肿瘤抗原基因MAGE-A9的克隆及原核表达

目的扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A9cDNA,构建原核表达载体,表达并纯化MAGE-A9蛋白。方法从人肝癌组织提取总RNA,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从中扩增出MAGE-A9 cDNA,插入载体pMD18-T中,测序正确后,构建重组表达载体pBAD/gⅢ-MAGE-A9,转化大肠杆菌TOP10株。以L-Arabi-nose进行诱导表达,并纯化。结果获得MAGE-A9cDNA,测序结果与GenBank一致。成功构建表达载体,表达可溶重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其相对分子质量为35 000。结论成功地构建了pBAD/gⅢ-MAGE-A9原核表达质粒,获得了MAGE-A9蛋白,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

大鼠促黄体素基因β亚基的克隆和在COS细胞中的表达

从摘除卵巢的雌性大鼠脑垂体中提取总RNA，利用RT-PCR技术扩增了促黄体素（LH）的亚基基因。序列分析表明该基因序列与国外报道的促黄体素（LH）的亚基基因序列安全相同。将该基因片段插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)上，构建表达质粒pcDNA3.1(-)/LH，利用脂质体包裹技术转染COS细胞，放免检测结果显示LH的表达量达6.2miu/ml。     

人胎盘TRAIL基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增了可溶性TRAIL(凋亡素配体2)基因片段.序列分析表明该基因序列与国外发表的可溶性TRAIL基因片段的序列完全相同.将该基因片段插入到含T7启动子的质粒pET-28c(+)上,构建表达质粒pET-28c(+)TRAIL,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得表达菌株BL-pET-28c(+)TRAIL.表达菌经1 mmol/L的IPTG诱导表达4h后,产生大量的重组人TRAIL蛋白,SDS-PAGE扫描计算机灰度分析表明,表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白的40%以上.     

黑色素瘤抗原-3原核重组质粒的构建及表达

目的 构建MAGE-3目的 基因原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆茵(E.coli)B121(DE3)中的表达.方法 RT-PCR法制备MAGE-3目的 基因,连接入原核表达载体pGEX-4T-1.构建MAGE-3目的 基因的原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并测序,将该质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,12%SDS-PAGE和Western Blot表达鉴定.结果 扩增出349bp的MAGE-3 目的 基因并构建了原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3;测序结果与GenBank收录序列相一致;在E.coli BL21(DE3)中检测到含该重组表达载体的转化菌表达出分子量约35kD的融合蛋白并证实其为目的 蛋白.结论 成功构建的原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础,为后续实验提供了依据.     

N-myc下游调控基因1在肝细胞癌中的表达及其与预后的相关性

目的 肝细胞癌(HCC)是肝最常见的原发性恶性肿瘤之一.N-myc下游调控基因1(NDRG1)在肝癌中的作用尚存争议.文章旨在证实NDRG1在HCC患者中的表达及其预后价值、潜在的生物学功能以及对免疫系统的影响.方法 选择TCGA数据库中的肝癌数据,包括58例正常肝组织标本和407例肝癌标本及与之相应的临床资料,对ND...     

癌-睾丸抗原在肝细胞癌中的研究进展

肝癌的主要治疗方法为手术治疗、局部或全身化疗等,尽管患者的长期生存率有所提高,但术后5年存活率仍在43%~61%。为预防复发、治疗不能手术切除或不能耐受化疗的患者,生物治疗成为继手术、放疗和化疗后肿瘤治疗的第四模式,其中免疫治疗已成为关注的焦点。开展肿瘤     

sTRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

克隆TRAIL基因的95-281位(sTRAIL)，构建表达载体，建立原核表达体系，优化诱导表达的条件。分离人外周血淋巴细胞，提取总RNA，RT-PCR，克隆sTRAIL的cDNA，构建原核表达载体，优化IPIG诱导的条件。结果：(1)克隆了TRAIL基因95-281位的cDNA，DNA测序结果与报道的一致。(2)构建了sTRAIL基因的原核表达载体，酶切结果与预期的一致。(3)转化宿主菌，优化IPIG诱导条件，发现3mmol/L，诱导3～4h表达最好。sTRAIL基因的克隆及表达为下游中试发酵及纯化奠定了上游的基础，也为研究TRAIL抗肿瘤的机制提供了可能。     

MTA1基因在甲状腺乳头状癌中的表达及其临床意义

目的:探讨MTA1基因的表达与甲状腺乳头状癌组织浸润转移及临床病理指标之间的关系.方法:采用免疫组织化学S-P法,检测64例甲状腺乳头状癌组织和20例甲状腺良性病变组织(结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤)中MTA1基因的表达.结果:甲状腺乳头状癌中MTA1的表达明显高于甲状腺良性病变组织(P＜0.05),MTA1在甲状腺乳头状癌组织中的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小无关(P＞0.05);而与甲状腺乳头状癌的临床分期、淋巴结转移显著相关(P＜0.05).结论:MTA1基因的过度表达与甲状腺乳头状癌浸润和转移密切相关,MTA1基因的过度表达可能是评价甲状腺乳头状癌恶性程度、转移的重要指标.     

人胎盘TRAIL基因的克隆和大肠杆菌中的表达

从人胎盘中提取总RNA，利用RT－PCR技术扩增了可溶性TRAIL（凋亡素配体2）基因片段。序列分析表明该基因序列与国外发表的可溶性TRAIL基因片段的序列完全相同。将该基因片段插入到含T7启动子的质粒pET-28c( )上，构建表达质粒pET-28c( )TRAIL，转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选获得表达菌株BL－pET-28c( )TRAIL。表达菌经1mmol/L的IPTG诱导表达4h后，产生大量的重组人TRAIL蛋白，SDS－PAGE扫描计算机灰度分析表明，表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白的40％ 以上。     

Construction of lentiviral vector carrying Rab9 gene and its expression in mouse brain

Rab proteins and their effectors facilitate vesicular transport by tethering donor vesicles to their respective target membranes. Rab9 mediates late endosome to trans-Golgi-network trafficking. To explore the possibility of Rab9-related gene therapy for neurodegenerative diseases, we packed lentivirus encoding Rab9 cDNA. The expressing plasmid pCDH1-MCF1-Rab9-EF1-copGFP was constructed by using molecular biological techniques. The lentivirus encoding Rab9 cDNA was packed by Lifectamine-2000 mediated co-transfection of the plasmid pPACKH1-GAG, pPACKH1-REV and pVSV-G into 293T cells. DNA sequencing proved the successful construction of pCDH1-MCF1-Rab9-EF1-copGFP. After 72 h, the expression of GFP could be detected in BV-2 cells. Western blotting revealed that the Rab9 gene expression in BALB/c mice brain was up-regulated significantly 4 weeks after injection with lentivirus encoding Rab9 cDNA, which evidenced a satisfactory increasing effect of this virus. Administration of lenti-Rab9 to postnatal day 3 Niemann-Pick disease type C (NPC) mice reduced motor defects and prevented the weight loss associated with female NPC mice, as well as modulated the death rate of Purkinje neurons. It is concluded that the packaging of lentivirus encoding Rab9 cDNA was successful. lentivirus encoding Rab9 can increase the expression of Rab9 cDNA gene effectively, which might offer a novel means for the treatment of neurodegenerative diseases.     

原发性肝癌基质金属蛋白酶-9的表达与肿瘤侵袭关系

目的 探讨基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在原发性肝癌中的表达及其与肝癌侵袭的关系。方法 采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测比较28例肝癌组织和癌旁组织中MMP-9基因的表达水平。结果 MMP-9 mRNA在肝癌组织中存在过度表达，显著高于癌旁组织（P〈0．01）；伴有门静脉癌栓的肝癌组织中MMP-9mRNA表达值显著高于不伴有门静脉癌栓者（P〈0．01），MMP-9mRNA与术前AFP、肿瘤大小、TNM分期等无关。结论 MMP-9基因的过度表达与肝癌的侵袭密切相关，可以作为预后判断指标。     

NES1基因在肝细胞肝癌中的表达及临床意义

目的探讨NES1基因在HCC发生发展中的作用及意义。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测30例HCC患者癌组织、癌旁肝组织以及10例正常肝组织中NES1mRNA表达情况。结果NES1mRNA在HCC组织中的表达水平显著低于在癌旁肝组织和正常肝组织中的表达水平;NES1mRNA的表达水平与肿瘤大小、肿瘤数为单个或多个、脉管癌栓及临床分期均呈负相关性(P<0.05)。结论NES1mRNA的低表达或表达缺失可能与肝细胞肝癌的发生、发展密切相关;NES1在HCC的发生发展中具有重要地位。     

二胺氧化酶在肝癌组织中的基因表达

目的:探讨二胺氧化酶(DAO)在人类原发性肝癌组织中基因表达。方法:应用半定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测22例人类正常肝脏组织、36例人原发性肝癌旁组织和36例人原发性肝癌组织新鲜标本中基因mRNA的表达情况。结果:在肝癌组织中DAO基因呈高表达。结论:肝脏中DAO基因表达随肿瘤的发展而变化。     

大鼠血栓调节蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的研究大鼠血栓调节蛋白基因的扩增、克隆及在原核细胞中的表达。方法以大鼠基因组DNA为模板,进行PCR扩增,用pMD18-Tsimple vector进行T克隆并测序。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,将目的基因克隆到pET-28a(+)表达载体质粒中,转化E.coliBL21(DE3)表达重组蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物。结果含有大鼠血栓调节蛋白基因的PCR产物约为1850bp。重组pMD18-Tsimple vector质粒和重组pET-28a(+)质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,有相应大小的目的片段,测序结果正确。经IPTG诱导,重组pET-28a(+)质粒在E.coliBL21(DE3)中有相对分子质量约为72000的融合蛋白表达。结论成功克隆了大鼠血栓调节蛋白基因,并成功表达了该基因编码的蛋白。     

肝癌组织中基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9和血管内皮生长因子的表达及临床意义

目的 探讨基质金属蛋白酶2（ MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和血管内皮生长因子（VEGF）在肝癌组织中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组化SP法检测80例肝癌组织中MMP-2、MMP-9和VEGF表达情况,并以30例正常肝组织作为对照.结果 肝癌组织中MMP-2、MMP-9和VEGF表达均显著高于正常肝组织（x2=8.752,7.951,6.812,均P＜0.05）.肝癌患者中Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移患者的MMP-2、MMP-9和VEGF阳性表达率分别高于Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移患者（x2 =6.124,5.262,5.834,5.653,5.932,6.785,均P＜0.05）.结论 肝癌组织中MMP-2、MMP-9和VEGF的表达水平明显升高,它们在肝癌的浸润转移中起到了重要的作用,可作为反映肝癌进展的生物学指标.     

Nucleophosmin基因表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的克隆Nucleophosmin(NPM)的编码序列,构建含Nucleophosmin基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌多药耐药中的作用奠定基础。方法根据已发表的Nucleophosmin基因的核苷酸序列设计合成一对引物,以人乳腺癌组织抽提的RNA为模板进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,用限制性内切酶酶切重组质粒pEGFP/NPM和DNA序列测定进行鉴定。用脂质体法将pEGFP/NPM导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组织化学法和RT-PCR鉴定其表达。结果 RT-PCR扩增出长894bp的特异性片段,经克隆至pEGFP-N1后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致。pEGFP/NPM在HepG2细胞中有稳定表达。结论成功克隆了NPM的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pEGFP/NPM/1,有助于对NPM基因在肝癌多药耐药中的机制做进一步研究。