IKK2dn转染树突状细胞诱导产生的CD4+CD25-T细胞的筛选及鉴定

目的 探讨从转染IKK2dn并负载供者抗原的未成熟树突状细胞(imDC)诱导产生的调节性T细胞(Treg)中筛选CD4+ CD25 - Treg的方法,并进行鉴定.方法 Lewis大鼠骨髓源性imDC,转染IKK2dn后负载供者BN大鼠抗原,与Lewis大鼠T细胞进行体外混合淋巴细胞反应(MLR)诱导产生Treg,用免疫磁珠法(MACS)筛选出CD4+ CD25 -T细胞,流式细胞仪(FCM)检测细胞纯度.加入CD4+ CD25 -T细胞行再次MLR检测其抑制T细胞增殖的作用.结果 经MACS筛选,CD4+ CD25 -T细胞纯度为(95.78±1.25)％.再次MLR结果显示CD4+ CD25 -T细胞组的吸光度值为(0.106±0.006),低于BN抗原组(0.189±0.007)、Adv0-CD4+T细胞组(0.419±0.014)及第三方供者抗原组(0.200±0.008),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 转染IKK2dn并负载抗原的imDC诱导产生的Treg,经MACS筛选可以获得高纯度的CD4+CD25-T细胞,对同种T细胞增殖具有针对供者的特异性免疫抑制作用.     

霉酚酸酯对未成熟树突状细胞抗原递呈功能的影响

目的研究霉酚酸酯(MMF)在体外对小鼠未成熟树突状细胞抗原递呈功能的影响。方法在骨髓来源未成熟树突状细胞的培养过程中加入MMF，表型鉴定之后，做抗原递呈功能分析，观察抗原特异性增殖反应、混合淋巴细胞反应以及T淋巴细胞抗原特异性低反应性。结果以MMF处理的未成熟树突状细胞向T淋巴细胞递呈可溶性抗原的能力减弱，在同基因型的树突状细胞和T淋巴细胞接触条件下不能刺激致敏T淋巴细胞的有效增殖；MMF处理的树突状细胞在体外的同种混合淋巴细胞培养反应中能够维持树突状细胞于未成熟状态，不能充分活化CD4^ T淋巴细胞和诱发TH1反应，诱导了T淋巴细胞对同种抗原的低反应性；MMF处理的树突状细胞诱导的T淋巴细胞低反应性具有同种抗原特异性。结论在体外培养过程中给予MMF干预能够降低未成熟树突状细胞的抗原递呈能力，增强同种未成熟树突状细胞的免疫耐受诱导作用。     

小鼠胃癌模型的建立及T细胞免疫功能的变化

目的 通过多因素联合攻击法建立小鼠原发胃癌模型并检测其免疫功能水平的变化.方法 采用BALB/C小鼠以3-甲基胆蒽(3-MCA)挂线法联合N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)灌胃法诱导小鼠胃癌.于12周及20周取血及脾细胞检测其CD4~+CD25~+调节性T细胞(CD4~+CD25~+Treg Cells)及T细胞亚群,同时取胃标本行病理学检查,通过统计学方法分析结果.结果 多因素联合攻击法诱导率为37.5%(6/16),实验组小鼠(4.52±1.97)g体质量变化有所降低(P<0.05).脾白细胞计数(372±140)×10~9升高(P<0.05).外周血(8.07±6.62)%及脾(6.45±4.13)%CD4~+CD25~+Treg细胞比例均升高(P<0.05),脾CD4~+/CD8~+细胞比值(1.95±0.62)明显升高(P<0.05).结论 多因素联合攻击法为小鼠胃癌为小鼠胃癌模型建立提供了良好的模型.小鼠胃癌发展过程中CD4~+CD25~+Treg细胞呈高表达,且在肿瘤形成后免疫功能呈现免疫抑制状态.     

CD4+CD25+调节性T细胞对同种胰岛移植免疫耐受的影响

目的 观察体外分离的CD4+CD25+调节性T细胞对同种胰岛移植免疫耐受的影响.方法 免疫磁珠法分离CD4+CD25+调节性T细胞,体外试验观察其对CD4+CD25-T细胞增殖的影响.将数量达1×106的CD4+CD25+调节性T细胞回输胰岛移植受体,对比其对移植物存活的影响.结果 分离的CD4+CD25+调节性T细胞体外试验可明显抑制CD4+CD25-T细胞的增殖.单纯胰岛移植组移植物物存活期为(5.57±0.79)d,回输受体CD4+CD25+调节性T细胞数量1×106、2×106时,胰岛移植物存活时间分别为(15.29±2.29)d和(25.43±2.30)d(P《0.01).CD4+CD25+调节性T细胞回输胰岛移植受体可显著延长移植物存活期,诱导免疫耐受的作用为剂量依赖性.结论 CD+CD25+调节性T细胞体外、体内试验可抑制效应性T细胞功能,诱导胰岛移植免疫耐受.     

树突状细胞和CD4+CD25+调节性T细胞在免疫耐受中的作用及关系

诱导免疫耐受具有高效、低毒、经济等优点,在器官移植中有着极其重要的意义.在建立免疫耐受中,树突状细胞(DC)起到克隆清除、克隆无能、表达T细胞抑制因子、选择性激活辅助T细胞和诱导调节性T细胞尤其是CD4+CD25+调节性T细胞的产生等作用.而CD4+CD25+调节性T细胞主要以DC为作用靶点,影响其分化成熟,抑制DC向...     

CD4+CD25+调节性T细胞在维持小鼠肝脏移植自发性免疫耐受状态中的作用

目的 探讨CD4+CD25+调节性T细胞在维持小鼠肝脏移植免疫耐受状态中的作用.方法 进行小鼠原位肝脏移植,诱导出移植免疫耐受后,向受体注射抗CD25抗体(PC61)以去除CD4+CD25+T细胞,检测受体内CD4+CD25+T细胞数量及叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)的表达以确定CD4+CD25+T细胞完全被清除,同时观察受体生存时间.结果 与同种同系小鼠肝脏移植结果 相似,同种异系肝脏移植小鼠的生存时间亦均超过70 d.移植免疫耐受诱导后,PC61不同注射方案均能完全去除受体小鼠肝脏、脾脏及血液中的CD4+CD25+T细胞,且移植肝脏中Foxp3 mRNA的表达也明显降低,表明完全去除了CD4+CD25+调节性T细胞,但肝脏移植动物生存时间并未受到影响.结论 CD4+CD25+调节性T细胞对于小鼠肝脏移植自发性免疫耐受的维持并非必需.     

肝癌病人外周血中CD4+CD25+FOXP3+调节性T淋巴细胞表达水平的临床研究

目的 了解CD4+CD25+FOXP3+T调节性T细胞在肝癌病人外周血中的表达水平并探讨其临床意义.方法 应用流式细胞术测定18例肝癌病人外周血CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+T淋巴细胞百分比,并与26例l临床对照者和24例健康对照者进行比较.结果 肝癌病人外周血中CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞百分比(4.25%±3.98%)明显高于临床对照组(1.34%±1.14%)及健康对照组(1.29%±0.95%)(P＜0.01),而两个对照组之间并无显著性差异(P＞0.05).CD4+CD25+FOXP3+T细胞在肝癌病人外周血所占CD4+T细胞比率(2.94%±0.91%)也较临床对照组(0.76%±0.34%)及健康对照组(0.81%±0.29%)显著升高(P＜0.001),且升高幅度强于CD4+CD25+T细胞水平,两个对照组之间并无显著性差异(P＞0.05).结论 CD4+CD25+FOXP3+T细胞是更为准确的调节性T细胞,其在肝癌病人外周血中表达水平明显升高,检测CD4+CD25+FOXP3+T水平对肝癌的预防治疗具有重要临床意义.     

Toll样受体4在高迁移率族蛋白B1影响小鼠调节性T细胞免疫功能中的作用

目的 探讨腹腔注射高迁移率族蛋白B1(HMGB1)后不同基因型小鼠天然调节性T细胞(CD4~+CD25~+Treg)免疫功能的改变及其受体作用机制.方法 分别给C3H/HeN和C3H/HeJ[分别为Toll样受体4(TLR4)野生型(TLR4~(+/+))和天然突变型(TLR4~(-/-)]小鼠腹腔注射不同剂量HMGB1(0、10、20μg/只),饲养48 h后采用免疫磁珠法分离小鼠脾脏CD4~+CD25~+Treg.体外培养12 h后采用流式细胞仪检测CD4~+CD25~+Treg表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)表达强度,并应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CD4~+CD25~+Treg生成白细胞介素(IL)-10量.结果 与对照组比较,20 μg HMGB1攻击后C3H/HeN小鼠CD4~+CD25~+Treg表达CTLA-4水平显著下降(78.70±11.42与60.76±7.64,P<0.01),同时细胞牛成IL-10量也明显降低[(96.89±6.25)ng/L与(47.11±4.25)ng/L,P<0.01];但不同剂量HMGB1攻击可引起C3H/HeJ小鼠CD4~+CD25~+Treg表达CTLA-4明显上调和生成IL-10量不同程度地增加(P<0.01).结论 HMGB1攻击可显著影响CD4~+CD25~+Treg介导的免疫状态,TLR4在HMGB1诱导CD4~+CD25~+Treg免疫活性过程中发挥了重要负向调控作用.     

CD4~+CD25~+调节性T细胞诱导同种异体复合组织移植免疫耐受功能的研究

目的 探讨供体抗原特异性CD4~+CD25~+调节性T细胞(Treg),对同种异体复合组织 移植(CTA)受体大鼠细胞免疫耐受功能的影响.方法 采用免疫磁珠法分选CD4~+CD25~+Treg,将数 量1×10~6的CD4~+CD25~+Treg输注入CTA受体的大鼠,术后30 d采取外周血,尼龙毛柱分离T、B细 胞,检测在IgM 抗体刺激下的增殖放射强度的液体闪烁测定(CPM)值及血清lgG和IgA水平,判断 CD4~+CD25~+Treg对T、B细胞功能的影响及CTA的存活情况,并进行统计学分析.结果 分选的CD4~+CD25~+Treg纯度为95.6%.T、B细胞CPM值:正常对照组分别为2436±358、2418±348,Treg 局部干预组为2273±136、2252±127,Treg全身干预组分别为2338±228、2315±218,Treg未干预组分 别为3749±245、3720±224;Treg 未干预组与其三组比较差异均有统计学意义(P<0.01).血清IsG、IgA水平:Treg 局部和全身干预组分别为(12.56±1.30)g/L、(2.38±0.21)g/L和(13.48±1.23) g/L、(2.86±0.24)g/L,与正常对照组(12.35±1.28)g/L、(2.36±0.12)g/L比较差异无统计学意 义(P>0.05),三组与Treg未干预组(16.58±1.12)g/L、(3.75±0.37)g/L比较差异有统计学意义 (P<0.01).Treg 局部和全身干预组CTA存活时间分别为(97±13)和(63±lO)d,显著长于Treg未 干预组的(22±8)d(P<0.01).结论 供体抗原特异性CD4~+CD25~+Treg对T、B细胞功能有明显的 抑制作用,能诱导CTA免疫耐受,延长其存活时间,且局部应用效果优于全身.     

结肠抗原特异性T细胞克隆回输治疗大鼠溃疡性结肠炎的研究

目的　探讨结肠抗原特异性T细胞克隆回输治疗溃疡性结肠炎大鼠的作用。方法将结肠抗原特异性T细胞克隆回输至 2 0只溃疡性结肠炎大鼠 ,观察刺激指数 (SI)、CD 4、CD 8以及CD4 CD2 5 T细胞和白细胞介素 13和白细胞介素 4水平的变化 ,并对照治疗前后结肠病变情况。结果　克隆回输后结肠炎症吸收 ,症状基本消失。回输前SI平均值为 8.15± 2 .2 4,回输后为2 .0 2± 0 .87;CD 4、CD 8水平、CD 4/CD 8比值、IL 13和IL 4水平呈明显下降 ,CD4 CD2 5 调节性T细胞水平 (% )明显升高 (16.5± 3 .8Vs 45 .4± 4.9) ,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论　结肠抗原特异性T细胞克隆回输 ,成功诱导溃疡性结肠炎大鼠进入特异性免疫耐受状态 ,CD4 CD2 5 调节性T细胞可能参与耐受机制     

1-甲基色氨酸对胰腺癌荷瘤鼠中调节性T细胞数量变化的影响

目的 观察1-甲基色氨酸(1-MT)对胰腺癌荷瘤鼠中调节性T细胞(Treg)数量变化的影响,比较树突状细胞(DC)疫苗与1-MT联合应用前后抗肿瘤作用的强弱.方法 建立小鼠胰腺癌模型;利用流式细胞术检测荷瘤鼠应用1-MT前后肿瘤组织周围引流淋巴结(TDLNs)及脾脏中CD4~+ CD25~+T细胞占CD4~+T比例;荧光定量聚合酶链反应(PCR)测量Foxp3在TDLNs及脾脏mRNA水平;利用肿瘤细胞裂解物冲击DC制备DC疫苗,并根据是否与1-MT联合应用分组(各组均为n=8);观测各组肿瘤体积的差异.结果 应用1-MT后,荷瘤鼠CD4~+ CD25~+ T细胞占CD~+T细胞的比例明显低于未应用组(TDLNs)分别为(16.01±2.21)%和(25.00±2.16)%(P<0.05);脾脏分别为(13.11±1.93)%和(22.14±2.33)%(P<0.05,P<0.01);应用1-MT组Foxp3 mRNA表达水平显著低于未应用组,应用1-MT组相对表达值:TDLNs0.947±0.216、脾细胞1.198±0.347,而未应用组分别为:1.927±0.256、1.798±0.237(P<0.05);1-MT+DC疫苗组肿瘤生长显著受到抑制,第36天肿瘤体积为(789.0±111.0)mm~3;显著小于DC疫苗组、1-MT组及对照组,肿瘤体积分别为:(1768.0±251.3)、(1854.0±192.1)、(1899.0±201.2)mm~3(P<0.01).结论 1-MT可以有效抑制胰腺癌荷瘤鼠癌组织周围引流淋巴结及脾脏CD4~+ CD25~+ Treg细胞的数量增加,从而增强DC疫苗抗肿瘤作用.     

胃癌患者外周血调节性T细胞的变化及其意义

目的 探讨胃癌患者外周血中CD4+CD25+T淋巴细胞、CD8+CD28-T淋巴细胞比例的变化及其临床意义.方法 采用流式细胞技术检测30例胃癌患者外周血中CD4+CD25+T淋巴细胞、CD8+CD28-T淋巴细胞玎分比,对照组为30例慢件胃炎患者.结果 胃癌患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞占T淋巴细胞的百分比为8.7%±1.3%,与胃炎患者相比差异无统计学意义.胃癌患者外周血中CD8+CD28-调节性T细胞占T淋巴细胞的百分比为30.3%±3.3%,明显高于胃炎患者的20.3%±2.7%.外周血中CD4+CD25+T淋巴细胞、CD8+CD28-T淋巴细胞百分比与胃癌淋巴结转移、病理分型无明显相关性.结论 外周血中调节性T细胞在胃癌发展中可能发挥一定作用.     

胰腺癌荷瘤鼠吲哚胺2,3-双加氧酶表达和CD4~+CD25~+Treg细胞数的变化

目的 观察吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达以及调节性T细胞(Treg)数量在胰腺癌荷瘤鼠中的变化,并探讨胰腺肿瘤细胞免疫逃逸的机制.方法 建立小鼠胰腺癌模型,荧光定量聚合酶链反应(PCR)、Western blot分析肿瘤组织周嗣引流淋巴结(TDLNs)IDO表达水平;并利用流式细胞术检测荷瘤鼠TDLNs及脾脏中CD4~+CD25~+T细胞占CD4~+T比例;荧光定虽PCR测量Foxp3在TDLNs及脾脏mRNA水平.结果 胰腺癌荷瘤鼠TDLNs中IDO在mRNA(1.670±0.099比1.123±0.243),蛋白表达水平(1.401±0.079比0.872±0.193),高于正常对照组.差异均有统计学意义(P<0.05);荷瘤鼠和脾细胞中CD4~+CD25~+T细胞占CD4~+T细胞的比例明显高于对照鼠[TDLNs分别为(25.00±2.16)%和(11.02±1.31)%,P<0.05;脾脏分别为(22.14±2.33)%和(12.11±0.93)%,P<0.05];荷瘤鼠Foxp3 mRNA表达水平显著高于对照鼠,荷瘤鼠分别为:TDLNs 3.427±0.164、脾细胞2.098±0.112,而对照鼠分为:0.933±0.253、1.137±0.343(P<0.05).结论 胰腺癌荷瘤鼠癌组织周围引流淋巴结IDO表达明显增高,且TDLNs及脾脏CD4~+CD25~+Treg细胞的数量增加.     

调节性CD4~+CD25~+T细胞的分离纯化及免疫功能研究

目的 制备调节性CD~+ CD25~+T细胞(Treg)分析其免疫功能,诱导局部免疫耐受防治同种异体复合组织移植(CTA)排斥反应.方法 采用免疫磁珠法(MACS)从雄性大鼠脾脏细胞分离CD4~+CD25~+Treg(1×10~6),2%锥虫蓝染色检测活性、流式细胞术分析其纯度,在5 mg/L抗CD3的刺激下观察其反应性、增殖及其与200 U/ml细胞介素(IL)-2的关系.结果 从8只雄性大鼠脾脏分选出的CD4~+CD25~+Treg活性平均为(97.90±0.36)%及纯度为(96.05±0.41)%,CD3刺激呈低反应,按比例培养抑制率为89%,IL-2可使CD4~+CD25~-抑制逆转.结论 MACS能快速分选出较高纯度的CD4~+CD25~+Treg,并且活性良好在体外具有免疫无能及免疫抑制作用,能满足动物CTA排斥反应研究的需要.     

CD4+ CD25+ Tr细胞与大鼠肝移植自发免疫耐受关系的研究

目的研究CD4^＋CD25^＋Tr细胞及其相关基因Foxp3与大鼠肝移植自发免疫耐受的关系。方法双袖套法建立大鼠原位肝移植模型;密度梯度离心法分离肝内淋巴细胞;免疫磁性分离法（MACS）分选CD4^＋CD25^＋Tr细胞,流式细胞术（FCM）检测所得细胞纯度。体外细胞增殖试验研究CD4^＋CD25^＋Tr细胞的免疫抑制作用。Western蛋白印迹法检测CD4^＋CD25^＋Tr细胞Scurfin蛋白表达。结果自发耐受组大鼠移植肝内CD4^＋CD25^＋Tr细胞含量显著高于急性排斥组。混合淋巴细胞反应中,LEW大鼠的脾细胞比DA大鼠自身的脾细胞更能刺激CD4^＋CD25^＋T细胞的增殖。CD4^＋CD25^-T细胞能抑制CD4^＋CD25^-T细胞的增殖,当加入外源性IL-2（200U／ml）时,该抑制作用被逆转。结论转录因子Foxp3介导的CD4^＋CD25^＋Tr细胞的免疫抑制作用可能是诱导大鼠肝脏移植自发免疫耐受的机制之一。     

Immunophenotypic analysis of the aortic aneurysm wall suggests that vascular dendritic cells are involved in immune responses

Objective: Inflammatory infiltrates similar to those in atherosclerotic plaques are prominent in the abdominal aortic aneurysm wall. Antigen presenting vascular dendritic cells are present in both early and advanced atherosclerotic lesions but their possible participation in abdominal aortic aneurysms has not been previously examined. This study reports the presence of vascular dendritic cells in abdominal aortic aneurysms and their participation in immune responses. Methods: Samples of the anterior wall were collected from 18 atherosclerotic infrarenal abdominal aortic aneurysms ranging in diameter from 5–8 cm. All the patients were operated upon electively and no ruptured or rapidly expanding abdominal aortic aneurysms were included. Specimens were immediately frozen or fixed in 10% buffered formalin. Vascular dendritic cells were identified with anti-CD1a or with S-100. T cells and T cell subpopulations were identified with anti-CD3, anti-CD4 and anti-CD8. B cells were studied with anti-CD20. Analyses were carried out in sets of consecutive parallel sections immunostained with these antibodies and double immunostaining included different combinations of antigens such as CD1a/CD3, S-100/CD4, S-100/CD8. Results: Most inflammatory infiltrates were found in the adventitia. These infiltrates contained B cells (CD20+) and T cells (CD3+) with their CD4+ and CD3+ cell subpopulations. In the aneurysm wall, CD1a+/S-100+ cells exhibiting dendritic appearance were detected and double immunostaining demonstrated that these vascular dendritic cells contained different lymphocyte populations including CD3+, CD4+, CD8+ and CD20+ cells. In some inflammatory infiltrates, B cells (CD20+) represented the predominant cell population (60–80%). Double immunostaining demonstrated that, in these infiltrates, vascular dendritic cells contacted CD20+ cells. Conclusions: vascular dendritic cells are involved in immune reactions in the aneurysm wall, and this process mostly occurs in the adventitia. Vascular dendritic cells contact both T cells and B cells, suggesting that these vascular dendritic cells differ from other dendritic cells, subtypes of which associate with T cells (Langerhans cells, interdigitating cells) and B cells (follicular dendritic cells).     

输注鼠基因工程Treg细胞抑制小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病

目的 探讨输注慢病毒载体介导的鼠基因工程调节性T淋巴细胞(Treg细胞)对小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病(GVHD)的影响.方法 利用慢病毒载体介导,将鼠又状头螺旋转录因子(Foxp3)基因转导入Balb/c小鼠的CD4~+ CD25~-T淋巴细胞,即为基因工程Treg细胞.以Balb/c小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者,进行异基因骨髓移植,实验分4组进行:(1)工程Treg组经受鼠尾静脉输注供鼠骨髓细胞5×10~6个+脾细胞5×10~6个+基因工程Treg细胞5×10~6个;(2)移植对照组经受鼠尾静脉输注供鼠骨髓细胞5×10~6个+脾细胞5x10~6;(3)单纯照射组经受鼠尾静脉输注RPMI 1640培养液0.2ml;(4)空载体对照组经受鼠尾静脉输注供鼠骨髓细胞5×10~6个+脾细胞5×10~6个十空载体转导的CD4~+ CD25~-T 淋巴细胞5×10~6个.每天观察受鼠存活情况;记录GVHD的发生情况;各组均于小鼠濒死前取其肝脏、小肠、皮肤等组织,进行病理学观察;取长期存活(超过60d)的受鼠骨髓细胞,检测嵌合情况.结果 单纯照射组、移植对照组、工程Treg组和空载体对照组小鼠存活时间分别为(8.8±0.6)d、(36.7±2.5)d、(51.6±4.0)d和(34.1±2.3)d,工程Treg组小鼠存活时间明显长于其他各组,差异有统计学意义(P<0.05).移植对照组及空载体对照组小鼠肝脏、皮肤和小肠病理切片均存在GVHD病理改变,工程Treg组长期存活小鼠的肝脏、皮肤和小肠常规病理切片结构基本正常,未见GVHD病理表现,该组GVHD评分明显低于移植对照组及空载体对照组.结论 小鼠异基因骨髓移植时联合输注基因工程Treg细胞可有效减少GVHD的发生,减轻其严重程度.