中华按蚊防御素基因的克隆、原核表达及其重组产物生物活性的初步评价

目的 克隆、原核表达中华按蚊的防御素基因,并对其表达产物的生物学活性进行评价。方法 根据已发表的埃及伊蚊和冈比亚按蚊防御素基因序列设计合成两对引物,以中华按蚊成蚊cDNA为模板进行PCR扩增,将预期片段克隆测序并进行分析;根据表达质粒pET32a(+)上的克隆位点及测序结果设计PCR引物,将截短的基因片段重组入质粒pET32a(+)中进行表达,纯化表达产物并进行体外抑菌试验。结果 PCR扩增产物大小约270bp,目的基因的序列与冈比亚按蚊防御素基因同源性为85%;截取其保守功能区域序列(162bp),构建成功重组表达质粒pET32a(+)-tDEF,含重组质粒的转化菌用IPTG诱导表达后,于M_r26000处可见一预期的特异表达带,该蛋白与抗6-His抗体有特异性的反应;琼脂扩散法显示,纯化的重组防御素融合蛋白未出现抑菌环。结论 首次克隆了中华按蚊防御素基因,其截短片段在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达,但重组融合蛋白不具备抑菌活性。     

日本血吸虫新基因-Ⅲ8kDa钙结合蛋白基因的发现与克隆

目的 将用EST策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因－Ⅲ8kDa钙结合蛋白（Calcium-binding protein,CBP)cDNA克隆到表达质粒pET32a( )上，为下一步对该基因的功能进行研究做准备。方法 将插入于pTripIEx2质粒上的cDNA进行测序，测序结果经BLASTn程序搜索，发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫钙结合蛋白cDNA高度同源。根据表达质粒pET32a( )上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物，将PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上，将重组T载体经EcoRI/XhoI双酶切后切下的SjCBP基因亚克隆入原核可溶性表达质粒pET32a( )中。结果 所发现的新基因与曼氏血吸虫8kDa CBP基因的同源性达82％，PCR产物的片段长度与预期大小一致，重组T载体及表达质粒经EcoRI及XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论 所发现的cDNA与曼氏血吸虫8kDa CBP cDNA高度同源，并且已成功地构建出重组表达质粒pET32a( )－SjCBP。     

日本血吸虫新基因—腺苷酸激酶基因的发现与克隆

目的：将用表达序列标签（expression sequence tag,EST)策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因－腺苷酸激酶（adenylate kinase,AK)cDNA克隆到表达质粒，pET32a( )上，为下一步研究该基因的功能做准备，方法：将插入于pTriplEx2质粒上的cDNA进行,测序，用BLASTn程序搜索测序结果，根据表达质粒pET32a( )上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物，将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上，将重组T载体经EcoR I/Xho I双酶切后切下的SjAK基因导入原核一表达质粒pET32a( )中，结果：本研究所发现的新基因与曼氏血吸虫AK基因的同一性达86％，PCR产物的片段长度与预期大小一致，重组T载体及表达质粒经EcoR I及Xho I双酶切后有具有与目标片段工度相符的插入片段，结论：发现日本血吸虫的cDNA与曼氏血吸虫AKcDNA高度同源，并且成功地构建出重组表达质粒pET32a( )-SjAK。     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3的原核表达及其免疫反应性

目的 克隆表达弓形虫RH株MIC3基因,并对重组蛋白进行免疫反应性分析.方法 应用PCR技术扩增弓形虫RH株MIC3基因,将目的基因片段分别克隆至pET28a(+)和pET32a(+)两种表达载体中构建重组质粒,重组质粒转化至大肠杆菌体BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定.结果 成功从弓形虫RH株基因组DNA中克隆出大小约1080bp MIC3基因片段;重组质粒pET28a-MIC3和pET32a-MIC3经过酶切和PCR鉴定,及测序分析,表明重组质粒构建正确.两种重组质粒分别诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,诱导表达产物分别在50 KD及70KD左右出现目的条带,Westem-blot分析显示重组蛋白对弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性.结论 原核表达了弓形虫MIC3重组蛋白,所表达的重组蛋白具有免疫反应性,为下一步利用重组蛋白进行弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定基础.     

日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位的发现与克隆

目的将用EST策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位（proteasome activatorPA28 subunit,PA28）cDNA克隆到表达质粒pET32a（+）上,为下一步对该基因进行功能研究做准备。方法将插入于pTrip1Ex2质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTx程序搜索,发现该插入cDNA序列所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源。根据表达质粒pET32a（+）上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物,将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上,将重组T载体经EcoRI/XhoI双酶切后切下的SjPA28基因导入原核可溶性表达质粒pET32a（+）中。结果所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白的同一性达41％,PCR产物的片段长度与预期大小一致,重组T载体及表达质粒经EcoRI/XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论本研究所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源,并且已成功地构建出重组表达质粒pET32a（+）-SjPA28。     

日本血吸虫新基因——腺苷酸激酶基因的发现与克隆

目的将用表达序列标签(expression sequence tag, EST)策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因——腺苷酸激酶(adenylate kinase,AK)cDNA克隆到表达质粒pET32a(+)上,为下一步研究该基因的功能做准备。方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,用BLASTn程序搜索测序结果,根据表达质粒pET32a(+)上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物,将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上,将重组T载体经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后切下的SjAK基因导入原核可溶性表达质粒pET32a(+)中。结果本研究所发现的新基因与曼氏血吸虫AK基因的同一性达86%,PCR产物的片段长度与预期大小一致,重组T载体及表达质粒经EcoR I及XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论发现日本血吸虫的cDNA与曼氏血吸虫AK cDNA高度同源,并且成功地构建出重组表达质粒pET32a(+)-SjAK。     

乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）截短C基因和前S1基因重组原核表达质粒,获得融合蛋白的表达并进行抗原性分析．方法：PCR扩增获得截短C基因片段和前S1基因,双酶切后克隆至原核表达质粒pET28a,转化E．coli DH5α,酶切鉴定得阳性重组质粒pET28a并测序;然后转化E．coli B121,IPTG诱导融合蛋白表达,薄层扫描分析表达蛋白组成;可溶性分析后用Ni^2＋ -NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白,Westem Blot分析特异性和抗原性．结果：成功构建了HBV截短C基因和前S1基因融合的原核表达质粒pET28a—Ct—preS1,目的基因可高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,Ni^2＋ -NTA纯化可获得目的蛋白,纯化蛋白具有良好的抗原性和特异性．结论：HBV截短HBcAg和preS1抗原融合蛋白可高效表达并得到纯化,为研究新型乙肝疫苗奠定了基础．     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain—like基因的克隆及表达

目的克隆弓形虫RH株Calpain-like基因片段,构建原核表达载体,诱导表达Calpain-like基因重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA,在设计合成的引物中引入SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫RH株Calpain-like基因片段,插入pGEM-T载体,提取重组质粒,双酶切获得目的基因,亚克隆到原核表达质粒pET32a,重组子经双酶切、PCR和DNA序列分析鉴定,转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株速殖子cDNA中扩增出316bp的Calpain-like基因片段;含pET32a/Calpain-like的重组质粒在宿主菌经诱导后,获得与预期分子量相符的表达产物。结论成功地克隆和表达弓形虫RH株Calpain-like基因,弓形虫Calpain-like基因的克隆表达为进一步筛选弓形虫疫苗候选分子和治疗药物的靶位提供了研究基础。     

mFSHR基因N端片段的序列分析、原核表达载体构建及其表达

目的：克隆小鼠卵泡刺激素受体（FSHR）基因N-端部分片段（28—90aa）（mFSHRn）;预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性;构建原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中表达。方法：提取小鼠睾丸组织总RNA,利用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）技术反转录成cDNA,按照GeneBank中小鼠FSHRN．端序列设计引物,扩增基因片段并插入pET32a载体,测序鉴定后做生物信息学分析;质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态菌株诱导表达蛋白。结果：扩增片段长度为186bp,测序结果与预期结果完全一致,生物信息学分析其编码蛋白具有良好的抗原性;重组原核表达质粒经鉴定获得正确重组子并诱导表达。结论：mFSHRn蛋白可作为良好的候选避孕疫苗,成功构建了pET32a—mFHSRn原核表达重组质粒,获得可表达mFHSRn的大肠杆菌菌株,为后续的相关研究奠定了基础。     

人类8型疱疹病毒K8.1基因原核表达重组质粒的构建

目的：构建人类8型疱疹病毒（HHV-8）K8.1基因原核表达重组质粒,获得HHV-8外壳蛋白重组融合蛋白,为制备检测抗原建立平台。方法：根据基因库K8.1全长基因序列和pET41a载体的多克隆位点设计引物,分别在引物两端添加特异酶切位点,以pGEM-Teasy/K8.1质粒为模板,PCR扩增K8.1基因全长序列,克隆入原核表达载体pET-41a,构建原核表达质粒pET41a-K8.1;转化大肠杆菌DH5α,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性。结果：酶切鉴定表明在约500bp处可见酶切片段,测序结果表明构建的pET41a-K8.1原核表达质粒连接正确,插入的K8.1基因片断为494bp。结论：成功构建了pET41a-K8.1原核表达质粒,为获得重组融合HHV-8外壳蛋白建立了平台。     

重组Trx-ApoO融合蛋白的构建与表达

目的:构建人载脂蛋白O (apolipoprotein O, ApoO)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原Trx-ApoO融合蛋白.方法:以人类肝脏cDNA文库为模板,聚合酶链反应(PCR) 法扩增ApoO DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-32a (+)相应位点构建重组质粒并转化E.coli B...     

hPSF蛋白的原核表达质粒的构建及分析鉴定

目的:构建hPSF蛋白原核表达质粒,在体外观察其与GAGE6调控区结合现象。方法:从人成纤维细胞中提取总RNA,利用hPSF特异性引物通过RT-PCR方法扩增hPSF cDNA编码序列,克隆入pET-28a载体中,构建重组载体pET-28-hPSF。将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达,通过SDS-PAGE和免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果:酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;SDS-PAGE分析在相对分子质量约100kD处出现了1条蛋白条带,免疫印迹结果显示,所构建的重组载体可在大肠杆菌中高效表达hPSF蛋白。结论:成功构建了hPSF原核表达载体,并能够在大肠埃希菌中有效表达hPSF,为进一步研究hPSF的生物学作用奠定了基础。     

嗜肺军团菌pip基因原核质粒的构建及其表达

目的扩增嗜肺军团菌基因pip,构建重组质粒pET-pip并在原核系统中表达。方法采用PCR,从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增出pip基因,将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-pip,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序分析后,转化BL21,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE进行鉴定。使用His-tag纯化重组蛋白PIP。结果扩增出了嗜肺军团菌726bp的pip基因,构建的原核表达重组质粒pET-pip表达并纯化出了约46kD Trx-PIP的融合蛋白。结论成功构建了嗜肺军团菌pip基因的原核重组质粒,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及原核表达

目的从分离培养的金黄色葡萄球菌中提取肠毒素A(SEA)基因,亚克隆入表达载体pET-28a(+),诱导融合蛋白的表达,为肠毒素A应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEA的序列,设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增SEA,纯化DNA进行BamHⅠ、XholⅠ双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21,并对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌DNA为模板,成功扩增了SEA基因,基因大小为774bp,重组PET-28a(+)-SEA双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEA在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.9%。经IPTG诱导后,SDS-PAGE可见pET-28a(+)-SEA/BL21在相应分子量(约30000Mr)条带大量表达,免疫印迹能检测到目的蛋白条带,说明其与His标签融合表达。结论克隆了金黄色葡萄球菌SEA基因,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为肠毒素A应用研究奠定了基础。     

Bcr-Abl酪氨酸蛋白激酶域及其突变体的构建和表达

目的:制备Bcr-Abl激酶域及其突变体-His的重组蛋白. 方法:用PCR方法从含有Bcr-Abl全长的质粒pGD210中扩增出Bcr-Abl激酶域片段,再通过重组PCR技术获得激酶域的几个主要突变体(T315I,Y253F,E255K,E255V),测序正确后将其克隆到原核表达载体pET-32a中,构建表达激酶域片段和His标签融合表达的载体,IPTG诱导表达,得到的融合蛋白用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖进行亲和层析纯化. 结果:成功得到了Bcr-Abl激酶域及其突变体序列,经序列分析证实后将重组质粒转入BL-21进行表达. 结论: 通过重组PCR技术获得了野生型激酶域及其突变体蛋白. 融合蛋白表达在包涵体,占菌体总蛋白的70%以上. 经Ni-NTA镍珠纯化后,纯度在95%以上.     

人巨噬细胞金属弹力酶催化域基因的克隆及表达

目的克隆人巨噬细胞金属弹力酶催化域（HMEcd）基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌中表达HMEcd基因融合蛋白。方法用RT-PCR方法提取人胃癌组织总RNA并扩增出HMEcd cDNA,克隆入pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-HM Ecd,双酶切鉴定及DNA测序正确后再将HMEcd cDNA亚克隆至pET-28a（＋）载体,构建原核表达载体pET-28a（＋）-HM Ecd,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果RT-PCR获得预期的HMEcd cDNA,双酶切鉴定及DNA测序证实将HM Ecd基因分别正确插入克隆载体和原核表达载体中,SDS-PAGE及Western blotting鉴定证实表达出HMEcd融合蛋白。结论成功表达出HMEcd基因融合蛋白,为进一步功能实验研究奠定基础。     

pGEX-5X-1-hLMO4原核质粒构建及重组蛋白表达

目的:构建hLMO4的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:hLMO4全长编码基因经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在BL21大肠杆菌中诱导GST-hLMO4融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western blot鉴定结果。结果:hLMO4编码序列克隆至pGEX-5X-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为49 000 Da,成功纯化出GST及GST-hLMO4蛋白,Western blot检测到蛋白表达。结论:构建了hLMO4基因原核表达载体,鉴定了GST-hLMO4融合蛋白表达。     

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的: 构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。 方法: 以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。 结果: 经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。 结论: 成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术，扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段，双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a，构建重组表达质粒pET-32a／HCVc。转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况，Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果 经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达；SDS—PAGE电泳显示其在32000处有一条融和表达条带；Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论 HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，而且表达产物有良好的抗原性。