胶原与TIMP-1基因表达的影响。方法应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）半定量检测不同浓度BMP-7与IL-6作用下体外培养的人髓核细胞中TIMP-1和Ⅱ型胶原基因的表达量。结果IL-6可以下调Ⅱ型胶原基因和TIMP-1基因表达;低浓度的BMP-7可以抵消相同浓度IL-6对髓核细胞的保护作用,高浓度的BMP-7可以促进Ⅱ型胶原基因和TIMP-1基因表达。结论BMP-7可以对抗IL-6作用和正向调节椎间盘细胞Ⅱ型胶原基因及TIMP-1基因表达,提示BMP-7在临床治疗中可能具有逆转早期椎间盘退变的作用。     

转基因髓核细胞移植对兔腰椎间盘退变的影响

目的：椎间盘退变是引起腰背痛的主要原因。将腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）介导的结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）和基质金属蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1) 双基因体外联合转染兔椎间盘髓核细胞后,再移植于退变椎间盘内,观察椎间高度、II型胶原和蛋白多糖合成的变化,以探讨体外延缓或逆转椎间盘细胞退变的方法。方法 20只新西兰大白兔应用CT引导下的微创穿刺法建立兔椎间盘退变模型。以rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1体外转染培养的兔髓核细胞,再将其显微注射于退变椎间盘内作为细胞移植组;退变椎间盘内注入磷酸盐缓冲液（PBS）作为退变对照组;正常椎间盘作为空白对照组。分别于6、10、14周行X线和MRI检查观察椎间高度的变化及椎间盘信号的改变,Western-blot鉴定细胞因子CTGF和TIMP1在椎间盘内的表达,35S整合法测定兔髓核组织蛋白多糖合成率,RT-PCR检测II型胶原及蛋白多糖mRNA的表达。结果 MRI证实CT引导下经皮微创穿刺2周后椎间盘开始退变。与退变对照组相比,MRI显示细胞移植组椎间盘退变明显减轻,转基因兔髓核细胞移植可减缓椎间高度(DHI)下降的发生率,转基因细胞移植组较退变对照组相比,Ⅱ型胶原含量和蛋白多糖的生物合成明显增加,差别有统计学意义（P﹤0.05）。结论 经皮CT 引导下穿刺可成功建立兔椎间盘退变模型。转双基因CTGF和TIMP1 髓核细胞移植可有助于椎间高度的维持,促进椎间盘内蛋白多糖和II型胶原的生物合成,明显延缓椎间盘退变。     

杆状病毒介导的GFP转染与退变的兔椎间盘髓核细胞

目的:检测杆状病毒转染正常与退变的椎间盘髓核细胞的效率以及杆状病毒介导的GFP基因(Ac/CMV/GFP)在正常与退变细胞中的表达水平。方法:取新西兰大白兔的髓核细胞进行离体培养,第1组:健康幼兔;第2组:椎间盘退变模型兔;第3组:椎间盘发生自然退变的成年兔。以200MOI杆状病毒介导的绿色荧光蛋白(GFP)转染离体培养的细胞,于第48h采用流式细胞仪检测转染效率,同时采用HPIAS2000图像分析软件半定量分析外源性GFP基因的表达水平。结果:3组细胞被转染的百分率分别为84.4±3.4,82.9±5.7,81.8±5.5(P>0.05)。外源性基因表达荧光蛋白的光密度值分别为0.0054±0.0029,0.0052±0.0032,0.0056±0.0031(P>0.05)。结论:杆状病毒转染椎间盘髓核细胞的效率与椎间盘退变程度无关,杆状病毒介导的外源性基因能在正常与退变的髓核细胞中高水平的表达。     

小鼠11β- HSD1基因真核表达载体的构建及应用

构建小鼠11β-羟类固醇脱氢酶（11β- HSD1）基因的慢病毒真核表达载体PLJM1-11β-HSD1-GFP,建立小鼠前体脂肪细胞（3T3-L1）高表达11β-HSD 1 基因的稳定感染细胞株,为11β- HSD1基因的功能研究奠定基础。方法利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）从小鼠肝脏cDNA 中扩增11β-HSD1开放阅读框ORF,构建针对11β-HSD 1 基因的真核表达载体,转化感受态DH5α菌株,抽提质粒并进行测序鉴定。用测序成功的质粒和慢病毒包装质粒共同转染293T细胞,产生慢病毒并转染3T3-L1 细胞。根据绿色荧光效率挑取单克隆细胞团筛选出稳定细胞株,通过Western blot鉴定PLJM1-11β-HSD1-GFP转染成功。结果经酶切、PCR 及测序验证,PLJM1-11β-HSD1-GFP 真核表达载体构建成功,并包装慢病毒,绿色荧光效率90%以上,并利用其慢病毒悬液成功感染3T3-L1 细胞,筛选出的稳定感染细胞株的3T3-L1细胞成功高表达11β-HSD1 蛋白。结论成功构建了11β-HSD 1 基因的真核表达载体,并建立高表达11β-HSD 1 的稳定感染细胞株PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1,为进一步研究11β-HSD 1 基因的功能,特别是在肥胖中的研究奠定了基础。     

转染外源性转化生长因子β1基因对兔椎间盘髓核细胞成纤维细胞生长因子表达的影响

①目的探究体内转染腺病毒载体转化生长因子β1(Ad/CMV-hTGF-β1)对椎间盘组织退变的保护作用机制.②方法纯种成年新西兰大白兔10只,随机分为实验组和对照组,每组5只.采取腹部手术入路,暴露腰椎间盘,取20 μL本院骨科实验室构建的以腺病毒为载体的Ad/CMV-hTGF-β1,其滴度为6×106 pfu,注射于腰3、4椎间盘髓核内;对照组仅进行相应的外围手术操作,椎间盘未做任何处理.手术后3周取出椎间盘,通过苏木精-伊红(HE)染色观察髓核组织细胞形态;用免疫组织化学方法观察髓核细胞成纤维细胞生长因子(FGF)的表达;并用VIDAS图像分析系统进行半定量分析.③结果普通HE染色结果显示,2组椎间盘髓核组织形态基本相同.免疫组织化学染色显示,实验组椎间盘髓核细胞FGF的表达比对照组明显增高,差异有统计学意义(t=3.48,P<0.05).④结论体内转染腺病毒载体Ad/CMV-hTGF-β1具有提高椎间盘髓核细胞FGF表达的作用.     

腺病毒介导的基因在人退变髓核细胞的表达

目的 通过对人退变髓核细胞的原代培养，了解其生物学特性，并将绿色荧光蛋白基因转染至细胞内，观察基因在细胞内的表达情况。方法 培养人退变髓核细胞，建立体外髓核细胞培养模型，同时进行细胞活力测定，并用腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染至髓核细胞内，观察基因的表达情况。结果 (1)人退变髓核细胞贴壁及生长的速度均十分缓慢；(2)随着培养时间的延长及传代，细胞活力逐渐降低；(3)转染了绿色荧光蛋白基因的髓核细胞可以持续发出绿色荧光达4周。结论 (1)兔腰椎间盘髓核细胞的生长能力较弱；(2)外源性的基因可以在髓核细胞内得到持续的表达。     

TGFβ1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建TGFβ1基因RNAi慢病毒载体.方法:根据人TCFβ1的mRNA序列选择3个靶序列并根据它们设计合成3对寡核苷酸序列.同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列;将以上4对寡核苷酸序列退火后连人pRNA-U6/Lenti质粒,酶切和测序鉴定后,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293FT细胞,包装产生病毒颗粒.各组病毒载体转染Hela细胞后,运用Real-Time PCR和ELISA检测TGFβ lmRNA和蛋白的表达水平.结果:酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到pRNA-U6/Lenti质粒;各质粒与包装质粒共转染293FT细胞后能产生高滴度的慢病毒载体颗粒;各组慢病毒载体感染Hela细胞后,有两组可以显著抑制TGFβ1mRNA水平及蛋白水平的表达,其中以第一组效果最佳.结论:成功构建了人TGFβ1基因RNAi慢病毒载体.     

血红素氧合酶-1通过NF-κB信号通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡

目的 探讨血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用及机制.方法 采用免疫组化和Western blot检测正常(LVF组,标本来源于年轻的椎体骨折行手术治疗的患者)及退变(IDD组,标本来源于椎间盘退变性疾病行手术治疗的患者)人椎间盘髓核组织中HO-1和磷酸化的P65(p-P65)的表达差异;体外培养退变髓核细胞,通过IL-1β处理增加髓核细胞凋亡,再用载HO-1质粒的慢病毒及小干扰RNA处理髓核细胞后检测凋亡的变化;通过P65抑制剂PDTC抑制p-P65表达后检测髓核细胞凋亡的变化.结果 免疫组化结果显示,HO-1在IDD组中的阳性表达率为(18.58 ±0.59)％,明显低于LVF组(58.26 ±2.48)％ (P ＜0.05),而p-P65在IDD组中的阳性表达率为(40.27±2.03)％,明显高于LVF组(19.75±1.98)％ (P ＜0.05).IL-1β能增加退变髓核细胞的凋亡,同时引起p-P65表达增加,HO-1-siRNA抑制HO-1表达后可以进一步提高髓核细胞凋亡率(P＜0.05),而过表达HO-1处理细胞后能够降低IL-1β引起的凋亡增加,同时降低p-P65表达(P＜0.05).使用P65抑制剂PDTC抑制髓核细胞P65信号通路后,髓核细胞凋亡率明显降低,此时沉默HO-1不能增加髓核细胞凋亡.结论 HO-1能够通过NF-κB通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡.     

慢病毒介导TGF-β3、CTGF和TIMP1联合转染对兔退变椎间盘影响

目的研究慢病毒介导的转化生长因子β3(TGF-β3)、结缔组织生长因子(CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制因子l(TIMP1)联合转染对兔退变椎间盘的影响。方法新西兰大白兔15只,纤维环穿刺法建立椎间盘退变模型,实验组注入携带TGF-β3、CTGF和TIMP1基因的慢病毒颗粒50μL,对照组注入等量空病毒,各组在相同条件下独立培养,分别于术后16、20周对退变椎间盘进行影像学观察。结果实验组与对照组及穿刺组相比,椎间盘退变程度明显减轻,差异有显著性(χ2=9.11、19.05,P<0.05)。结论 TGF-β3、CTGF和TIMPI多基因联合转染后可以起到延缓椎间盘退变的作用。     

转染外源性转化生长因子β1基因对兔髓核细胞凋亡的影响

①目的探讨转染转化生长因子β1(hTGF-β1)基因对兔髓核细胞凋亡的影响,为活化椎间盘细胞功能、预防椎间盘组织退变提供依据.②方法取成年新西兰大白兔5只,将外源性hTGF-β1基因直接注射于L3～4 椎间隙,以注射同样剂量磷酸缓冲液的L4～5作为实验对照.术后3周取出相应椎间盘组织,利用TUNEL免疫荧光组织化学方法观察髓核细胞凋亡情况.应用Vidas图像分析系统进行免疫阳性细胞半定量分析.③结果注射hTGF-β1基因的椎间盘凋亡细胞数明显少于对照组,测得OPTDM值分别为0.002±0.001、0.159±0.041,二者差异有显著性(t=27.83, P<0.01).④结论转染hTGF-β1基因可以明显减少兔椎间盘髓核细胞凋亡的发生.     

白介素-6对人髓核细胞表达基质金属蛋白酶-3和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1的影响

目的研究炎症因子白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）对人髓核细胞表达基质金属蛋白酶-3（MMP-3）和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）的影响。方法①应用不同浓度的IL-6（0ng／ml、10ng／ml、100ng／ml、1000ng／m1）刺激体外培养的人髓核细胞,共同培养72h．~收集细胞;②应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测MMP-3和TIMP-1的表达情况。结果在不同剂量IL-6的刺激下,MMP-3的表达量在实验剂量范围内随着IL-6的剂量加大而呈上升趋势,TIMP-1的表达量实验剂量范围内随着IL-6的剂量加大而呈下降趋势。结论较大剂量的IL-6可抑制人髓核细胞基质的合成,从而促进椎间盘退变。     

微RNA与椎间盘退变:从机制向临床转化迈进

微RNA(miRNA)具有多向调控性,在椎间盘退变的多种机制中发挥调控作用。国内外对椎间盘退变中miRNA的研究多集中于细胞水平,但建模方式仍存在缺陷,不能完全模拟自然退变进程;而椎间盘退变体内建模多采用雄性大鼠的髓核穿刺抽吸法。通过椎间盘注射慢病毒载体和椎弓根注射干细胞外泌体等方式外源性调控miRNA的表达,可使靶基因在转录后表达水平得到调控,显著延缓椎间盘退变进程,为治疗椎间盘退变提供了新的治疗手段和靶点。但因miRNA可同时引起肿瘤疾病的恶化,临床应用安全性尚待评估。     

椎间盘髓核细胞表型的研究进展

髓核细胞特异性表型是识别髓核细胞和研究其生物学行为的基础,同时也是基因干预、细胞移植等生物学修复椎间盘退变的前提。髓核细胞兼有软骨细胞和脊索细胞的表型特点,而特定基因的转录和表达调控又广泛受到椎间盘局部微环境以及椎间盘退行性变的影响。部分髓核细胞亚群还具有祖细胞的生物学特性并表达特定的表型。对髓核细胞表型的研究有助于推动椎间盘退变生物学治疗的进展。     

β-七叶皂苷钠对体外退变椎间盘细胞抗炎作斥及机制研究

目的探讨β-七叶皂苷钠对体外退变椎间盘细胞抗炎作用及机制。方法采用体外培养的退变椎间盘细胞,免疫印迹法检测0、5、10、20μmol／Lβ-七叶皂苷钠作用24h后,炎性因子白介素1（IL-1）、肿瘤坏死因子d（TNF—a）以及相关调控蛋白细胞核因子-KB（NF—KB）、转化生长因子-β,（TGF—B。）的表达变化。结果β-七叶皂苷钠可显著抑制退变椎间盘细胞炎性因子IL-1、TNF—仪表达,退变椎间盘细胞中调控炎性因子表达的蛋白NF—KB在β-七叶皂苷钠作用后表达显著降低,而TGF-β．表达水平显著升高。结论β-七叶皂苷钠可通过抑制NF—KB途径以及上调TGF-β,表达,显著抑制退变椎间盘细胞的炎性反应。     

CTGF和TIMP1双基因体外联合转染恒河猴腰椎间盘细胞对II型胶原和蛋白多糖的影响

目的 建立恒河猴腰椎间盘细胞体外培养模型,研究腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）介导的结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）和基质金属蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1) 双基因体外联合转染恒河猴椎间盘细胞较单基因对II型胶原和蛋白多糖合成的影响的变化,以探讨体外延缓椎间盘细胞退变的方法。方法 应用酶消化法培养恒河猴腰椎间盘髓核细胞,以感染复数（MOI） 为106的rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1及rAAV2-CTGF、rAAV2-TIMP1分别感染髓核细胞,应用Western blot鉴定和RT-PCR检测II型胶原及蛋白多糖mRNA的表达,35S整合法性行蛋白多糖合成率的测定,SP-ABC免疫组化法检测Ⅱ型胶原含量。结果 rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1双基因及rAAV-CTGF、rAAV-TIMP1单基因能够转染恒河猴椎间盘髓核细胞并在其内表达细胞因子。与对照组相比,CTGF可以促进II型胶原及蛋白多糖的合成,TIMP1可以促进蛋白多糖的合成,对II型胶原的合成未见到明显作用;双基因联合感染可以显著促进髓核细胞蛋白多糖和II型胶原的合成。结论 CTGF和TIMP1 单基因转染均可以促进蛋白多糖的合成,CTGF 对 II型胶原的合成亦有促进作用;双基因联合感染可以明显促进蛋白多糖和II型胶原的合成,其效果优于单基因,为多基因治疗椎间盘退变奠定了良好的基础。     

携TGFβ 1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的 :构建携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体。方法 :以逆转录病毒 pRevTRE为载体 ,采用平末端连接法获得含人TGFβ1cDNA3’ -端活性肽编码基因正、反向插入的重组病毒质粒 ,脂质体介导转染包装细胞PA317,获得含TGFβ1正、反义RNA的复制缺陷型逆转录病毒载体 pRevTβ和 pRevTβ-AS ,感染NIH3T3细胞 ,测定病毒滴度。分别转染膀胱癌EJ细胞 ,通过Southern -blot和半定量RT -PCR方法评价载体整合及表达效率。结果 :pRevTβ、pRevTβ-AS载体病毒滴度分别为0.84、0.88×105CFU/ml,EJ细胞外源基因的整合率为100 %,正、反义基因转染细胞内TGFβ1mRNA的相对转录水平为1.89和0.35。结论 :构建的携TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体符合细胞体外转染要求 ,能与肿瘤细胞高效整合 ,有效表达。