携川芎嗪导电水凝胶促进脊髓损伤后血管新生和神经保护的实验研究

目的 探索携川芎嗪导电水凝胶（简称“TGTP”）修复脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）的潜在机制。方法 将72只雌性SD大鼠随机分为4组,假手术组（A组）、SCI组（B组）、SCI+导电水凝胶组（C组）和SCI+TGTP组（D组）。A组仅切除椎板,其余组构建切除2 mm长脊髓的全横断模型。通过BBB评分法和改良Rivlin-Tator斜板实验分别于术前及术后1、3、7、14、28 d评估大鼠后肢运动功能恢复情况。术后7、28 d动物取材,通过免疫荧光染色观察新生血管,采用Western blot评估血管生成素1(angiopoietin 1,Ang-1)、Tie-2蛋白表达;术后28 d采用Western blot进一步评估促血管新生相关蛋白PDGF-B、PDGF受体β(PDGF receptor β,PDGFR-β)、VEGF-A、VEGF受体2(VEGF receptor 2,VEGFR-2)的表达情况。术后28 d,采用Masson染色评估损伤区域瘢痕增生,Nissl染色观察神经元存活,LFB染色检测髓鞘分布和再生情况,免疫荧光染色和Western blot...     

粒细胞集落刺激因子动员BMSCs归巢治疗大鼠脊髓损伤的疗效观察

目的观察粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)动员BMSCs归巢对大鼠脊髓损伤的治疗效果,评估G-CSF动员BMSCs治疗脊髓损伤的可行性。方法将24只成年健康雌性SD大鼠术前12 h于鼠尾静脉注射绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的BMSCs(GFP-BMSCs),并随机分为假手术组(A组)、假手术+G-CSF组(B组)、脊髓损伤组(C组)、脊髓损伤+G-CSF组(D组),每组6只。C、D组采用T10水平脊髓半切法建立脊髓损伤模型,A、B组仅行椎板切除,不损伤脊髓;术后1 h B、D组分别注射G-CSF(10μg/kg·d),连续注射3 d;A、C组注射等量生理盐水。术后1、3、7、14、21、28 d采用BBB评分行大鼠双后肢神经功能评估,并采用ELISA法检测血清TNF-α和基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)表达。术后28 d处死大鼠取脊髓样品行免疫组织化学染色观察细胞因子SDF-1、BDNF、VEGF和TNF-α表达,免疫荧光染色观察GFP-BMSCs阳性细胞及双染荧光黄色的GFP/神经元核抗原(neuronal nuclei,NeuN)阳性神经元细胞和GFP/胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)阳性神经胶质细胞数;并采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果术后各时间点A、B组BBB评分较术前无明显变化;术后1 d,C、D组BBB评分降至最低,后逐渐上升。除术后1 d外,其余各时间点D组BBB评分均显著高于C组(P0.05)。术后3、7、14、21、28 d,C、D组TNF-α和SDF-1含量均明显高于A、B组(P0.05);但D组各时间点TNF-α含量显著低于C组,SDF-1含量显著高于C组(P0.05)。免疫组织化学染色示,术后各时间点C、D组SDF-1、BDNF、VEGF和TNF-α表达均显著高于A、B组(P0.05);D组SDF-1、BDNF、VEGF表达显著高于C组,TNF-α表达显著低于C组(P0.05)。免疫荧光染色示,C、D组GFP-BMSCs、GFP/NeuN、GFP/GFAP阳性细胞数均显著多于A、B组,D组显著多于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。TUNEL法检测示,C、D组凋亡细胞数目显著低于A、B组,D组显著低于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 G-CSF可以动员BMSCs归巢至大鼠脊髓损伤部位并参与修复,其作用可能与其下调TNF-α减少细胞凋亡,上调SDF-1、BDNF、VEGF促进BMSCs迁移有关。     

抑制TNFR/RIPK信号通路对大鼠急性脊髓损伤后神经功能的影响

目的 :探讨应用坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)抑制TNFR/RIPK介导的坏死性凋亡信号通路对大鼠急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的作用。方法:72只雄性SPF级SD大鼠,体重0.25~0.30kg,随机分为4组:假手术组(Sham组,A组)、假手术+Necrostatin-1组(Sham+Nec-1组,B组)、SCI+二甲基亚砜(DMSO)(DMSO组,C组)、SCI+Nec-1组(Nec-1组,D组)。C、D组采用钳夹法制作大鼠急性SCI模型。所有大鼠硬膜下置管,A组不给药,B组和D组造模后30min经导管注射1μl Nec-1(25μg/μl),C组注射等量DMSO,1次/d,至取材时间点。各组分别于造模后12h、24h和3d三个时间点每组取6只大鼠,先行Basso/Beattie/Bresnahan(BBB)评分,再处死动物取脊髓组织。12h时间点动物处死前1h腹腔注射碘化丙啶(propidine iodide,PI)1mg/kg,取材检测脊髓组织PI红染细胞数;24h时取材采用苏木素-伊红(HE)染色观察脊髓损伤情况、尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数目、Western Blot(WB)检测Bcl-2、坏死性凋亡蛋白RIPK1及RIPK3的表达水平;3d时取材行Tunel染色观察细胞凋亡情况。结果:造模后A组和B组各时间点的BBB评分均正常,C、D组各时间点均显著性低于A、B组,D组各时间点的BBB评分均显著高于同时间点C组(P0.05)。造模后12h,D组PI红染细胞较C组明显减少,神经元崩解减轻(P0.05)。造模后24h,A组和B组脊髓组织HE和Nissl染色正常,D组脊髓组织损伤程度和存活神经元数量均优于C组,差异有统计学意义(P0.05);A组和B组Bcl-2、RIPK1及RIPK3均低水平表达,C组RIPK1及RIPK3表达显著性升高,D组Bcl-2表达较C组上调,RIPK1及RIPK3表达显著性下降,C、D两组比较差异均有统计学意义(P0.05)。造模后3d,A组和B组可见少量凋亡小体,C组和D组明显增多,但D组凋亡小体数量较C组明显减少(P0.05)。结论:抑制TNFR/RIPK信号通路可以减轻大鼠急性SCI后的病理变化,改善行为学评分,促进脊髓神经功能恢复。     

BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后VEGF表达及细胞凋亡的影响

[目的]研究骨髓基质细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达及神经细胞凋亡的影响,探讨骨髓基质细胞移植治疗脊髓损伤的机制.[方法]取大鼠股骨和胫骨骨髓培养BM-SCs并传代.参照Taoka's方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型.脊髓损伤后30 min,进行BMSCs或DMEM培养液损伤周围注射.术后3、7和14 d,应用Westem Blot法检测损伤脊髓组织内VEGF蛋白的表达,应用TUNEL方法检测脊髓损伤周围神经细胞凋亡情况.[结果]移植术后3、7、14 d,BMSCs组VEGF蛋白的表达水平呈时间依赖性增加,与DMEM组相比,术后3 d两组VEGF蛋白表达水平没有显著性差异(P>0.05),而术后7和14 d,BMSCs组VEGF蛋白表达水平显著高于DMEM组(P<0.01).此外,与DMEM组大鼠相比,移植术后3、7和14 d,BMSCs移植显著减少脊髓损伤周围区凋亡的神经细胞数目(P<0.05).[结论]脊髓损伤后,BMSCs移植能够增加VEGF蛋白的表达并且抑制神经细胞凋亡.     

BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后VEGF基因和血管生成的影响

目的研究BMSCs移植对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后运动功能恢复、VEGF基因表达和血管生成的影响,探讨BMSCs治疗SCI的机制。方法取5只4周龄Wistar雄性大鼠骨髓,分离培养BMSCs,取第3～4代细胞进行实验。取Wistar雌性成年大鼠87只,体重220～250 g,随机分为假手术组(A组,21只)、DMEM注射组(B组,33只)和BMSCs移植组(C组,33只)。A组仅咬除T8～10棘突和椎板;B、C组参照Nystrom方法制备T8～10 SCI模型,伤后30 min C组注射BMSCs(共3.0×105个),B组注射等量DMEM。于术后3、7、14、28 d采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分法评价大鼠后肢运动功能;术后3、7、14、28 d应用Ⅷ因子免疫组织化学染色行微血管计数观测血管生成情况;术后1、3、5 d应用RT-PCR法检测损伤脊髓组织内VEGF mRNA的表达。结果术后各时间点B、C组大鼠后肢功能随时间延长均有不同程度恢复,各时间点BBB评分与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。术后28 d,C组BBB评分显著高于B组(P<0.05),其余时间点B、C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后3 d,B、C组损伤周围区脊髓灰质腹侧角内微血管数目明显少于A组(P<0.05);术后7、14、28 d与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)。C组术后3、7 d脊髓灰质腹侧角内微血管数目与B组比较差异无统计学意义(P>0.05);但术后14、28 d显著高于B组(P<0.05)。各组术后各时间点损伤周围区脊髓白质内的微血管数目比较差异均无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR检测示,A组大鼠脊髓组织内VEGF mRNA表达水平较低。B、C组与A组相比,于术后1 d开始VEGF mRNA表达增加,3 d时表达达峰值,5 d时表达下降但仍高于A组,各时间点与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05);C组各时间点均高于B组(P<0.05)。结论 BMSCs可能通过上调VEGF基因表达和增加脊髓内新生血管而促进大鼠SCI后运动功能恢复。     

基于TNFR/RIPK1通路探索紫草素对大鼠脊髓损伤的作用及机制

目的:初步探讨紫草素对大鼠急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后神经功能恢复的影响及作用机制。方法:将96只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠分为4组:假手术组,即A组;假手术+紫草素组,即B组;脊髓损伤+二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)组,即C组;脊髓损伤+紫草素组,即D组;每组24只。C、D组采用钳夹法制作大鼠急性SCI 模型。所有大鼠硬膜下置管,A 组不给药,B组和D组造模后30 min 经导管注射紫草素100 mg·kg^-1,C组注射等量 DMSO,每日1次,至取材时间点。各组分别于造模后6、12 h和3 d 每组取8只大鼠,行 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分及造模后1、3、7、14、21 d行斜板实验,再处死动物取脊髓组织。造模后1 h 每组大鼠腹腔注射碘化丙啶(propidine iodide,PI)1 mg·kg^-1,术后24 h取材检测脊髓组织 PI 红染细胞数;24 h 时取材采用苏木素-伊红(haematoxylin eosin,HE)染色观察脊髓损伤情况,尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数量,使用Western-blot技术检测 B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白及凋亡相关蛋白受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)的表达水平。结果:造模后A组和B组各时间点的 BBB 评分均正常,C、D组各时间点均低于A、B组,D组造模后12 h和3 d的 BBB 评分高于同时间点C组(P<0.05)。造模后12 h,D组PI 红染细胞较C 组明显减少,神经元崩解减轻(P<0.05)。造模后24 h,A 组和 B 组脊髓组织 HE 和 Nissl 染色正常,D 组脊髓组织损伤程度和存活神经元数量均优于 C 组(P<0.05)。Bcl-2、RIPK1蛋白在A 组、B 组表达很低; RIPK1 在C组表达明显增高,在D组表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);Bcl-2蛋白在D 组表达高于C 组(P<0.05)。结论:紫草素可减轻大鼠急性SCI后的病理变化,改善行为学评分,促进脊髓神经功能恢复。其具体机制可能与抑制TNFR/RIPK1信号通路介导的坏死性凋亡有关。     

嗅鞘细胞联合VEGF对大鼠损伤脊髓的保护作用

目的探讨嗅球源性嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植联合鞘内重复注射VEGF对损伤脊髓功能恢复的促进作用,以及二者对神经元和神经纤维的协同保护作用。方法取新生2～3 d大鼠嗅球分离纯化培养OECs,于培养9 d用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞。将75只成年雌性Wistar大鼠(体重200～250 g)随机分为5组,A组为假手术组,仅行椎板切除术。B、C、D、E组采用重力打击法制作脊髓损伤模型后,B组术后1 d于脊髓损伤部位分4点共注射DMEM-F12无血清培养基10μL,并每天2次鞘内注射生理盐水10μL,持续1周;C组同上法分别注射DMEM-F12培养基10μL及重组大鼠VEGF165(recombined rat VEGF165,rrVEGF165)25 ng;D组注射含1×105个OECs的DMEM-F12培养基10μL及生理盐水10μL;E组注射含1×105个OECs的DMEM-F12培养基10μL及rrVEGF165 25 ng。术后1 d及术后1～8周每周采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分标准评定大鼠后肢功能恢复情况;术后8周处死实验动物,取材行透射电镜、HE染色观察,并行p75NGF受体(p75 NGF receptor,p75NGFR)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspases-3)、血管性假血友病因子(von Willebrand factor,vWF)免疫组织化学染色,评价损伤脊髓修复情况。结果术后E组大鼠后肢功能恢复较快,8周时BBB评分显著高于其余各组(P<0.05)。透射电镜和HE染色显示:B组有髓神经纤维和神经元受损严重;C、D组损伤轻于B组;E组受损最轻,断端间残存组织较多,有髓神经纤维髓鞘较完整,神经元呈多角形,有少量空泡化的线粒体。免疫组织化学染色示,B、C、D、E组Caspase-3阳性细胞数显著多于A组(P<0.05),B、D组明显多于C、E组(P<0.05),C、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。C、E组vWF阳性血管数多于A、B、D组(P<0.05),但C、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。D、E组均可见p75NGFR阳性OECs。结论 OECs移植联合鞘内重复注射VEGF可显著促进大鼠脊髓损伤修复,部分恢复损伤神经功能,对受损神经纤维和神经元的变性有保护作用,且二者有协同作用。     

FTY720对大鼠急性脊髓损伤后神经功能恢复的影响及相关机制

目的:观察FTY720对大鼠急性脊髓损伤(ASCI)后神经功能的影响,并探讨其相关机制。方法:168只雌性SD大鼠,随机分成A、B、C三组,每组56只,A组(假手术组)大鼠麻醉后仅切除T9椎板,不打击脊髓,缝合后立即以0.3ml生理盐水灌胃。B、C组采用Allen′s法制作T9脊髓损伤模型,B组(对照组)以0.3ml生理盐水灌胃,C组(治疗组)以FTY720按3mg/kg生理盐水稀释至0.3ml灌胃。每组取8只大鼠分别于术后1d、3d、7d、14d、21d行斜板试验及BBB评分。分别于术后6h、12h、24h、48h、72h、7d、21d处死大鼠,每个时间点每组8只,取损伤段(A组取相应部位)脊髓行超薄切片,HE染色观察各组脊髓坏死情况、炎细胞浸润情况、胶质瘢痕形成情况及脊髓空洞大小,并计数各组术后12h淋巴细胞数、术后12h与72h炎性细胞、术后7d胶质瘢痕区细胞,计算伤后21d脊髓空洞面积与脊髓面积比值;取术后6h、12h、24h、72h的切片行SP免疫组化染色观察caspase-3表达及Tunel染色观察细胞凋亡情况,计算相应时间点免疫组化染色阳性细胞比值和凋亡指数。所有数据以SPSS 13.0进行统计学分析。结果:B、C两组各时间点斜板实验及BBB评分均较A组同时间点差(P<0.05),在术后1d时B、C组之间无显著性差异(P>0.05),术后3d、7d、14d、21d时C组优于B组(P<0.05)。HE染色结果显示A组各时间点脊髓形态正常;B、C组脊髓术后6h可见脊髓内出血、血肿形成,术后12h~48h脊髓进行性水肿、损伤中心区出现液化坏死,伴有炎细胞浸润,以中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞为主,至术后72h,损伤中心区形成无组织结构空洞,空洞周围有大量炎细胞浸润,以小胶质细胞/单核细胞为主;术后12h及72h,B组炎细胞浸润程度明显重于C组(P<0.05),术后12h C组淋巴细胞浸润程度相对B组明显减少(P<0.05),术后7d,脊髓水肿减轻,空洞周围形成胶质瘢痕,胶质瘢痕细胞计数B组明显大于C组(P<0.05),术后21d脊髓空洞形成,脊髓空洞比值B组明显大于C组(P<0.05)。SP免疫组化染色和Tunel染色结果显示A组各时间点几乎见不到caspase-3和细胞凋亡表达阳性细胞,B、C组脊髓损术后6h即可见凋亡细胞,到术后24h达高峰,而后随术后时间延长而逐渐减弱,但是仍然保持在较高水平;caspase-3表达与细胞凋亡同步,各时间点C组caspase-3表达阳性细胞比值和细胞凋亡指数均显著低于B组(P<0.05)。结论:FTY720可以显著改善大鼠ASCI后神经功能,其可能是通过抑制脊髓损伤后的炎症反应,减少caspase-3的表达及神经细胞凋亡,从而减轻脊髓继发性损伤。     

低氧诱导因子1α在继发性脊髓损伤中的时序性表达及意义

目的通过观察大鼠继发性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)中低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor lα,HIF-lα)的表达规律,探讨其在继发性SCI发生、发展过程中的作用。方法 SD大鼠66只,雌雄不限,体重(250±20)g,随机分为正常对照组(A组,6只)、假损伤组(B组,6只)和SCI组(C组,54只)。A组不作任何处理;B组大鼠仅行椎板切除术;C组大鼠在椎板切除术后采用脊髓静压法建立T10静压SCI模型。A、B组于术后1h,C组于术后1、3、6、12h及1、2、3、7、14d各处死6只大鼠,取损伤区脊髓组织行HE染色,采用SABC法行免疫组织化学染色观察各组HIF-1α阳性表达情况并计数。结果各组动物均存活至实验完成。HE染色示,A、B组脊髓组织结构致密,细胞核圆而大、染色浅、核仁清晰。C组术后1～12h,损伤局部神经元核固缩,胞体缩小,胞质深伊红染色;1～3d,轴突肿胀,出现空泡,白质内神经髓鞘散乱、崩解破裂;7、14d,胶质细胞增生明显,损伤段脊髓变细,部分灰质崩解坏死,可见囊腔形成。免疫组织化学染色示,A组HIF-1α阳性细胞少,B组稍增多。C组术后1、3h,HIF-1α阳性产物开始增多,主要在脊髓前角神经元和少量胶质细胞中表达;术后1d达峰值,1～3d维持较高水平,此后逐渐减少;14d时仅可见少量白质中的胶质细胞。A、B组间HIF-1α阳性细胞数比较差异无统计学意义(t=1.325,P=0.137)。C组各时间点HIF-1α阳性细胞数均高于A、B组(P<0.05),C组各时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 SCI后HIF-1α表达开始升高,与继发性SCI缺血缺氧密切相关,其表达规律与损伤时间具有相关性。     

大鼠慢性颈脊髓压迫减压术后神经功能改变及其相关机制探讨

目的:观察大鼠慢性颈脊髓压迫减压术后神经功能的恢复情况,探讨其相关机制。方法:30只成年SD大鼠随机分为假手术组(A组,10只)、压迫组(B组,10只)和减压组(C组,10只)。压迫组和减压组在C6~C7椎板下置入聚乙烯醇丙烯酰胺互穿网络水凝胶制作慢性颈脊髓压迫模型,减压组于造模后4周行手术咬除椎板充分减压。三组均于造模后4周行运动诱发电位(MEP);12周先行MRI和MEP检测,再处死大鼠取出颈段脊髓,行大体形态观察和组织学切片,快蓝(LFB)染色观察三组大鼠脊髓组织髓鞘变化,免疫荧光染色观察神经元数目形态及脑源性神经营养因子(BDNF)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化。结果:造模后4周时,B、C组MEP潜伏期与A组比较明显延长(P<0.05),波幅与A组比较明显降低(P<0.05),B组和C组比较潜伏期和波幅均无显著性差异(P>0.05)。造模后12周时MRI轴位和矢状位均显示B组大鼠椎管狭窄,颈脊髓明显受压,A组和C组大鼠椎管无明显狭窄,脊髓无明显受压;三组间MEP潜伏期和波幅两两比较差异有显著性(P<0.05),潜伏期A组C组>B组。大体形态观察示A组脊髓形态正常,B组脊髓受压节段压痕明显,C组压痕较B组轻。LFB染色示A组脊髓组织中髓鞘染色密集,B组轴突脱髓鞘明显,C组脱髓鞘现象较B组轻。免疫荧光染色示A组脊髓组织中可见大量形态正常的神经元;B组脊髓受压节段压迫侧神经元明显减少,胞体固缩;C组脊髓受压节段神经元数量比B组多,有轻微细胞固缩,三组神经元计数有显著性差异(P<0.05),A组>C组>B组。免疫荧光染色示A组大鼠脊髓组织有少量BDNF和VEGF的表达;B组大鼠BDNF表达水平较A组有所升高,且主要集中在脊髓受压部位附近的白质区域,VEGF表达无明显增加;C组BDNF和VEGF表达水平明显增加,主要集中在原受压部位白质周围,灰质部位有少量表达。C组BDNF和VEGF表达阳性细胞计数与A、B组比较有显著性差异(P<0.05);B组BDNF表达阳性细胞与A组比较有显著性差异(P<0.05),VEGF表达阳性细胞数与A组无显著性差异(P>0.05)。结论:大鼠慢性颈脊髓压迫减压术后神经功能有所恢复,其可能是通过减轻神经元损伤和轴突脱髓鞘改变、增加BDNF和VEGF的表达水平,从而促进受损脊髓组织的修复。     

神经干细胞单细胞与神经球治疗大鼠脊髓损伤的对比研究

目的比较神经干细胞(neural stem cells,NSCs)单细胞与神经球移植治疗大鼠脊髓损伤(spinal cordinjury,SCI)的效果,研究两种NSCs移植方法治疗SCI的有效性。方法取成年SD大鼠2只,体外分离脊髓组织并行NSCs培养,取第3代细胞行Hoechst33342、巢蛋白染色及贴壁分化鉴定。另取成年SD大鼠(体重230～250 g)60只,随机分为3组,每组20只,采用改良Allen法制备大鼠脊髓T10损伤模型。各组分别于SCI处缓慢注射5μL生理盐水(A组)、第3代NSCs单细胞(B组)、第3代NSCs神经球(C组)。分别于术前及术后3、7、14、21、28 d采用BBB行为功能评定量表评定各组大鼠后肢功能;术后各时间点取材行HE染色和微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)免疫组织荧光染色观察。结果经形态学观察及鉴定,所培养的细胞为NSCs。术后3 d各组BBB评分较术前显著下降,术后3、7 d各组间BBB评分比较差异均无统计学意义(P>0.05);随时间延长BBB评分不同程度增加,术后14、21、28 d,B、C组BBB评分优于A组,C组优于B组,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。HE染色示C组较A、B组脊髓结构清晰,瘢痕形成少。MAP-2免疫组织荧光染色示,术后3、7 d各组间阳性细胞数比较差异均无统计学意义(P>0.05);术后14、21、28 d,B、C组阳性细胞数显著多于A组,C组多于B组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用NSCs神经球移植较单细胞移植更明显促进NSCs向神经元分化,更有利于SCI后下肢功能恢复。     

BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后VEGF受体胎肝激酶1表达的影响

目的研究BMSCs移植对大鼠脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后VEGF受体胎肝激酶1（fetal liver kinase 1，Flk-1）基因和蛋白表达的影响，探讨BMSCs移植修复大鼠SCI的机制。方法取4周龄雄性Wistar大鼠5只，体重100～120g，进行BMSCs分离及培养。取81只Wistar雌性大鼠，体重220～250g，采用改良Allen’s打击装置制备SCI模型，随机分为3组：假手术组（A组，n=21），仅咬除T8～10棘突和椎板；DMEM组（B组，n=30），SCI区周围注射DMEM；BMSCs组（C组，n=30），SCI区周围注射BMSCs。于移植术后1、3、5d，采用RT-PCR方法检测各组大鼠SCI区Flk-1基因表达的变化；于移植术后3、7、14d，免疫组织化学方法观察脊髓内Flk-1蛋白的表达。结果原代培养的BMSCs细胞形态多样，随着传代次数的增加，细胞形态逐渐趋于均一，多为扁平形和长梭形。RT-PCR结果显示，在移植术后1、3、5d，C组Flk-1 mRNA表达水平与B组比较差异无统计学意义（P〉0．05）；但B、C组与A组比较，Flk-1 mRNA表达于术后1d明显增加并达峰值（P〈0．01），术后3d下降（P〈0．0.01），至术后5d表达仍高于A组（P〈0．05）。免疫组织化学结果显示，移植术后3、7d，B组Flk-1蛋白表达较A组显著增加，差异有统计学意义（P〈0．01）；术后14d，A、B组Flk．1蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05）；移植术后3d，B、C组Flk-1表达相似，差异无统计学意义（P〉0．05），移植术后7、14d，C组Flk-1表达明显高于B组（P〈0．0.01）。结论SCI后BMSCs移植对Flk-1 mRNA的表达无调节作用，但上调Flk-1蛋白的表达，是修复SCI的机制之一。     

VEGF抗体抑制磨损颗粒诱导骨溶解的实验研究

目的通过观察局部注射VEGF及VEGF抗体对小鼠植骨气囊模型中磨损颗粒诱导骨溶解的影响,探讨VEGF在人工关节无菌性松动中的作用。方法取人工髋关节翻修术取出的金属关节假体柄,参照真空球磨法体外制备磨损颗粒,PBS配制成浓度为10 mg/mL颗粒悬液。取8～10周龄雌性昆明小鼠50只,体重约25 g。10只作为气囊植骨模型颅骨供体。剩余40只小鼠随机分为4组(n=10),分别为空白对照组(A组)、颗粒组(B组)、VEGF刺激组(C组)和VEGF抑制组(D组);小鼠背部皮下注射无菌空气制备气囊,第8天切开气囊植入颅骨骨片,制备植骨气囊模型。于植骨后第1天B、C、D组气囊内注入0.5 mL颗粒悬液,A组注入0.5 mL PBS。气囊制备期间第6、7天及植骨后隔天,C、D组气囊内分别注射0.2 mL重组人VEGF和Bevacizumab溶液,A、B组注射0.2 mL生理盐水。植骨2周后取囊壁连同骨片行HE染色、实时荧光定量PCR及ELISA检测。结果各组小鼠均存活至实验完成。大体观察见A组气囊红肿程度轻,新生血管少;B、C、D组气囊明显红肿,可见较多渗出及新生血管,其中C组最重,B组次之,D组介于A、B组间。组织学及分子生物学检测发现,B组囊壁明显炎性反应及骨溶解,囊壁厚度、细胞密度及TNF-α、IL-1β、VEGF表达均较A组明显增加(P<0.05);C组囊壁炎性反应及骨溶解最显著,以上观察指标均高于B组(P<0.05);D组囊壁亦可见炎性反应及骨溶解,但以上指标均低于B组(P<0.05),高于A组(P<0.05)。结论 VEGF在人工关节无菌性松动中具有促进炎性反应及骨溶解作用,局部给予VEGF抗体可抑制磨损颗粒诱导的骨溶解。     

BMP-2联合低氧环境诱导BMSCs向软骨表型分化的研究

目的探讨BMP-2联合低氧环境诱导BMSCs向软骨表型分化的可行性,并进一步研究其生物学机制。方法取4周龄健康清洁级雌性SD大鼠骨髓采用贴壁法体外培养BMSCs,取第2代细胞根据培养条件不同分为4组:常氧对照组(A组)、常氧加BMP-2诱导液组(B组)、低氧(O2浓度3%)对照组(C组)和低氧加BMP-2诱导液组(D组)。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,培养7、14、21 d阿利新蓝染色检测各组软骨基质糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)分泌水平,21 d时Western blot检测细胞内Ⅱ型胶原和低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)蛋白表达水平,RT-PCR检测成软骨、成骨以及低氧相关基因表达水平。结果诱导培养21 d,D组细胞变为类圆形,细胞密度降低,细胞周边呈陷窝样,基质包裹细胞;A、B、C组均未见上述典型变化。D组阿利新蓝染色明显较其他组深,并随诱导时间延长蓝染加深,21 d时出现成片深染蓝色,其他组各时间点仅见散在少量的淡染蓝色。Western blot检测D组细胞内Ⅱ型胶原蛋白表达水平较其他组显著增高,C、D组HIF-1α蛋白表达水平较A、B组显著增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测D组成软骨分化相关指标Ⅱ型胶原α1(collagenⅡα1,COL2α1)、聚集蛋白聚糖表达最高,而B组成骨分化相关指标COL1α1、ALP、Runt相关转录因子2表达水平最高,C、D组低氧相关指标HIF-1α较A、B组显著增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 BMP-2联合低氧(O2浓度3%)环境可以诱导大鼠BMSCs向软骨分化,并抑制其成骨分化,HIF-1α可能是参与促软骨生成过程中的一个重要信号分子。     

氨基胍对大鼠急性脊髓损伤后脊髓水肿的作用机制研究

目的氨基胍(aminoguanidine,AG)能显著减轻脑外伤及中风动物模型脑水肿,提高神经功能恢复程度。探讨AG对大鼠急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后脊髓水肿的作用及相关机制。方法取成年雄性SD大鼠150只(体重230～255 g),分为对照组(A组,25只)、假损伤组(B组,25只)、SCI后未治疗组(C组,25只)和SCI后AG治疗组(75只);AG治疗组按给药剂量分为AG 75 mg/kg组(D组,25只)、AG 150 mg/kg组(E组,25只)和AG300 mg/kg组(F组,25只)。A组未行任何处理,B组仅行椎板切除术但不治疗;C、D、E、F组制备静压型大鼠SCI模型后,C组腹腔注射5%DMSO,D、E、F组腹腔注射相应剂量AG。于造模后0、12、24、48 h用干湿重法检测受损脊髓组织含水量以筛选最佳剂量,进一步用伊文思兰(Evans blue,EB)法评测血-脊髓屏障功能,用RT-PCR检测水通道蛋白4(aquaporins 4,AQP4)mRNA表达,Western blot和免疫组织化学染色检测AQP4蛋白表达。结果脊髓组织含水量检测示,E组在造膜后12、24、48 h对SCI后脊髓组织水肿有明显抑制作用(P<0.05),选择该剂量组用于后续实验。造模后12、24、48 h,E组EB含量明显低于C组(P<0.05),降低血-脊髓屏障通透性。RT-PCR检测结果示造模后12、24、48 h,B、E组AQP4 mRNA表达明显低于C组;Western blot检测示造模后24、48 h,B、E组AQP4蛋白表达明显低于C组;免疫组织化学染色示造模后48 h,B、E组AQP4蛋白表达明显低于C组,差异均有统计学意义(P<0.05);但各指标各时间点B、E组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论急性SCI后大鼠经150 mg/kg AG治疗后,能降低AQP4表达,改善脊髓水肿,减轻损伤。     

超短波治疗大鼠断尾再植后血管危象的实验研究

目的探讨超短波(ultrashort wave,USW)对鼠断尾再植后血管危象的影响及作用机制。方法取3月龄雌性SD大鼠80只,体重232.8～289.6 g,随机分为5组。各组保留尾侧静脉、尾骨后断离鼠尾,A组结扎尾动脉;B、C、D、E组均吻合尾动脉,建立断尾再植模型。术后B组正常管理;C组立即按3.125 mL/kg剂量腹腔注射稀释的盐酸罂粟碱注射液(1 mg/mL)。D、E组立即给予局部吻合口处USW治疗(1次/d),至术后5 d,D组剂量:3档,50 mA,20 min;E组剂量:2档,28 mA,20 min。术后观察鼠尾成活情况至10 d;手术前后测鼠尾吻合口近远侧皮温差并计算术后与术前的变化值;术前从内眦及术后8 h从尾尖各采血1次检测血浆一氧化氮(nitric oxide,NO)浓度并进行比较。结果术后7 d A、B、C、D、E组鼠尾成活率分别为0(0/14)、36.4%(8/22)、57.1%(8/14)、22.2%(4/18)、75.0%(9/12),组间比较差异有统计学意义(χ2=19.935,P=0.001);E组成活率显著高于B组(P<0.05),其余各组两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。术前各组间鼠尾皮温差比较差异均无统计学意义(P>0.05)。术后8 h、5 d、6 d及7 d各组间比较鼠尾皮温差变化值差异均有统计学意义(P<0.05),其中术后8 h B组皮温差变化值大于D组(P<0.05);术后5 d C组大于D组(P<0.05);术后6 d A、B、C组均大于D组(P<0.05);术后7 d A、E组低于B、C组(P<0.05),D组低于B组(P<0.05);其余各组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。术前各组血浆NO含量差异无统计学意义(P>0.05)。术后8 h A、B、C组血浆NO含量显著低于D组(P<0.05),手术前后变化值A、B组显著低于D组(P<0.05);其余各组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论实验中大鼠断尾再植模型可行。USW治疗能提高鼠断尾再植成活率,在术后7 d内能减小皮温差,提高术后早期NO浓度,防治血管危象。     

Change of vanilloid receptor 1 following neuromodulation in rats with spinal cord injury

BACKGROUND: Neuromodulation has been used to treat voiding dysfunction caused by spinal cord injury (SCI). However, the underlying mechanism of this technique is not well understood. Recently, vanilloid receptor 1 (VR1) has been recognized as a capsaicin receptor and an agent for noxious stimuli. The purposes of this study were to evaluate whether development of bladder hyperreflexia after SCI involves VR1 upregulation and whether VR1 is involved in the process of neuromodulation. MATERIALS AND METHODS: Sprague-Dawley rats (n = 20) were divided into five groups: sham control (n = 4); 3 days after SCI (n = 4); 7 days after SCI (n = 4); 14 days after SCI (n = 4), and 14 days after SCI with neurostimulation (n = 4). Bilateral electrode wires were implanted into S1 dorsal foramina and electrical stimulation was performed 8 h/day for 2 weeks. Spinal segments of L6, S1, and dorsal root ganglia were removed and cut into sections. The intensity of VR1 staining was evaluated by image analysis. RESULTS: VR1-positive staining was confined to the superficial dorsal horn of the spinal cord. The staining was weak in the sham group (1/luminosity: 0.0050 +/- 0.0006), but the staining intensity was significantly increased in three SCI groups (3 days, 7 days, and 14 days) when compared with that in the sham group (P < 0.05). After neuromodulation, the staining intensity was reduced. CONCLUSIONS: VR1 expression in the spinal cord is up-regulated after SCI. Sacral nerve root stimulation can down-regulate the VR1 expression.     

带血运的组织移植对损伤脊髓细胞凋亡的影响

目的：探讨带蒂的大网膜和椎旁肌移植覆盖脊髓对脊髓损伤后细胞凋亡的影响。方法：应用改良的Ａｌｌｅｎ‘ｓ法致伤脊髓,将动物分为单纯脊髓损伤组（Ａ组）,损伤＋椎旁肌组（Ｂ组）,损伤＋大网膜组（Ｃ组）。移植后１、３、７、１４、２８天对脊髓损伤区进行细胞凋亡的检测（ＴＵＮＥＬ）以及Ｂｃｌ－２蛋白表达的测定（免疫组化法）。结果：Ａ、Ｂ、Ｃ组中均发现凋亡细胞及ＢＣＬ－２蛋白阳性表达,图象分析发现,细胞凋亡率为Ａ     

转化生长因子-β1对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

 目的 探讨转化生长因子(Transforming growth factor-β1,TGF-ββ1)对大鼠脊髓损伤后神 经细胞凋亡及神经动能恢复的影响。方法 采用改良 Allen爷s撞击法制作脊髓损伤大鼠模型, 根据干预 方式不同随机分为对照组、模型组、TGF-β1治疗组(渗透微泵持续蛛网膜下腔泵入 1μg/h TGF-β1)、 TGF-β1抗体组(渗透微泵持续蛛网膜下腔泵入 1μg/h TGF-β1中和抗体), 按设定的不同时间点随机处死各组的实验动物, 取材。应用 TUNEL法、RT-PCR、Western blot和免疫组织化学染色分别检测不同组 别在神经细胞凋亡, 脊髓组织细胞中 TGF-β1和 Fas的 mRNA及蛋白质表达差异。通过 BBB运动功能 评分法评估大鼠后肢运动功能恢复情况。结果 脊髓损伤后 TGF-β1和 Fas表达时间依赖性增加, Fas 表达 24h达高峰, TGF-β1表达 7d达高峰。脊髓损伤后神经细胞凋亡增加, 其中 8h神经元凋亡明显, 7 d神经胶质细胞凋亡明显。局部应用 TGF-β1, 可显著下调损伤脊髓组织 Fas表达, 减少 8h和 7d时神 经元凋亡及神经胶质细胞凋亡数量, BBB运动功能评分结果显示, TGF-β1治疗组大鼠后肢运动功能明显改善(P约0.01)。结论 脊髓损伤部位应用 TGF-β1可抑制 Fas mRNA及蛋白质的表达, 减少脊髓损伤 部位神经细胞的凋亡, 有利于促进脊髓神经功能的恢复。