双光子蛋白质荧光探针及其在药物研究中的应用

蛋白质在生命现象和生命过程中起重要作用,在众多的蛋白质分析法中,荧光探针日益广泛地应用于药物筛选等领域.由于双光子荧光技术具有高分辨率、良好的组织穿透能力、极小的组织伤害性和极低的光漂白等特点,可以实现活体蛋白质功能的可视化研究,可为新药筛选提供服务.本文就对蛋白质荧光探针的研究现状进行综述,并展望双光子蛋白质荧光探针在药物研究中的应用前景.     

一种用于筛选启动子元件库的酵母检测载体的构建及初步应用

天然药物合成生物学技术是一种采用多基因控制的方式,实现天然产物代谢途径在异源底盘细胞中的重构。启动子是调控基因表达的一种顺式元件,对多基因控制的代谢途径的平衡起着重要的作用。为了筛选获得性能优越的启动子用于多基因控制的代谢途径,一个基于红色荧光蛋白的酵母检测质粒被构建。首先,根据已经发表的红色荧光蛋白基因,设计并合成了一系列引物,通过连续重叠PCR的方法合成了全长红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer,并将该红色荧光蛋白基因导入酿酒酵母,SDS-PAGE、Western blot以及荧光显微镜观察都表明该红色荧光蛋白基因在酿酒酵母中获得了表达。然后,将具备功能的DsRed-Monomer基因与酿酒酵母表达载体pGBT9进行重组,获得能进行启动子文库筛选的启动子检测质粒pGBT9Red。为了检测该质粒的效能,通过PCR从酿酒酵母基因组中克隆得到了6种启动子(包括4种诱导型启动子和2种组成型启动子),并将6种启动子分别克隆到pGBT9Red中,置于红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer上游,通过荧光成像确定启动子对红色荧光蛋白基因表达的调控效率。结果表明,6种启动子(GAL1、GAL2、GAL7、GAL10、TEF2和PGK1)在酿酒酵母中均能调控DsRed-Monomer的表达。该检测质粒的成功构建为进一步进行启动子活性分析和启动子元件文库筛选奠定基础。     

G-蛋白偶联受体的功能测定和高通量药物筛选

G 蛋白偶联受体家族是药物开发中最大的一类药物靶点 ,高通量药物筛选是开发药物早期阶段的最重要工具之一。根据G 蛋白偶联受体与配体结合及激发的信号通路 ,人们设计了各种可行的功能测试方法 ,用于G 蛋白偶联受体为药靶的高通量药物筛选 ,如 :微体积荧光数字图像测定技术 (Fluorometicmicrovolumeassaytechnology ,FMAT)、荧光偏振 (Fluoresencepolarization ,FP)、竞争性ELISA (Com petitiveenzyme linkedimmunosorbent)、闪烁邻近测定法(Scintillation proximityassay ,SPA)、载黑色素细胞测定法(Melanophoreassay)、报告基因测定法 (Reportergeneassay)和钙离子测定法等测定方法。在这些方法中 ,报告基因测定法和钙离子测定法占了主导地位。非放射性、无需底物和辅助剂的报告基因测定方法和荧光钙离子指示剂的钙离子测定方法可能是将来G 蛋白偶联受体的功能分析和高通量药物筛选的发展方向     

小分子药物筛选技术研究现状及其应用进展

小分子药物筛选技术伴随着药物的发现正在不断更新和拓展,药物筛选技术的创新可以提高研发效率和成功率、缩短研发周期、降低成本。从基于已知活性化合物和高通量筛选等传统筛选技术,到基于结构的药物发现、基于片段的药物发现、DNA编码化合物库、蛋白降解靶向联合体等新技术,小分子药物筛选技术在不断拓宽小分子药物的市场潜力。该文将介绍目前小分子药物筛选技术整体现状,系统综述各技术及其优劣势,为小分子药物筛选新技术的发展提供重要参考。     

现代荧光光谱法在药物与蛋白相互作用研究中的应用

药物与蛋白相互作用是生命科学研究的重要领域,而荧光法是研究药物与蛋白相瓦作用的重要方法.文中综述了药物与蛋白相瓦作用的荧光猝灭法、荧光敏化法、同步荧光光谱、荧光偏振法、三维荧光光谱和时间分辨荧光法等.     

啤酒酵母等表达的G蛋白偶联受体在药物高通量筛选中的应用

G蛋白偶联受体具有重要的生理功能和病理意义,已成为一类重要的药物靶点。针对靶标G蛋白偶联受体从大量化合物中筛选出理想的药物,就需要开发特异且灵敏的高通量筛选体系。真核酵母细胞具有易操作、培养条件简单稳定、基因组学研究透彻、外源蛋白表达工具丰富多样、检测分析方法成熟等优点,使它成为一种理想的药物筛选工具。文章对酵母表达G蛋白偶联受体用于构建药物高通量筛选模型的研究现状和发展前景做综述。     

天然抗肿瘤成分筛选的研究进展

天然产物是发现抗肿瘤药物的重要途径,建立天然抗肿瘤活性成分快速有效的筛选方法对研究抗肿瘤药物具有重要意义。本文从DNA拓扑异构酶、端粒酶、微管蛋白、肿瘤新生血管生成抑制和DNA G-四链体等方面综述了近年来天然抗肿瘤活性成分的筛选方法,为抗肿瘤药物的研究与开发提供参考。     

应用药物转运体的药代动力学评价

药物转运体在药代动力学方面起到非常重要的作用,它与药物的吸收、分布、排泄、药效发挥、以及药物毒性作用等密切相关。基于转运体的药物间相互作用,还能影响到临床合并治疗药物之间的药代动力学关系。本研究室已经建立了一整套的实用于药代动力学研究和药物间相互作用评价,高效表达人药物转运体蛋白的体外筛选系统,并已将其应用于新药的筛选研究。此方法的特点在于,以表达人药物转运体蛋白的宿主培养细胞为研究对象,在临床前期提供与临床试验相似的研究结果,今后必将成为药物研发领域有用的评价方法。     

天然抗肿瘤成分筛选的研究进展

天然产物是发现抗肿瘤药物的重要途径,建立天然抗肿瘤活性成分快速有效的筛选方法对研究抗肿瘤药物具有重要意义.本文从DNA拓扑异构酶、端粒酶、微管蛋白、肿瘤新生血管生成抑制和DNA G-四链体等方面综述了近年来天然抗肿瘤活性成分的筛选方法,为抗肿瘤药物的研究与开发提供参考.     

药物重定位候选药物筛选路径

相对传统新药研发模式,药物重定位策略发现药物新用途具有显著的成本效益优势,能加快药物上市步伐,满足恶性肿瘤、罕见病、个性化医疗等特定领域药物临床用药需求,因而被各界关注。本文主要介绍了药物重定位的一般流程与候选药物筛选路径,如从非理性设计方法向基于相似性、基于结构虚拟筛选、推理与机器学习等理性设计方法发现重定位药物的系统性转变。     

绿色荧光蛋白在药学研究中的应用进展

来自水母的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）具有很多理想的特性，被喻为活分子探针。GFP适用于作普遍的报告标记，尤其适用于活体细胞或组织，已被广泛应用于动物学、植物学、微生物学等领域的研究。本文对GFP在药学研究中的应用做一综述。     

维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型的建立维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型的建立

目的建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的以维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型，用于筛选治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)、银屑病、痤疮以及肿瘤的新型药物。方法用分子生物学的方法，构建含有8个串连维甲酸受体应答元件(RARE)并连接报告基因E-GFP的重组载体。将体外培养的细胞株用该重组载体进行稳定转染，然后进行单克隆培养，最终挑选出敏感、高效、稳定表达的单克隆细胞，用于筛选针对维甲酸受体的小分子有机药物。结果建立了高效的药物筛选细胞模型。此模型筛选方法简便，适用范围广，灵敏度高，结果稳定。结论挑选出的细胞株作为药物筛选模型可用于大规模高通量药物筛选。     

The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET

Bioluminescence resonance energy transfer has developed in recent years as a new technique to study protein-protein interactions. Protein partners of interest are tagged with either luciferase or green fluorescent protein (GFP). Non-radiative energy transfer between the excited luciferase and the GFP permits the study of spatial relationships between the two partners. This technique constitutes an important tool for the study of the functional activity of different types of receptors, and can be used in sensitive, homogenous high-throughput screening assays.     

糖尿病致病基因醛糖还原酶基因及其抑制剂筛选模型的构建及功能研究

目的基因工程方法建立人醛糖还原酶基因(AR)的蛋白分子模型,并将该模型应用于中草药AR抑制剂的初步筛选。方法将含基因AR及融合基因AR∷GFP的重组质粒pcDNA3.1/myc-His-AR及pcDNA3.1/myc-His-AG瞬时转染HEK293细胞,分别命名为HAR、HAG细胞株。通过荧光显微镜观察AR∷GFP的绿色荧光直接判断转染效果及估计基因AR的表达;Western blot、紫外分光光度法检测AR蛋白表达及AR酶活性。应用此HAR模型对黄芩苷等5种中草药进行初步筛选,并与经典AR抑制剂Sorbinil、Zopolrestat的抑制效果比较。结果GFP绿色荧光表达丰富,表明质粒转染效率较高;Western blot和紫外分光光度法显示:转染后HEK293细胞中AR蛋白表达量高,AR酶活性强(空白对照的2.5倍)。AR抑制剂筛选实验揭示,黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等中草药表现出与Sorbinil相近的AR抑制活性。结论AR的蛋白分子模型成功建立,此模型可得到较大量高活性AR酶蛋白,并可应用于AR抑制剂的初步稳定筛选;黄芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等中草药显示出潜在的AR抑制活性。     

Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery

In the last five years, green fluorescent protein (GFP) has emerged from being a mere curiosity to become a reliable tool for molecular pharmacological research. GFP produces an intense and stable green fluorescence noncatalytically by absorbing blue light maximally at 395 nm and emitting green light with a peak at 509 nm. It consists of 238 amino acids and its molecular mass is 27-30 kDa. GFP fluorescence occurs without cofactors and this property allows GFP fluorescence to be utilised in nonnative organisms, wherein it can be used as a reporter. This use of GFP permits real-time analysis of receptor dynamics. The emitted fluorescence can be used as a nontoxic marker and detected using fluorescence-activated cell sorting (FACS), thus avoiding any staining procedure, expensive mRNA analysis or hazardous radiolabeled binding assays. The potential value of GFP has also been recognized in orphan receptor research, where various GFP-tagged therapeutic proteins have been constructed in an attempt to identify the endogenous ligand(s). These chimeric proteins have been used to determine the site and time course of receptor expression and to relate receptor dynamics with therapeutic outcome. The preparation of new GFP constructs for identifying germ layer cells (endodermal, ectodermal, and mesodermal), as well as neuronal, haematopoietic, endothelial, and cartilage cells, has provided a useful battery of tissue/receptor-specific screening assays for new chemical entities. Genetically engineered cells with GFP expression have provided a valuable tool for automated analysis, and can be adapted for high-throughput systems. GFP is being increasingly utilised for the study of receptor dynamics, where, having already proved beneficial, it will likely continue to contribute towards the search for new classes of drugs, as well as to "de-orphaning" orphan receptors.     

Exendin-4与绿色荧光蛋白融合基因的表达与活性研究

目的:表达具有双功能特性的Exendin-4-GFP融合蛋白。方法:构建融合表达载体pET21a( )/Exendin-4-GFP,转化大肠杆菌BL21后,以IPTG诱导融合蛋白的表达,并利用镍金属螯合层析树脂对其进行纯化。采用胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)转染的CHO细胞考察融合蛋白的结合特性,并检测其生物活性。结果:含有融合表达载体的重组菌株诱导表达后,经SDS-PAGE及免疫印迹分析显示,31.0ku的融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,且具有Exendin-4的抗原活性。受体结合实验表明,该融合蛋白能够与GLP-1R特异性结合,在488nm激发光下呈现绿色荧光。体内活性实验表明,融合蛋白具有明显的降血糖活性。结论:本研究表达的Exendin-4-GFP融合蛋白同时具有Exendin-4的活性和荧光特性,为研究GLP-1受体功能以及Exendin-4与细胞相互作用的机制奠定了基础。     

siRNA沉默肝癌细胞报告基因瞬时表达效应的定量分析

目的研究小分子干扰RNA(siRNA)特异性抑制肝癌细胞基因瞬时表达的可行性和基因沉默效率。方法凝胶电泳成像观察siRNA体外孵育后的降解性,利用Cy3示踪观察其转染HepG2细胞后动力学变化。将报告基因(GFP)和siRNA共同瞬时转染至HepG2细胞,流式细胞仪、Western blot RT-PCR等分析特异性siRNA抑制报告基因瞬时表达的效应。结果siRNA在空白培养液中和转染细胞内可较长时间保持相对稳定。与空白和非特异siRNA相比,GFPsiR-NA明显抑制GFP蛋白产物和mRNA的表达(P<0·05)。结论特异性siRNA能高效沉默人肝癌细胞转染基因的瞬时表达,为基因治疗提供了一种新的治疗策略。     

荧光标记在药物研究中的应用

荧光标记这种非放射性标记技术已成为现代分析检测中不可或缺的重要方法之一，然而将此技术应用于药物研究并不广泛。荧光染料应用范围较为广泛，具有高灵敏度、高稳定性和高选择性等特点，目前新型荧光标记材料量子点的出现，克服了传统荧光染料的一些缺点，更有利于荧光标记技术在药物的药理活性、作用机制和动力学研究等领域的推广应用。