缺氧状态对骨形态发生蛋白-2诱导分化体外复合富血小板血浆凝胶的骨髓间充质干细胞的影响

目的研究缺氧状态对骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化体外复合富血小板血浆(PRP)凝胶的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的影响。方法取第三代培养的BMSCs细胞与PRP凝胶相混合,通过构建细胞缺氧模型,根据培养条件的不同确定实验分组:常氧BMSCs+PRP组(A组)、常氧BMP-2+BMSCs+PRP组(B组)、低氧BMSCs+PRP组(C组)、低氧BMP-2+BMSCs+PRP组(D组)。反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)及Western-blotting检测各组成软骨及成骨基因的表达。结果 RT-PCR检测表明C组和D组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达均较A组和B组明显升高;Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶(ALP)在B组的表达最高;A组与B组runt相关转录因子2(Runx2)的表达较C组和D组明显升高。Western-blotting检测结果表明B组和D组的Ⅱ型胶原表达较A组和C组明显升高;C组与D组的HIF-1α表达较A组与B组显著升高;D组的SOX-9表达较其余3组显著升高。所有结果差异均有统计学意义(P0.05)。结论低氧条件能显著促进BMP-2对BMSCs的成软骨诱导分化,同时抑制BMSCs的成骨分化。HIF-1α可能是这一过程的重要调节因子,其可能通过调节SOX-9的表达来发挥促BMSCs成软骨细胞分化的作用。     

低氧诱导因子1α及2α在人BMSCs成软骨分化中的表达规律

目的通过诱导人BMSCs(human BMSCs,hBMSCs)成软骨分化,观察低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)、HIF-2α在分化过程中的表达趋势,为阐明HIF参与调控成软骨分化机制提供依据。方法对已消化的悬浮hBMSCs进行离心沉淀,形成细胞微球。将细胞微球分为2组,对照组加入含2%FBS的H-DMEM培养基,成软骨诱导组加入软骨诱导液,于低氧(2%O2)条件下培养。培养3周后行甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,培养1周行Western blot检测HIF-1α、HIF-2α蛋白表达,培养1、2、3周行实时定量PCR检测成软骨分化关键转录因子及相关标志基因表达。结果甲苯胺蓝染色示,对照组染色细胞核整体分布稀疏,而成软骨诱导组分布致密;成软骨诱导组细胞外基质染色明显较对照组深。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示阳性信号主要位于细胞质内;与成软骨诱导组相比,对照组细胞核分布较稀疏且着色浅。Western blot检测示,培养1周成软骨诱导组HIF-1α和HIF-2α蛋白相对表达量均显著低于对照组(t=8.345,P=0.001;t=7.683,P=0.002)。实时定量PCR检测示,与对照组比较,成软骨诱导组HIF-1αmRNA相对表达量在培养1周时降低、2周时显著升高,差异均有统计学意义(P0.05);3周时两组比较差异无统计学意义(P0.05)。成软骨诱导组培养各时间点HIF-2αmRNA相对表达量均显著低于对照组,Sox-9 mRNA相对表达量均显著高于对照组,差异均有统计学意义(P0.01)。培养过程中,Ⅱ型胶原及Ⅹ型胶原表达呈逐渐增加趋势,第2、3周时两者的mRNA相对表达量显著高于对照组(P0.05)。而成软骨诱导组多聚蛋白聚糖mRNA相对表达量在各时间点均高于对照组(P0.05)。结论 HIF-1α参与诱导hBMSCs成软骨分化过程,但HIF-2α表达在该分化过程中受抑制。     

低氧对成骨生长肽诱导的小鼠间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨低氧对成骨生长肽(osteogenic growth peptide,OGP)诱导的小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖与成骨分化的影响。方法将第三代小鼠BMSCs随机分为四组:对照组(A组,常氧条件下培养);1%O2组(B组,1%O2条件下培养);OGP组(C组,常氧条件下添加OGP培养)、1%O2联合OGP组(D组,1%O2条件下添加OGP)。分别于培养后1天、2天、3天、4天收集细胞,噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)比色法观察BMSCs增殖能力;培养7、14天后收集细胞,可见光比色法检测细胞碱性磷酸酶活性(alkaline phosphatase,ALP);培养1天后收集细胞,ELISA法检测低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)表达,培养3、7天后收集细胞,实时荧光定量PCR检测RUNX2、Osterix表达。结果 MTT结果显示,与C组相比,在培养第2、3、4天D组能明显促进BMSCs增殖(P0.05)。与C组相比,在培养第7、14天D组能明显上调ALP表达(P0.05)。与C组相比,在培养第3、7天D组能明显上调RUNX2、Osterix信使RNA表达(P0.05)。在培养后1天,A组及C组未能检测到HIF-1α蛋白,B组与D组HIF-1α表达明显增加(P0.001)。结论低氧明显增强了OGP促进BMSCs增殖及成骨分化的作用。     

低氧与低氧模拟剂对BMSCs成骨分化影响的对比研究

目的对比低氧培养与常氧条件下低氧模拟剂二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)对小鼠BMSCs成骨分化的影响。方法原代分离培养健康3~4周龄昆明小鼠BMSCs,采用流式细胞术对细胞CD29、CD44、CD90、CD34表面标志进行检测,行成骨、成脂、成软骨诱导分化染色鉴定。取第3代BMSCs分为对照组(A组,常氧条件下培养)、低氧培养组(B组,1%O2低氧条件下培养)及DMOG干预组(C组,常氧条件下加入0.5 mmol/L DMOG培养)。分别于培养1、2、3、4 d采用MTT法检测BMSCs增殖情况,7、14 d检测ALP含量,24 h后采用Western blot法检测低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)蛋白表达,3、7 d采用实时荧光定量PCR检测RUNX2、Osterix基因表达,21 d行茜素红染色观察。结果 BMSCs流式细胞术表面标志鉴定示CD29(+)、CD44(+)、CD90(+)、CD34(-);成骨、成脂、成软骨诱导分化后茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色均呈阳性。MTT法检测示,培养1 d,3组细胞增殖比较差异无统计学意义(P0.05);2、3、4 d,与A组比较,C组均抑制细胞增殖,但差异无统计学意义(P0.05);而B组则促进细胞增殖,差异有统计学意义(P0.05)。培养各时间点,B、C组ALP含量、HIF-1α蛋白相对表达量及RUNX2、Osterix基因相对表达量均显著高于A组,ALP含量及RUNX2、Osterix基因相对表达量C组高于B组,而HIF-1α蛋白相对表达量B组高于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。培养21 d茜素红染色示,A组可见少许结节状红染物质,B组可见中等量红染物质,而C组可见大量红染物质。结论低氧能明显促进BMSCs增殖,DMOG对BMSCs增殖无明显影响;低氧与DMOG均能促进BMSCs成骨分化,且DMOG促BMSCs成骨分化能力更强。     

腺病毒介导BMP-2联合低氧诱导因子1α突变型与单基因BMP-2分别转染BMSCs后成骨效应的比较研究

目的比较腺病毒载体Ad-BMP-2-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-低氧诱导因子1α突变型(hypoxia inducible factor 1αmu,HIF-1αmu)与Ad-巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)-BMP-2-IRES-人源化海肾绿色荧光蛋白1(human renilla reniformis green fluorescent protein 1,hrGFP-1)分别转染BMSCs后的成骨效应,优化成骨细胞种子来源。方法取1月龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs。取第3代BMSCs进行病毒液转染,根据转染病毒液不同将实验分为4组,A、B、C组分别采用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50、100、150和200的Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu、Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1、Ad-CMV-IRES-hrGFP-1(空腺病毒载体)转染细胞,D组为未被转染的BMSCs。选择最佳MOI值进行观察。转染后采用免疫组织化学染色检测BMP-2表达,Western blot检测BMP-2和HIF-1α蛋白表达,ALP活性测定和钙结节茜素红染色检测细胞成骨分化能力。结果 A、B、C组最佳MOI值分别为200、150和100。免疫组织化学染色示,A、B组BMP-2染色呈阳性,C、D组呈阴性;A组阳性细胞数明显多于B组(P<0.05)。Western blot检测示,A、B组BMP-2蛋白表达明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05);A组HIF-1α蛋白表达明显高于其余3组(P<0.05),其余3组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B组ALP活性明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05)。茜素红染色示,A、B组可见明显钙结节,C、D组未见钙结节形成;且A组钙结节数量多于B组(P<0.05)。结论单载体双基因Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu与单载体单基因Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1分别转染兔BMSCs后,前者BMP-2和成骨效应表达均高于后者。     

尼古丁对大鼠骨髓间充质干细胞软骨分化的干预作用研究

目的 从细胞水平证实尼古丁对大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化为软骨细胞的干预作用.方法 大鼠BMSCs传代至第3代,以海藻酸钠微球生物支架进行BMSCs三维培养.加入转化生长因子β1(TGF-β1)进行诱导分化,在细胞分化过程中,分别给予0.1、1、10、100μmol/L尼古丁干预,设对照组.第28天收获细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞代谢活力、阿利新蓝特殊染色检测细胞中氨基葡聚糖的含量、实时荧光定量PCR检测软骨分化标志基因(COL2A1、Aggrecan、COL1A1、COL10A1)的表达情况.结果 诱导培养28 d后,MTT法结果示不同浓度尼古丁干预后的各组细胞代谢活力与对照组细胞相比,没有明显改变;当尼古丁作用浓度分别为0、0.1、1、10和100μmol/L时,其BMSCs海藻酸钠微球的阳性染色区域占切片的百分比分别为90.1％、76.5％、64.8％、44.1％、4.5％;与对照组比较,尼古丁能显著抑制软骨诱导分化下的BMSCs细胞中Aggrecan、COL2A1的表达,同时促进COL1A1、COL10A1的表达(P均<0.05),并且存在浓度依赖性.结论 尼古丁能够明显抑制大鼠BMSCs的软骨分化,导致其软骨分化质量差.     

CDMP-1促进成人骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的 探讨软骨源性形态发生蛋白1(CDMP-1)诱导成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化的可行性及最佳诱导浓度.方法 分离培养BMSCs,免疫荧光法检测BMSCs表面CD34,CD45,CD105表达.采用含0、10、50、100ng/ml CDMP-1的软骨诱导液诱导培养BMSCs 21 d,倒置显微镜观察细胞形态变化;RT-PCR检测不同浓度CDMP-1组细胞Ⅱ型胶原和Aggrccan表达:免疫组化检测Ⅱ型胶原表达;番红O和阿利新蓝染色检测蛋白多糖表达.结果 成人BMSCs呈梭形漩涡状生长,CD44、CD105表达阳性,CD34呈阴性表达.CDMP-1诱导7 d后细胞形态逐渐由长梭形向多边形、多角形转化.不同浓度CDMP-1诱导21 d,Ⅱ型胶原表达量各组间差异均具有统计学意义(P<0.05);Aggrecan的表达CM组和10 ng组之间差异无统计学意义(P>0.05),其他各组间差异均具有统计学意义(P<0.05).免疫组化检测Ⅱ型胶原表达阳性,阿利新蓝和番红O染色均为阳性.结论 含100 ng/mJ CDMP-1软骨诱导液能有效促进成人BMSCs向软骨表型分化.     

核酶基因抑制肝癌细胞低氧诱导因子-1α表达的实验研究

目的 探讨靶向低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)核酶基因对肝癌细胞HIF-1α表达的调控.方法 采用脂质体介导的方法,将靶向HIF-1α核酶基因真核表达载体转染肝癌细胞Hep3B2,并予低氧条件诱导.于转染后48 h采用Western Blotting检测Hep3B2细胞中HIF-1α蛋白的表达水平;荧光报告基因方法检测HIF-1转录活性.结果 Hep3B2细胞低氧诱导后,HIF-1α蛋白表达水平、HIF-1转录活性增高(1.0±0.02),转染核酶基因400 μmol/L后48 h,Hep3B2细胞低氧诱导的HIF-1α蛋白表达水平明显下降,HIF-1转录活性下调(0.12±0.025,P＜0.05).结论 核酶基因可特异性抑制低氧诱导的肝癌细胞HIF-1α的表达,降低其转录活性.     

低氧诱导因子与高原老年骨性关节炎相关性的初步研究

[目的]检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、低氧诱导因子2α(HIF-2α)、促红细胞生成素(EPO),在高原骨性关节炎(OA)患者软骨和血清中的表达水平。[方法]选择高原地区骨关节炎患者11例(A组),亚高原地区骨性关节炎患者12例(B组),亚高原地区正常软骨9例(C组),分别采集血清及关节软骨行ELISA和免疫组化实验,监测HIF-1α、HIF-2α、EPO在血清和软骨中的表达情况。[结果] HIF-1α和HIF-2α在血清中的表达三组间差异无统计学意义,EPO A组高于B组及C组(P0.05),B组与C组组间差异无统计学意义(P0.05);HIF-1α在软骨中表达A组高于C组,而HIF-2α的表达A组和B组均高于C组(P0.05),其中HIF-2αA组高于B组(P0.05),EPO虽然在三组之间也呈现出A组高于B组及C组,但三组间差异无统计学意义。[结论] HIF-1α和HIF-2α与OA的发病相关,且有可能在高原OA患者发病中发挥重要作用。EPO虽然在世居高原人群血清中表达增加,但与OA发病无明显相关。     

低氧预处理对大鼠BMSCs葡萄糖代谢的影响

目的观察低氧预处理对BMSCs葡萄糖代谢的影响,探讨其潜在机制,为干细胞疗法的优化提供理论依据。方法取1～3日龄SD大鼠骨髓,采用密度梯度离心法获得BMSCs,取第4代细胞用于实验。根据处理方法不同将细胞分为4组:A组采用常氧培养24 h;B组以1%低氧浓度培养24 h;C组于低氧预处理前用20μmol/L甲氧雌二醇处理24 h;D组于低氧预处理前用50μmol/L缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)特异的siRNA处理12 h。采用MTT法、生化分析仪及实时荧光定量PCR检测各组BMSCs活力、葡萄糖代谢以及HIF-1αmRNA及葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,Glut-1)mRNA的表达。结果 MTT检测示A、B、C、D组吸光度(A)值分别为387.67±58.92、322.50±50.60、297.00±53.00、286.00±41.00,各组间差异无统计学意义(P>0.05)。与A组相比,B组葡萄糖摄取量和乳酸生成量显著增加(P<0.05);C、D组略高于A组,但差异无统计学意义(P>0.05),但显著低于B组,差异有统计学意义(P<0.05);C、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与A组相比,B组HIF-1αmRNA和Glut-1 mRNA表达均显著上调(P<0.05);C、D组HIF-1αmRNA和Glut-1 mRNA表达较B组大幅度降低(P<0.05),但仍显著高于A组(P<0.05);C、D组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论低氧预处理可上调大鼠BMSCs的葡萄糖摄取和代谢能力,其机制涉及HIF-1 mRNA及其下游基因Glut-1 mRNA的表达上调。     

不同植骨材料在退变性腰椎病脊柱融合术中的应用与疗效比较

目的比较自体骨、同种异体骨、BMP复合骨应用于退变性腰椎病椎间植骨融合术中的临床疗效。方法 2005年1月-2010年1月采用脊柱植骨融合术治疗102例退变性腰椎病患者,根据植骨材料不同,将患者随机分为自体骨组(A组,35例)、同种异体骨组(B组,33例)、BMP复合骨组(C组,34例)。3组患者性别、年龄、病程、病变节段、Meyerding分级、术前椎间隙高度及日本骨科学会(JOA)评分等比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。比较不同时间点3组椎间隙高度、植骨融合率及JOA评分等情况。结果 3组患者均获随访,随访时间2～5年,平均3.2年。术后6～24个月各组椎间隙高度均较术前显著提高(P<0.05);A、C组术后6、12、18、24个月椎间隙高度显著大于B组(P<0.05),A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、C组植骨术后6个月出现融合患者,至24个月A、C组植骨融合率均为100%;B组于术后12个月出现融合患者,至24个月植骨融合率为87.88%,与A、C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。术后12、24个月,各组JOA评分均较术前显著提高(P<0.05);A、C组JOA评分及改善优良率显著高于B组(P<0.05),A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMP复合骨在退变性腰椎病手术椎间植骨中与自体骨基本等效,并优于同种异体骨,且移植骨量充足,无需有创取材,具有融合快、成功率高等特点。     

缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α与自噬相关分子的表达及相关性分析

目的探讨缺氧条件下大鼠髓核细胞中缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达及其相关性。方法取健康成年SD大鼠髓核组织,分离培养髓核细胞并传代。取第3代髓核细胞行HE染色和Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色鉴定后,随机分为4组。A组细胞于常氧条件下(37℃、5%CO2、20%O2)培养,B组细胞于缺氧条件下(37℃、5%CO2、1%O2)培养,C组细胞转染HIF-1α-小干扰RNA后于缺氧条件下培养,D组细胞加入自噬抑制剂3-MA后于缺氧条件下培养。各组细胞培养8 h后,采用Western blot和实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测HIF-1α与自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达情况。结果经分离纯化的第3代大鼠髓核细胞HE染色后细胞质呈淡粉色,细胞核呈蓝黑色;Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色为阳性。Western blot和qRT-PCR检测示,B组HIF-1α、Beclin1和LC3B蛋白及mRNA相对表达量均显著高于A组(P<0.05),C组均显著低于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。D组HIF-1α蛋白和mRNA相对表达量与B组比较差异无统计学意义(P>0.05),Beclin1和LC3B蛋白和mRNA相对表达量均较B组显著降低(P<0.05)。结论缺氧条件能诱导大鼠髓核细胞中HIF-1α和自噬相关分子Beclin1、LC3B的表达,且HIF-1α与自噬相关分子的表达具有相关性,即HIF-1α下调能降低自噬相关分子的表达,而缺氧条件下自噬水平下调对HIF-1α的表达无明显影响。     

两种细胞因子联合应用对骨髓基质干细胞增殖和成骨活性的影响

目的 研究骨形态发生蛋白融合基因-4/7(BMP-4/7)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合应用对体外培养兔骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖和成骨活性的影响.方法 体外培养BMSCs,在第3代细胞培养液中加入不同浓度的BMP-4/7和bFGF,依据加入不同基因浓度组合的不同分为5个实验组(A组:80 ng/mL BMP-4/7,B组:80 ng/mL bFGF,C组:30 ng/mL BMP-4/7+30ng/mL bFGF,D组:50 ng/mL BMP-4/7+50 ng/mL bFGF,E组:80 ng/mL BMP-4/7+80 ng/mL bFGF)和对照组(不加任何因子),采用绘制生长曲线,甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测细胞增殖活力,碱性磷酸酶(ALP)和降钙素(OC)活性检测法比较各组间差异,观察不同浓度的BMP-4/7和bFGF联合应用对兔BMSCs增殖和成骨活性的影响. 结果 传代后第5天对照组个别单核细胞贴壁,呈长梭形;A组细胞增殖,呈旋涡状排列;B组细胞较为密集,部分融合成片;C组细胞呈集落式生长,生长旺盛;D组细胞生长密集,可见明显的钙结节;E组细胞密集,可见细胞性钙结节形成.各组OD值、ALP含量、OC含量随着作用时间的延长而增加,各组不同培养时间的OD值差异均有统计学意义(P<0.01);且C、D、E组均高于A、B组,差异均有统计学意义(P<0.05).C、D、E组内随着作用浓度的增加,细胞增殖及成骨活性增强,呈浓度依赖关系,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 合理的联合应用BMP-4/7和bFGF可促进BMSCs细胞增殖,促进成骨活性,两者对BMSCs有明显的协同增强效应.     

不同浓度重组人BMP-7促进骨髓间充质干细胞复合组织工程支架材料TCP-COL体外构建组织工程软骨的研究

目的观察比较不同浓度重组人BMP-7对骨髓间充质干细胞复合组织工程支架材料TCP-COL体外构建组织工程软骨的影响。方法用梯度离心法获取人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,将扩增的第3代hMSCs以1×10~7/ml的细胞浓度接种在支架材料TCP-COL上,分为三组进行培养：对照组（成软骨诱导液培养）,BMP-7（50）组（成软骨诱导液基础上加入50ng/ml的BMP-7）,BMP-7（100）组（成软骨诱导液基础上加入100ng/ml的BMP-7）。培养2周后进行扫描电镜观察（SEM）,苏木素伊红染色（HE）,阿尔新蓝染色,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色（IHC）,荧光定量PCR（RT-PCR）,糖胺多糖定量（GAG quantification assay）研究。结果扫描电镜与苏木素伊红染色结果显示细胞在TCP-COL生物支架中分布均匀且紧密粘附在材料表面。阿尔新蓝染色,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,二型胶原（F=76.931,P〈0.05）,糖胺多糖（F=63.158,P〈0.05）荧光定量PCR,糖胺多糖定量（F=8.981,P〈0.05）结果显示BMP-7能有效促进人骨髓间充质干细胞复合支架材料TCP-COL体外成软骨,且100mg/ml的浓度应用效果大于50mg/ml。但在COL1基因的表达上,BMP-7（50）组和BMP-7（100）组都显著大于对照组（F=34.823,P〈0.05）。结论 BMP-7能有效促进人骨髓间充质干细胞复合支架材料TCP-COL体外成软骨,且100mg/ml的浓度应用效果大于50mg/ml,但应注意其促进骨质增生的作用。TCP-COL是一种有应用前景的生物支架材料。     

慢病毒介导骨形态发生蛋白-7基因的干细胞用于组织工程骨构建的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其成骨分化,并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨的可行性.方法 实验分4组:BMP-7和eGFI基因转染组(A组)、eGFP基因转染组(B组)、常规成骨诱导组(C组)、未转染组(D组).用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断转染效率;以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、ELISA检测目的基因表达,四唑盐(MTT)实验检测细胞活力,碱性磷酸酶(ALP)活性和Gomori染色榆测成骨情况;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%.RTPCR检测到A组在1300 bp处出现特异性条带,其他组结果阴性;ELISA检测24 h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/mL,种植支架复合培养8周后BMP-7含量为(76.6±7.4)pg/mL;MTT实验显示细胞活性与未转染组比较差异无统计学意义(P>0.05);ALP活性以16 d最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后黏附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

Effect of bone morphogenetic protein-7 transfected bone marrow mesenchymal stem cells on renal injury in rats with chronic renal failure

Objective To observe the bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) modified by bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) gene on the expression of renal BMP-7, transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and vascular endothelial growth factor (VEGF), further to explore its protective mechanism on renal injury in rats with chronic renal failure (CRF). Methods BMSCs with high expression of BMP-7 gene (BMSCs-BMP-7) and empty vector-BMSCs (BMSCs-EV) were obtained by lentiviral-mediated gene transfection. Thirty male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 5 groups, 6 in each group: normal control (CON) group; PBS intervention (CRF with PBS infusion, CRF+PBS) group; BMSCs intervention (CRF with BMSCs infusion, CRF+BMSCs) group; BMSCs-EV intervention (CRF with BMSCs-empty vector infusion, CRF+BMSCs-EV) group and BMSCs-BMP-7 intervention (CRF with BMSCs-BMP-7 infusion, CRF+BMSCs-BMP-7) group. The CRF model was established by 5/6 nephrectomy. The CON group was a sham operation group. The corresponding 12-weeks interventions of each experimental group were performed after 2 weeks of modeling, the rats in the CON group and the CRF+PBS group were injected with 1 ml of PBS through the tail vein, and the other three groups were injected with 1 ml of the corresponding cell suspension once a week. At the time of sacrifice, blood and renal tissue samples were reserved. Serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN) were measured by routine biochemical methods, and the expression of BMP-7, VEGF, TGF-β1 in kidney was assayed by Western blotting. Results At the time of sacrifice, the levels of Scr and BUN in the CRF+PBS group were significantly higher than those in the CON group (all P＜0.01); Compared with the CRF+PBS group, the Scr and BUN of the CRF+BMSCs group, CRF+BMSCs-EV group and CRF+BMSCs-BMP-7 group were decreased to different extents, the differences were statistically significant (all P＜0.01); the Scr and BUN of the CRF+BMSCs-BMP-7 group were significantly lower than CRF+BMSCs group and CRF+BMSCs-EV group (all P＜0.05). The expression of BMP-7 and VEGF were the lowest in the CRF+PBS group. Compared with the CRF+PBS group, the expression of BMP-7 and VEGF in the CRF+BMSCs group, CRF+BMSCs-EV group and CRF+BMSCs-BMP-7 group were significantly increased respectively (all P＜0.05). The expression of the BMP-7 and VEGF in the CRF+BMSCs-BMP-7 group were higher than those in the CRF+BMSCs group and CRF+BMSCs-EV group (P＜0.01). Compared with the CON group, the expression of TGF-β1 in the CRF+PBS group was significantly increased (P＜0.01); compared with the CRF+PBS group, the expression of TGF-β1 in the CRF+BMSCs group, CRF+BMSCs-EV and CRF+BMSCs-BMP-7 group was significantly decreased (all P＜0.01); the expression of TGF-β1 in the CRF+BMSCs-BMP-7 group was lower than the CRF+BMSCs and CRF+BMSCs-EV group (both P＜0.01). Conclusions BMSCs modified by BMP-7 has a protective effect on CRF rats; its protective mechanism may be related to antagonizing TGF-β1 and up-regulation of renal VEGF expression.     

沉默p53和p21基因延缓髓核细胞衰老退变实验研究

目的髓核细胞衰老凋亡是椎间盘退行性变的病理基础,探讨髓核细胞表型分子及延缓髓核细胞衰老退变的机制。方法原代培养8～10周龄雄性SD大鼠髓核细胞,免疫细胞化学染色鉴定髓核细胞表型分子低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)、HIF-1β、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)及Ⅱ型胶原表达。小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)瞬时转染髓核细胞沉默p53、p21后行RT-PCR及Western blot检测沉默效率,siRNA转染前后细胞衰老相关β半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-gal)染色检测髓核细胞衰老变化,流式细胞仪检测髓核细胞周期变化,MTT法生长曲线分析髓核细胞增殖变化。结果免疫细胞化学染色显示髓核细胞表达HIF-1α、HIF-1β、MMP-2及Ⅱ型胶原。第35代髓核细胞转染p53、p21 siRNA后RT-PCR及Western blot检测示p53、p21表达明显受到抑制。第35代髓核细胞SA-β-gal染色阳性率明显高于第1代髓核细胞(P<0.001);正常第35代髓核细胞经p53 siRNA(p53转染组)和p21 siRNA(p21转染组)转染后,SA-β-gal阳性率明显低于正常第35代髓核细胞(正常组)和加入脂质体LipofectaminTM2000而无siRNA的第35代髓核细胞(阴性对照组),差异有统计学意义(P<0.001)。细胞周期分析显示,p53转染组及p21转染组G1期百分比均明显低于正常组和阴性对照组(P<0.05),S期百分比明显高于正常组和阴性对照组(P<0.05)。MTT生长曲线显示转染p53、p21 siRNA后可促进髓核细胞增殖。结论沉默p53、p21基因可通过调节细胞周期而抑制髓核细胞衰老退变,改善椎间盘退变过程;沉默p53、p21基因可能是潜在的治疗椎间盘退行性变的方法。     

辛伐他汀部分阻止尾悬吊大鼠股骨近端骨量的丢失

目的：观察辛伐他汀体内给药对尾悬吊大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖﹑分化的影响。方法18只9周龄雄性SD大鼠被随机分成3组,每组6只：第一组（G1）,正常对照组,每天蒸馏水灌胃;第二组（G2）,尾悬吊组,每天蒸馏水灌胃;第三组（G3）,尾悬吊大鼠每天20 mg/kg辛伐他汀灌胃。实验持续3周,所有大鼠在最后一次灌胃的第二天被处死,取大鼠右侧股骨用双能X线骨密度仪测量骨密度。取大鼠左侧股骨和胫骨骨髓细胞向成骨细胞定向培养,并作如下检测：碱性磷酸酶活性和von Kossa染色分别在细胞培养第16天和25天检测。在细胞培养第21天,采用Real-time RT-PCR检测BMP-2、RANKL mRNA的表达。结果尾悬吊组大鼠骨量低于对照组。全长骨密度（ tBMD）及远端骨密度（ dBMD） G1组显著高于G2、G3组,近端骨密度（ pBMD） G1组显著高于G2组,但与G3组没有区别, G3组高于G2组但没有显著差别。细胞外基质矿化能力（ von Kossa染色）、ALP比活性以及RANKL、BMP-2 mRNA水平各组间均没有显著差别。结论尾悬吊3周可致大鼠骨骨质疏松,辛伐他汀体内给药可部分阻止股骨近端骨量丢失,但不能显著促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化。