检测痕量DNA CYP17基因MspA1I多态性方法探讨

目的建立一种有效的检测痕量DNA细胞色素P45017α酶基因MspA1I多态性的方法。方法利用自行设计引物扩增短DNA片段(208bp)，替代扩增长DNA片段(459bp)的Garey法，检测痕量模板DNA的CYP17基因多态性。结果得到了稳定的、重复性良好的目的DNA片段，使MspA1I多态性分型简便，易行。结论提示可将扩增的短DNA片段替代长DNA片段的原理和方法推广应用于其他痕量DNA多态性分型。     

南方鲇16S rRNA基因扩增片段的RFLP研究

目的分析南方鲇不同地理种群16S rRNA基因扩增片段多态性.方法利用PCR技术扩增获得南方鲇(Silurus meridionalis)线粒体DNA 16S rRNA基因片段,并用10种限制性内切酶酶切.结果 Hind Ⅲ、MspⅠ、DraⅠ、TaqⅠ、Hae Ⅲ在该片段上有限制性位点,但只有Hae Ⅲ在野生种群和养殖品种之间表现限制性片段长度多态性.结论不同野生地理种群间不存在限制性片段长度多态性,养殖品种与各野生种群间在该基因片段上存在一定程度的多态性变异.     

影响PCR-RFLP的相关因素

限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction, PCR-RFLP)是一种模拟体内DNA复制过程的体外酶促合成特异性核苷酸片段技术,又称无细胞分子克隆技术.它以待扩增的两条DNA链为模板,由一对人工合成的寡核苷酸作为介导,通过DNA聚合酶反应,在体外进行特异DNA序列扩增.扩增后,将PCR产物直接酶切、电泳、显色,即可对目的基因进行分类分型.现将我做PCR-RFLP的体会简要陈述如下.     

一种高效扩增小片段DNA方法的建立

目的建立一种高效扩增小片段DNA的方法。方法 本方法利用单链DNA连接酶(single strand DNA ligase,ssDNA ligase)可以连接单链DNA的性质将小片段DNA自连成环,随后利用phi29DNA聚合酶进行恒温的滚环复制,将扩增产物进行酶切,得到了扩增后的小片段DNA。结果 单链DNA连接酶可以有效的将30bp的小片段DNA自连成环,phi29DNA聚合酶可以扩增出大于10kb的DNA片段,扩增产物经酶切后又可进行第二轮扩增,并且证明了其成环方式为自成环。结论 通过单链成环后滚环复制的这种方法可以有效的将小片段DNA进行扩增,解决了PCR无法扩增小片段DNA的问题,并有着广阔的应用前景。     

小词典

为方便阅读玄将本期新引用的常用规范缩略语按字母顺序汇集于下,以供参考。AFLP amplified fragment length polymorphie扩PHLA postheparin lipolytie aetivity肝素注射后 增片段长度多态性的脂质分解活力HA hemagglutinin血凝素RApD randomly amplified polymorphie DNA随LCAT Ieeithin eholesterol aeylrransferase卵磷机扩增多态性DNA 脂胆固醇酞基转移酶RFLp restrietion fragment length polymorphismNA neuraminidase神经氛酸酶限制性片段长度多态性Np nueleoprotein核蛋白UTp uridine triphosphate尿普三磷酸pCR poly…     

DNA分子标记在实验动物遗传分析中的应用

DNA分子标记技术很多,基本都是建立在RFLP、PCR和重复顺序的基础上的。本文重点介绍了限制性片段长度多态性（RFLP）标记、随机扩增多态性DNA（RAPD）标记、微卫星DNA（STR）标记、DNA指纹（DFP）标记、扩增片段长度多态性（AFLP）标记等几种重要的DNA分子标记技术的定义、结构、分布、组成、保守性、优点及丰富的多态性等。并重点介绍了微卫星DNA（STR）标记在分子遗传监测、遗传多样性分析和遗传血缘关系及个体识别等领域的应用。     

用PCR技术同时检测微量血痕的种属来源及其DNA多态性

应用聚合酶链反应技术扩增血痕DNA,根据扩增产物中有无aPoB基因的数量可变重复序列(VNTR)及其扩增片段的大小即可同时确定其种属特异性和DNA的多态性。实验结果显示人血痕可见扩增带并具有多态性,而猴猪狗猫鸡血痕无扩增带。     

苯妥英钠代谢酶CYP2C9、CYP2C19基因多态性的分析

目的研究药物代谢酶基因多态性对苯妥英钠代谢的影响,并建立分析苯妥英钠代谢酶中CYP2C9、CYP2C19基因多态性的方法。方法从人全血中抽取DNA,设计引物扩增CYP2C9及CYP2C19,并运用限制性片段长度多态性（RFLP）技术的方法进行CYP2C9及CYP2C19的基因分型。结果成功设计了引物用来扩增CYP2C9及CYP2C19的基因片段,并测序验证。结论建立了简单可靠的CYP2C9及CYP2C19的RFLP基因分型方法。     

HPC2基因与宫颈癌关系的研究

目的: 研究宫颈癌的发生与HPC2基因的关系. 方法: 利用PCR方法,以宫颈癌组织和Hela细胞基因组DNA为模板扩增人HPC2基因片段,将此基因片段插入pGEM-Teasy 载体,限制性内切酶酶切鉴定,测定序列. 结果: 从宫颈癌组织和Hela细胞中成功扩增了HPC2基因,Blast分析发现其C端一段保守序列具有多态性. 结论: 该位点可能与宫颈癌的发生有关.     

应用DNA分析技术早期证明异基因外周血造血干细胞移植成功

用异基因外周血造血干细胞移植(allo-PBSCT)的方法治疗白血病,正被用以取代骨髓移植。但在施行移植后如何尽早判断移植是否成功,对决定进一步治疗方案至关重要,人类DNA具有高度的遗传多态性,利用特异已知序列的DNA片段与目的DNA杂交所得到的DNA指纹图谱具有高度的个体特异性;而多聚酶链式反应(PCR)技术则是利用靶DNA序列侧翼上所结合的两个寡核苷酸引物经体外酶促合成特异DNA片段,笔者利用较为优秀的D_1S_(80)、D_1S_(111)、apoB及HUMTH01 4个位点的扩增片段长度多态性检测和最新研制的JL-02探针杂交所得的DNA指纹图技术对1例行allo-PBSCT患者的血液在移植后13天进行DNA分型检测,得到了确定其移植是否成功的明确结论,现报道如下。     

原发性肝癌转化基因的RFLP研究(Ⅲ)

以原发性肝癌组织DNA以及作为对照的正常人白细胞DNA和人工流产胎儿绒毛DNA为材料,应用5′侧和3′侧两种N-ras探针以及c-sis探针,通过Southern吸印杂交探查其对特定限制酶的限制性片段长度多态性。结果未发现人癌基因N-ras对限制酶Bam HⅠ、PstⅠ、MspⅠ以及人癌基因c-sis对限制酶Eco RⅠ、HaeⅢ的限制性片段长度多态性;但发现人癌基因c-sis对限制酶Hind Ⅲ、SacⅠ、PstⅠ、PvuⅢ、MspⅠ等都有限制性片段长度多态性。这些等位片段可为进一步结合家系分析,探查致癌的家族素因以及肿瘤的遗传易感性研究中寻找遗传标记提供基础。     

基因分型在假丝酵母菌研究中的应用

近年来临床上假丝酵母菌属感染的发生率逐年上升,尤其是白假丝酵母菌.基因分型技术因便捷、分辨率高和重复性强被广泛应用,成为假丝酵母菌有效的流行病学研究工具.目前基因分型方法主要包括多位点酶电泳、DNA指纹图谱技术(如限制性片段长度多态性技术、随机引物扩增多态性DNA)、脉冲电场凝胶电泳以及单链构象多态性分析、微卫星标记技术和多位点序列分析等新兴技术.文章就目前主要基因分型方法及其在假丝酵母菌研究中的应用进行综述.     

基因分型在假丝酵母菌研究中的应用

近年来临床上假丝酵母菌属感染的发生率逐年上升,尤其是白假丝酵母菌.基因分型技术因便捷、分辨率高和重复性强被广泛应用,成为假丝酵母菌有效的流行病学研究工具.目前基因分型方法主要包括多位点酶电泳、DNA指纹图谱技术(如限制性片段长度多态性技术、随机引物扩增多态性DNA)、脉冲电场凝胶电泳以及单链构象多态性分析、微卫星标记技术和多位点序列分析等新兴技术.文章就目前主要基因分型方法及其在假丝酵母菌研究中的应用进行综述.     

MDA在PCR-RFLP基因分型中的实用性

目的:评估多重置换扩增(MDA)在聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)基因分型中的实用性.方法:用MDA法对50例样本进行了全基因组扩增,并用扩增后的DNA作为模板,对两个单核苷酸多态性(SNP)进行了PCR-RFLP基因分型.结果:对于所检测的两个SNP,以经MDA扩增的基因组DNA为模板,与未经MDA扩增的基因组DNA为模板进行的PCR-RFLP基因分型,结果完全一致.结论:MDA可用于PCR-RFLP等遗传分析.     

不同薯蓣皂苷元的盾叶薯蓣遗传关系的RAPD分析

目的从DNA水平分析鉴定不同薯蓣皂苷元盾叶薯蓣的遗传关系。方法从40个10 bp随机引物中筛选出12个引物,进行RAPD分析,应用POPGENE 1.31软件对扩增结果进行聚类分析。结果共扩增出73条DNA片段,其中多态性片段64条,占87.67%,盾叶薯蓣类型间具有明显的多态性差异。结论DNA分子多样性差异与薯蓣皂苷元量差异具有相关性,说明盾叶薯蓣的遗传基础可能对薯蓣皂苷元的形成和积累有显著的影响。     

HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法的建立

目的建立一种简便、准确、实用的乙型肝炎病毒(HBV)耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法.方法根据已公布的HBV DNA序列,在HBV多聚酶基因区设计并合成了两对寡核苷酸引物,其中一只为错配引物;应用巢式错配聚合酶链反应特异性扩增含有HBV多聚酶基因YMDD基序的片段,扩增产物用限制性内切酶(Nde Ⅰ)酶切,琼脂糖凝胶电泳,观察酶切后的目的片段限制性片段长度多态性(RFLP)图谱.部分标本进行DNA测序.结果 (1)所建立的巢式错配PCR-RFLP方法操作简便,快速,从DNA提取到酶切后电泳分析仅需要11小时;灵敏度高,可以检测到103copies/ml的HBV DNA;特异性强,结果准确,经DNA测序证实.(2)应用该方法对20例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者的系列血清进行了检测,发现YMDD变异者(45%)9例,YMDD野毒株者(55%)11例,表明该方法可有效地鉴别HBV YMDD野毒株与变异株.结论本实验所建立的巢式错配PCR-RFLP方法简单、敏感、特异,适合于一般实验室应用及大规模的人群调查.     

碱裂解法快速提取口腔拭子DNA对CHRNA3基因多态性的研究

目的建立一种快速的从口腔拭子中提取DNA的方法,研究其在尼古丁乙酰胆碱受体α3(CHRNA3)基因多态性分析中的应用。方法以NaOH和乙二胺四乙酸(EDTA)配制碱裂解液,以三羟甲基氨基甲烷-EDTA(TE)为中和液,经加热裂解和中和两步提取口腔拭子DNA。以提取的DNA为模板,用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析对CHRNA3基因的rs6495309进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果 PCR扩增和酶切的靶带清晰,无非特异性条带。酶切结果与测序结果吻合。结论碱裂解法提取口腔拭子DNA具有快速、简便、经济、可靠的特点,可以用于CHRNA3基因多态性的分析。     

创造酶切位点PCR-RFLP检测PON2(rs12026)基因多态性

目的:建立简便易用的PON2基因单核苷酸多态(rs12026)的检测方法。方法:应用创造酶切位点原理设计引物,通过PCR-RFLP技术判断PON2基因SNP位点多态性。结果:设计一对特异引物并PCR扩增含PON2多态位点的DNA片段,根据限制性内切酶BsmAI酶切结果判断PON2位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论:应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的PON2多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。     

单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性

目的:建立了一种单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性(SNP).方法:以TYP基因外显子1上的3个SNP位点(71G>A、425A>T和758G>A)为例,首先采用PCR预扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;然后用限制性内切酶将其消化成短片段,在连接酶的作用下与设计的DNA适配器相连;以此连接产物为模板,在单个PCR管中加入一种适配器特异性通用引物和所有等位基因特异性引物进行PCR扩增;最后用琼脂糖凝胶电泳法分离检测PCR扩增产物,并根据扩增片段的大小判断SNP的类型.结果:采用该法成功测定了30名健康中国人的TYP基因中的3个SNP位点,与限制性片段长度多态性法(RFLP)测定结果完全一致.结论:该方法特异性高、结果准确、检测成本低,可用于同时测定多个SNP位点.     

延吉市土壤中分离的棘阿米巴CJY/S3线粒体DNA限制性片段长度多态性

[目的]观察棘阿米巴土壤分离株CJY/S3的线粒体DNA限制性片段长度多态性.[方法]从棘阿米巴CJY/S3提取线粒体DNA,用EcoRI进行酶切,与广东地区土壤分离株CG/S1进行比较观察限制性片段长度多态性.[结果]延吉市土壤分离株CJY/S3与广东地区土壤分离株CG/S1具有相同的片段模式.[结论]延吉市棘阿米巴土壤分离株CJY/S3与CG/S1具有密切的亲缘关系,而线粒体DNA限制性片段长度多态性分析是棘阿米巴分类简便且有效的方法.