冠心病血瘀证遗传相关的差异基因筛选及其功能路径分析

目的 探讨冠心病(coronary heart disease,CHD)血瘀证遗传相关的差异基因功能及目标通路。方法 以家系CHD血瘀证者(A组)及家系CHD非血瘀证者(B组)、家系非CHD血瘀证者(C组)、家系健康人(D组)、非家系CHD血瘀证者(E组)、非家系健康人(F组)为研究对象,应用基因芯片技术比较A组与B、C、D、E组,以及D组与F组的差异基因表达谱;通过基因本体论(gene ontology,GO)分析阐释差异基因的分子功能;通过BioCarta及KEGG网站寻找差异基因所在通路,应用超几何分布统计学方法分析筛选出有意义的目标通路,并用实时荧光定量RT PCR对差异基因进行验证。结果 (1)通过对基因芯片数据的筛选(差异倍数≥3),发现家系CHD血瘀证差异基因表达主要涉及趋化因子、白介素细胞因子、补体系统、基质金属蛋白酶系、成纤维细胞生长因子、内皮细胞黏附因子等。(2)通过相关差异基因(P<0.05)GO分析,找到与CHD血瘀证相关的差异基因的分子功能。(3)经过BioCarta及KEGG通路分析,发现家系CHD血瘀证与遗传相关的差异基因中差异有统计学意义(P<0.05)的目标通路主要涉及到炎症、斑块形成、内皮损伤等方面。经实时荧光定量RT-PCR反应验证了基因芯片准确可靠。结论 CHD血瘀证遗传相关的差异基因与炎症、斑块形成及血管内皮损伤密切相关。     

冠心病血瘀证基因表达谱的遗传异质性研究

目的探讨遗传因素在冠心病血瘀证基因表达谱的影响。方法通过Affymetrix human U133 Plus 2.0芯片检测冠心病血瘀证的基因表达谱,以FC筛选家系冠心病血瘀证和非家系冠心病血瘀证患者的差异基因表达谱,比较二者的差别,并进行GO和pathway的分析。结果若以FC2或FC0.5筛选,家系冠心病血瘀证的差异基因探针占95.88%(1815/1893),非家系冠心病血瘀证为96.31%(2035/2113);以FC3或FC1/3筛选,家系冠心病血瘀证为94.89%(650/685),非家系冠心病血瘀证为95.38%(723/758)。两组人群的异质性表达基因探针中有173个差异探针是相同的,只是表达的方向存在差异,即up或down的相反性。这些差异表达基因在GO和pathway中的分布近似,更说明了二者的差异所在。结论家系冠心病血瘀证的基因表达谱与非家系冠心病血瘀证的基因表达谱存在着明显差异。     

血瘀证与NF-κB信号通路相关基因表达相关性的PCR芯片技术分析

目的 :探讨血瘀证与NF-κB信号通路相关基因表达的相关性。方法用高血压病血瘀证患者和非高血压病血瘀证患者血清作用于体外培养的人脐静脉血管内皮细胞,应用NF-κB信号通路PCR芯片技术,观察内皮细胞NF-κB信号通路相关基因表达的变化。结果在84个NF-κB信号通路相关基因中,高血压病血瘀证组与健康对照组比较,共检测到73个差异基因,其中,54个基因表达上调,19个基因表达下调。有6个上调基因和1个下调基因显示统计学差异(P0.05),上调基因包括EGR1、FOS、IKBKG、TLR9、TNFRSF10A、TRADD,下调基因为BCL2A1。非高血压病血瘀证组与健康对照组比较,共检测到71个差异基因,其中,49个基因表达上调,22个基因表达下调。有5个上调基因显示统计学差异(P0.05),包括IKBKG、NFKBIA、REL、TLR9、TRADD。可以推测:血瘀证的差异基因为IKBKG、TLR9、TRADD,均为上调基因。结论血瘀证与NF-B信号通路密切相关,其形成机制与炎症、免疫、凋亡等病理生理过程有关。     

家系虚寒证与非家系虚寒证基因表达谱比较研究

目的:探讨家系虚寒证与非家系虚寒证在宏观证候及微观基因表达的异同。方法:利用Array Tools和FatiGO等生物信息学软件挖掘基因表达谱数据,获得差异基因、差异功能类及差异分子通路。结果:家系虚寒证和非家系虚寒证在宏观证候和临床表现上没有显著差别,但基因表达水平上显著不同,家系虚寒证和非家系虚寒证差异表达的基因分别有136条和138条,其中只有2条相同,分别为NM003370、NM005252;家系虚寒证组差异功能分布相对集中,主要和能量代谢密切相关,而非家系虚寒证组差异功能分布比较广泛;家系虚寒证的差异通路有3条,而非家系虚寒证组差异通路有8条,二者没有相同的差异通路。结论:家系虚寒证和非家系虚寒证差异表达的基因种类、在染色体上的分布、影响的功能及通路都不相同。对家系虚寒证的基因表达谱分析只能适用于该家系病因分析,对非家系虚寒证的发生机制还需相关的实验研究。但可借鉴研究家系虚寒证基因表达谱的方法。     

高通量测序筛选冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络

目的:筛选冠心病血瘀证相关差异表达非编码RNA(lncRNA),微小RNA(microRNA,miRNA),信使RNA(mRNA),构建基因间调控网络,从转录组层面研究冠心病血瘀证物质基础和病理机制。方法:使用高通量测序技术,分别检测冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证和正常(各5例)lncRNA,miRNA和mRNA表达情况,通过交联分析筛选冠心病血瘀证相关的差异基因表达谱。对获得的差异基因进行功能通路分析,根据基因间Pearson相关分析和star Base靶基因预测平台,构建基因间调控网络,通过网络拓扑分析,筛选其中的关键基因。在另一匹配队列中(每组各15例)对基因调控网络中的关键节点进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR)验证。结果:39个lncRNA,229个miRNA和221个mRNA与冠心病血瘀证密切相关。功能与通路分析结果显示,冠心病血瘀证差异表达基因主要与免疫和炎症相关。共有9个lncRNA(均为下调),31个mRNA(11个上调,20个下调)和24个miRNA(14个上调,10个下调)构成共调控网络,包括76个基因间调控关系。CTA-384D8.35,CTB-114C7.4,RP11-567M16.6和hsa-miR-3158-3p是冠心病血瘀证基因调控网络中的关键节点。Real-time PCR结果验证了上述结果。结论:冠心病血瘀证存在lncRNA-miRNA-mRNA差异表达基因谱,其与免疫和炎症密切相关;差异表达基因间存在相互调控关系,并可依此构建冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。对冠心病血瘀证的物质基础进行深度挖掘,可为从转录组层面开展中医证型相关研究提供了一定的科学基础。     

冠心病血瘀证差异表达基因及其启动子甲基化状态的初步研究

目的 探讨冠心病血瘀证差异表达基因及其启动子甲基化的情况.方法 以家系冠心病血瘀证患者14例为观察对象,家系健康人7例为对照,采用表达谱芯片检测冠心病血瘀证差异表达基因.再收集冠心病血瘀证患者16例和健康人7例,选择其中2个差异基因进行启动子区甲基化特异性PCR(MS-PCR)研究,初步分析冠心病血瘀证差异表达基因及其启动子甲基化状态.结果 表达谱芯片结果通过倍数变化值(FC)＞3或FC＜1/3、Call=P筛选,共获取差异表达基因26个,选择KLF5和LRP12基因进行MS-PCR,冠心病血瘀证与健康人各启动子甲基化率比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 冠心病血瘀证差异基因KLF5和LRP12的启动子甲基化状态和健康人比较无明显区别.     

基于iTRAQ技术探讨家系早发冠心病血瘀证与ITLN1差异蛋白的相关性研究

目的筛选家系早发冠心病血瘀证患者血浆差异蛋白,探讨其对疾病发病的影响,为临床早期诊断提供潜在危险标志物。方法从101例冠心病患者中筛选出典型家系早发冠心病血瘀证患者、家系早发冠心病非血瘀证患者各3例并匹配健康对照组2例,采用同位素标记相对与绝对定量(iTRAQ)技术检测各组血浆蛋白表达情况,通过组间比较分析得出家系早发冠心病血瘀证血浆差异蛋白谱,根据差异蛋白特性及疾病病理特点筛选出疾病早期诊断的潜在危险标志物,以Western blot验证筛选出的蛋白。结果通过iTRAQ技术共得到差异蛋白84个,其中家系早发冠心病血瘀证组与健康对照组之间差异蛋白共32个,包括上调蛋白22个、下调蛋白10个。经GO功能和KEGG富集分析,家系早发冠心病血瘀证血浆差异蛋白生物学功能多与角质化、角质化包膜及表皮结构组成部分有关,其相关通路主要与金黄色葡萄球菌感染、补体系统、血小板激活等相关。验证结果表明,与健康对照组比较,家系早发冠心病血瘀证组差异蛋白内凝集蛋白1(ITLN1)表达水平有统计学意义(P<0.01)。结论根据差异蛋白特性及疾病病理特点筛选出的ITLN1可作为家系早发冠心病血瘀证早期诊断的潜在危险标志物。     

冠心病血瘀证的遗传流行病学研究

目的 探讨冠心病血瘀证的遗传特征.方法 运用病例对照的遗传流行病学家系调查方法,对冠心病血瘀证家系(观察组)1565例和冠心病非血瘀证家系(对照组)1553例进行分离比、遗传度、遗传模式及多基因遗传方式等遗传参数的计算分析.结果 观察组亲属冠心病血瘀证的患病率(5.24％)显著高于对照组(1.29％),差异有统计学意义(P＜0.05).观察组一级亲属分离比为0.1296,符合多基因遗传病的特点.观察组一级亲属遗传度为58.04％,二级亲属遗传度为54.80％,属中度遗传.观察组一级亲属遗传度为0.5804时,其理论发病率为8.00％,与实际发病率5.89％呈接近趋势;二级亲属的遗传度为0.5480时,其理论发病率为6.20％,与实际发病率4.13％呈接近趋势. 结论 冠心病血瘀证具有一定的家族聚集的倾向,其在家系中的分布符合多基因遗传特征.     

湖南汉族人群FⅦ基因M1／M2多态性与冠心病血瘀证的遗传流行病学研究

目的 利用单体型相对风险分析(HHRR)和连锁不平衡检验(TDT)方法在冠心病血瘀证家系中探讨凝血因子Ⅶ(FⅦ)基因多态性是否为冠心病血瘀证的遗传易患因素.方法 2003年10月～2006年11月收集先证者一级亲属中至少有1例冠心病患者的家系40个和健康人家系10个,属CHD血瘀证家系组25个家系81例,其中核心家系18个共60例.PCR-RFLP方法鉴定FⅦ基因M1/M2多态性基因座基因型.在对FⅦ基因多态与冠心病血瘀证基因存在关联的基础上进行HHRR和分析.结果 CHD家系FⅦ基因的基因型、等位基因均未见偏离Hardy-Weinberg平衡.在HHRR中,FⅦ的M1基因可能与冠心病血瘀证相关联;对13个满足要求的核心家系进行TDT检验,杂合子父母传递给患病子代的M1等位基因频率未显著偏离50%.结论 在冠心病血瘀证家系中发现FⅦ基因M1/M2多态性与冠心病血瘀证存在关联,但与疾病基因座不存在连锁,说明该基因座可能不是湖南汉族人群冠心病血瘀证的遗传易患基因,而是冠心病血瘀证的发病危险因素之一.     

冠心病血瘀证相关基因研究

目的：筛查冠心病血瘀证病证结合相关基因。方法：区组选择符合诊断标准的冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证、非冠心病血瘀证患者和正常健康者共40例，运用外周血mRNA差异显示获得差异条带、反向Northern法阳性验证、克隆测序，并进行生物信息学分析。结果：得到了28条真实差异基因片段序列，于NCBI human genomic数据库中比对分析，获得了与人类基因100％同源的3条(b13、49b、23b)，99％同源的2条(b12、36a)，98％同源(25b、57d)2条。其中的b13为淋巴细胞活化信号分子家族成员1，表达于T、B细胞表面，参与多系统的炎症反应，促进Th2类细胞因子的分泌，在冠心病血瘀证组呈高表达。23b系BCL2相关转录因子1，参与凋亡调控基因BCL2的转录过程，明显表达于冠心病血瘀证组。结论：差异基因中b13、23b从不同途径，导致或参与了脂代谢、血液高粘高聚高凝状态的形成，并通过分泌炎性细胞因子，调控细胞凋亡，参与了内皮损伤和动脉硬化的形成。与冠心病血瘀证的病理改变密切相关。     

ET、A—Ⅱ及其基因表达与兔冠心病血瘀证模型相关性研究

目的:探讨ET、A-Ⅱ及其基因表达与兔冠心病血瘀证模型相关性,从分子水平探讨“胸痹血瘀证”的证本质。方法:以冠心病血瘀证兔为实验对象,设立冠心病组、血瘀证组、空白对照组;引入内皮素(ET)和血管紧张素Ⅱ(A-Ⅱ)及其相关基因在心脏的表达为其客观指标。结果:与其他各组比较,冠心病血瘀证组的血浆ET和ACE舍量均增高(P<0.05,P<0.01);与其他各组比较,冠心病血瘀证组ET和A-Ⅱ基因表达均增强(P<0.05,P<0.01)。结论:冠心病血瘀证中ET、A-Ⅱ显著增高,这与该证型ET和ACE基因表达显著增强一致,提示冠心病血瘀证与相关基因过度表达有关。     

冠心病血瘀证的基因组学研究进展

血瘀证是冠心病的常见证候类型,目前尚且没有冠心病血瘀证的证候客观化标准。冠心病血瘀证的基因组学研究是从基因层面研究冠心病血瘀证证候与基因调控的相关性,为冠心病血瘀证证候客观化提供了可能的物质基础。近年来冠心病血瘀证证候形成的病理过程在基因表达水平上的研究越来越丰富,为了更好地推进冠心病血瘀证的客观化研究,我们现对冠心病血瘀证与炎症反应相关基因、血管紧张素转换酶(ACE)基因、血管性血友病因子(vWF)基因、白细胞介素(IL)基因等方面的研究进展进行归纳总结。     

ET、A-II及其基因表达与兔冠心病血瘀证模型相关性研究

目的探讨ET、A-II及其基因表达与兔冠心病血瘀证模型相关性,从分子水平探讨"胸痹血瘀证"的证本质.方法以冠心病血瘀证兔为实验对象,设立冠心病组、血瘀证组、空白对照组;引入内皮素(ET)和血管肾张素II(A-II)及其相关基因在心脏的表达为其客观指标.结果与其他各组比较,冠心病血瘀证组的血浆ET和ACE含量均增高(P＜0.05,P＜0.01);与其他各组比较,冠心病血瘀证组ET和A-II基因表达均增强(P＜0.05,P＜0.01).结论冠心病血瘀证中ET、A-II显著增高,这与该证型ET和ACE基因表达显著增强一致,提示冠心病血瘀证与相关基因过度表达有关.     

肾虚糖尿病家系中的血瘀证研究

目的:通过一个肾虚糖尿病家系,研究血瘀证候的分子生物学基础,提示利用家系和基因芯片深入研究血瘀证分子机理的可行性。方法:对一个糖尿病家系18个成员做理化测试及肾虚血瘀诊断后,精选其中3例肾虚血瘀证糖尿病患者与该家系中的2例正常人作14000点的基因芯片杂交测试。结果:获得肾虚血瘀证糖尿病家系图谱和肾虚、血瘀症状分值比较表,同时得到肾虚血瘀证糖尿病患者与正常人的差异基因446条,尤其是血栓素A合成酶1等5条基因与血瘀证的发生密切相关。结论:利用家系研究寻找宏观的证候和微观的差异基因表达具有极强的的优势,有助于探讨肾虚血瘀糖尿病证候与差异表达基因之间的关系。     

三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死的通用分子机制研究

目的:采用生物信息学方法,分析脑梗死气虚血瘀证、阴虚血瘀证证型相关特异性基因及共性基因,并对三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死血瘀证的通用分子机制进行探讨,为中西医结合防治脑梗死提供理论依据。方法:分析GEO芯片数据,筛选获得脑梗死气虚血瘀证、阴虚血瘀证差异基因,将2种血瘀证差异基因取交集得证型相关特异性基因与血瘀证共性基因3个子集。从蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)共表达网络、基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析角度,探讨2种血瘀证特异基因的作用异同。筛选三七通舒胶囊联合丁苯酞活性成分靶点与血瘀证共性基因整合,获得"药物-疾病-证型"共同靶点,拓扑分析聚焦核心靶点并行分子对接,并构建共同靶点PPI网络并行富集分析,探讨三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死血瘀证的作用机制。结果:获取脑梗死气虚血瘀证差异基因2 092个、阴虚血瘀证差异基因2 160个,其中气虚血瘀证特异基因422个、阴虚血瘀证特异基因490个及血瘀证共性基因1 670个。其中气虚血瘀证、阴虚血瘀证差异基因均通过多组分、多功能、多途径发挥作用,但气虚血瘀证中MMP-9、EIF4A3等靶点相互作用最强,主要通过T细胞受体信号通路等发挥作用;阴虚血瘀证中EGFR、STAT3等靶点相互作用最强,并通过ErbB信号通路发挥作用。筛选获得274个药物靶点,整合血瘀证共性基因后得32个共同靶点,拓扑分析后聚焦核心靶点SRC,分子对接发现氢键连接、混合Pi键连接和疏水作用可能是主要作用形式。三七通舒胶囊联合丁苯酞以多组分、多功能、多途径的形式介导趋化因子信号通路,cAMP信号通路等在脑梗死血瘀证中发挥作用。结论:2种血瘀证证型相关特异基因分析揭示了证型富集特点,为证型相关研究提供依据。"药物-疾病-证型"共同靶点的分析结果揭示了三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死血瘀证可能的通用分子机制。为中西医结合治疗脑梗死提供依据。     

冠心病血瘀证相关基因b13的筛查和临床验证

目的:筛查冠心病血瘀证病证结合证候相关基因。方法:临床区组选择符合诊断标准的冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证、非冠心病血瘀证患者和正常健康者共40人,运用外周血mRNA差异显示获得差异条带、反向Northern法阳性验证、克隆测序,并进行生物信息学分析和临床验证。结果:得到的28条真实差异基因片段序列,与人类基因数据库中比对分析,获得的b13与人类基因淋巴细胞活化因子1有100%的同源性,在冠心病血瘀证组显著表达。结论:差异基因b13通过T淋巴细胞的活化,引起免疫反应,导致进一步内皮损伤,刺激内皮细胞表达细胞因子、趋化因子及细胞黏附分子,促进炎性细胞黏附及脂质沉积,参与了内皮损伤和动脉硬化的形成。与冠心病血瘀证的病理改变密切相关。     

1个糖尿病家系肾阴阳两虚血瘀证糖尿病的差异表达基因分析

目的　研究糖尿病家系中与肾虚 (阴阳两虚 ) -血瘀相关联的基因表达谱。为证候的分子生物学现代化研究探索一条行之有效的研究道路。方法　应用基因芯片技术对 1个糖尿病家系中的 3例肾阴阳两虚 -血瘀证 -糖尿病患者与同一家系中的 2例正常人进行检测。结果　发现差异基因 4 4 6条 ,其中上调基因 8条 ,下调基因 4 38条。其中包括与代谢相关 34条 ,细胞凋亡相关 6条 ,细胞周期相关 3条 ,与糖尿病相关 2条。与创同中医理论肾的功能相关基因 2 0条 ,与血瘀相关基因 2条。结论　虚证与基因下调有密切联系 ,对分类基因的分析发现 :肾阴阳两虚与广泛的功能基因相关 ,血瘀证与血流血压的相关基因有关。在同一家系中进行病证结合基因的研究 ,可排除大量干扰因素在有限的资源内实现最大化研究。实验提示 :与中医肾阴阳两虚证表现相关的基因涉及到现代医学机体代谢减慢、免疫功能下降、肿瘤的发生、生殖与衰老等各方面。     

冠心病血瘀证相关基因研究

目的:筛查冠心病血瘀证病证结合相关基因。方法:区组选择符合诊断标准的冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证、非冠心病血瘀证患者和正常健康者共40例,运用外周血mRNA差异显示获得差异条带、反向Northern法阳性验证、克隆测序,并进行生物信息学分析。结果:得到了28条真实差异基因片段序列,于NCBI human genomic数据库中比对分析,获得了与人类基因100％同源的3条（b13、49b、23b）,99％同源的2条（b12、36a）,98％同源（25b、57d）2条。其中的b13为淋巴细胞活化信号分子家族成员1,表达于T、B细胞表面,参与多系统的炎症反应,促进Th2类细胞因子的分泌,在冠心病血瘀证组呈高表达。23b系BCL2相关转录因子1,参与凋亡调控基因BCL2的转录过程,明显表达于冠心病血瘀证组。结论:差异基因中b13、 23b从不同途径,导致或参与了脂代谢、血液高粘高聚高凝状态的形成,并通过分泌炎性细胞因子,调控细胞凋亡,参与了内皮损伤和动脉硬化的形成。与冠心痛血瘀证的病理改变密切相关。     

vWF、Fg基因多态性与冠心病血瘀证的相关性研究

目的:探讨v WF19内含子Msp I、Fg Bβ基因启动区-148C/T多态性与冠心病血瘀证的关系。方法:将150例确诊为冠心病的患者分为血瘀证组100例、非血瘀证组50例,另抽取体检健康者50例作为健康对照组。采用聚合酶链-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对v WFMsp I、Fg Bβ基因启动区-148C/T进行基因多态性分析。结果:与健康对照组相比,v WF内含子Msp I基因型与等位基因分布频率在冠心病血瘀证组差异有统计学意义(P0.01),而在非血瘀证组的分布差异则无统计学意义(P0.05);在冠心病血瘀证与非血瘀证组间的分布差异亦无统计学意义(P0.05)。M-M-基因型患冠心病血瘀证的OR值为2.970(1.470~6.000,P0.01),而患冠心病非血瘀证的OR值为2.077(0.934~4.615,P0.05);M-等位基因患冠心病血瘀证的相对危险度为1.888(1.082~3.296,P0.05)。与健康对照组相比,Fg Bβ-148C/TT基因型与等位基因分布频率在冠心病血瘀证组差异有统计学意义(P0.05),而在非血瘀证组的分布差异则无统计学意义(P0.05);在冠心病血瘀证组与非血瘀证组间的分布差异亦无统计学意义(P0.05)。TT基因型罹患冠心病血瘀证与冠心病非血瘀证的相对危险度分别为3.244、2.524,p值分别为0.033、0.137;而T等位基因罹患冠心病血瘀证组与非血瘀证的相对危险度分别为12.317、2.244,p值分别为0.000、0.015。结论:v WF基因Msp I多态性中,M-M-基因型与M-等位基因与冠心病血瘀证发生相关,且可能为其独立危险因素;Fg基因-148多态性中,TT基因型与冠心病血瘀证发生相关,T等位基因可能与冠心病发生相关。     

冠心病血瘀证免疫炎症机制研究撷要＊

冠心病（Coronary heart disease，CHD）是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型，免疫炎症机制在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥着重要的作用。中医认为冠心病属“胸痹心痛”范畴，以血瘀证为主要证候要素，而冠心病血瘀证患者的免疫功能往往易于呈现紊乱状态，以免疫炎症机制为切入点，开展冠心病血瘀证相关研究，是对血瘀证证候内涵的挖掘和拓展，也对充分理解活血化瘀药物的作用具有重要意义。本文概述多组学技术在冠心病血瘀证免疫炎症方面的应用研究成果，梳理冠心病血瘀证中涉及到的免疫炎症相关环节（如免疫细胞、明星标志物、信号通路等），以及活血化瘀中药在调节免疫反应中的具体作用机制等，以概览冠心病血瘀证在免疫炎症方面的实质内涵。