鸟分支杆菌聚合酶链反应检测的研究

目的 建立敏感性高、特异性强的快速检测鸟分支杆菌的方法.方法 用特异性引物对连续稀释的鸟分支杆菌菌悬液DNA进行PCR扩增,验证其敏感性;并用该引物对除鸟分支杆菌外的其他17株分支杆菌DNA进行扩增,验证其特异性;将正常皮肤组织与鸟分支杆菌的菌悬液混合以模拟临床皮肤感染标本,初步探讨适宜的临床标本前处理的方法,以提高PCR方法在检测临床皮肤组织感染中的敏感性.结果 PCR方法可扩增427bp的鸟分支杆菌DNA片段,敏感性达1×10²个菌细胞/mL,对其他分支杆菌进行扩增,结果均为阴性.对模拟临床皮肤感染标本进行PCR检测,敏感性降低为1×10⁴个菌细胞/mL;将组织匀浆连续倍比稀释后,再加入细菌悬液,结果当组织匀浆稀释度≥1:4时,PCR的敏感性提高到1×10²个菌细胞/mL.结论 PCR方法能敏感、特异地快速检测鸟分支杆菌.     

皮肤分枝杆菌感染微孔板反向杂交检测法的研究

目的 探讨微孔板反向分子杂交技术与PCR-ELISA相结合的“拟芯片”法检测和鉴定几种常见的皮肤分枝杆菌感染的方法。方法 首先对5种分枝杆菌标准菌株(结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和偶遇分枝杆菌)16s rRNA DNA进行PCR扩增获得其PCR产物:其次对"拟芯片"法反应条件进行优化;并对其敏感性、特异性进行检测;再用建立的方法对9例临床分离株进行检测和鉴定。结果 "拟芯片"法反应条件优化结果为:探针包被浓度为100 nmol/mL,探针包被时间为15 min,杂交的温度为55℃,杂交时间为45 min,辣根过氧化物酶标记的亲和素的稀释度为1:800;"拟芯片"法敏感性为1×10¹～1×10²个菌细胞/mL;特异性较好,各菌探针与其他分枝杆菌间无交叉。结论 "拟芯片"法是快速、敏感及特异的皮肤分枝杆菌感染诊断方法之一。     

四种分枝杆菌快速检测方法的研究

目的 建立敏感、特异的快速检测4种分枝杆菌的方法。方法 用特异性引物对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌菌悬液DNA进行PCR扩增,验证其敏感性和特异性。将上述4种分枝杆菌的特异性引物同时放入PCR扩增反应体系中,以此反应体系分别对该4种分枝杆菌菌悬液DNA、及其两两组合或特定的三重组合进行扩增,同时验证其敏感性。结果 4种分枝杆菌的特异性引物分别放入各自的PCR扩增反应体系中,可分别特异性地扩增出该4种分枝杆菌对应的DNA片段,敏感性达1×10¹～1×10²个菌细胞/mL。4种分枝杆菌的特异性引物同时放入同一PCR扩增反应体系中可分别特异性地扩增出对应的4种分枝杆菌单菌及其两两组合或三种分枝杆菌组合的DNA片段,敏感性达1×10²～1×10³个菌细胞/mL;4种分枝杆菌的特异性引物对其他分枝杆菌进行扩增,结果均为阴性。结论 多重PCR方法能敏感、特异地快速检测4种分枝杆菌。     

生殖器疱疹患者病毒DNA的定量测定研究

目的 对生殖器疱疹病毒(HSV)患者病毒DNA进行定量测定.方法 以标准的HSV质粒作为标准,用聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA),定量测定HSVDNA.结果 100例生殖器疱疹患者中93例HSV测定阳性,7例阴性.在93例阳性者中有58例为HSV-2(占62.4%),35例为HSV-1(占37.6%).93例阳性者定量测定结果,250μL标本混悬液中DNA质粒数为115～1.1×10⁵个,平均7.1×10⁴个;58例HSV-2阳性者,250μL标本悬液DNA质粒数为136～1.1×10⁵个,平均7.6×10⁴个;35例HSV-1阳性者DNA质粒数为115～9.4×10⁴个,平均6.3×10⁴个.分别随机取HSV-2和HSV-1阳性患者各8例已淬取和纯化的DNA混悬液10μL,定量测定结果显示:HSV-2患者最高为2.7×10⁴个DNA质粒数,最低35个,平均1.8×10⁴个.HSV-1最高2.5×10⁴个,最低29个,平均1.6×10⁴个.结论 所用几种检测法中ELISA定量总阳性率为93%,与DNA印迹法阳性率相同.诊断PCR阳性率为91%,HSV分型PCR阳性率为88%.     

PCR-RFLP分析鉴定皮肤组织中的分枝杆菌

目的 探讨用PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法快速检测皮肤感染性肉芽肿组织中分枝杆菌。方法 皮肤感染性肉芽肿患者组织标本9份.提取组织DNA,进行PCR扩增,PCR产物分别用BstEⅡ和HaeⅢ2种限制性内切酶进行酶切,3%Nusieve 3:1琼脂糖凝胶电泳,进行限制性片段长度多态性分析,并与培养结果进行比较。结果 从5份临床诊断为游泳池肉芽肿的组织标本中检测出海分枝杆菌,从另4份诊断为皮肤感染性肉芽肿的标本中检测出2份结核分枝杆菌和2份脓肿分枝杆菌,此9份结果与培养鉴定结果完全一致。结论 用PCR-RFLP方法可以快速鉴定皮肤感染性肉芽肿组织中的分枝杆菌。     

PCR在阴道毛滴虫检测中的引物筛选和条件优化

目的 探讨PCR检测阴道毛滴虫的引物筛选和条件优化。方法 从文献中筛选TVA5-TVA6、TV1-TV2、TVK3-TVK73对引物进行比较,每种PCR对引物、Mg²⁺、dNTPs、Taq酶4个因素,每个因素取3个浓度水平,使用Taguchi法进行优化,筛选出每种PCR的较佳反应条件。在较佳反应条件下,比较3种PCR的敏感性。用培养法及PCR法检测阴道拭子标本,初步评价敏感性最高的PCR方法。结果 3种PCR法均具有较高的特异性,TVK3-TVK7PCR的敏感性最高。25份临床拭子标本中,培养法检测出7份阳性标本,TVK3-TVK7PCR方法检测出8份,所有培养法检测阳性的标本经PCR方法检测的结果均为阳性。结论 TVK3-TVK7PCR具有高度敏感性和特异性,是一种检测阴道毛滴虫感染的有效方法。     

HIV/AIDS患者口咽部念珠菌病与CD4+、CD8+T淋巴细胞分析

目的 研究HIV/AIDS患者的口咽部念珠菌病的发病特点,CD4⁺计数、CD8⁺计数、CD4⁺/CD8⁺比值的分布特点,以及抗真菌治疗的特点。方法 观察20例合并口咽部念珠菌病的HIV/AIDS患者和对照组口腔病损情况,病损部行真菌镜检和真菌培养,外周血流式细胞仪检测CD4⁺、CD8⁺计数。研究组和对照组伊曲康唑治疗第1周、第2周、疗程结束时、停药后两周真菌学疗效比较。结果 19例为白念珠菌感染,1例为近平滑念珠菌感染。20例艾滋病患者可见舌部感染6例,口腔侧壁感染14例。CD4⁺、CD8⁺计数和CD4⁺/CD8⁺比值分别在119.40±127.43、652.50±338.57和0.163±0.130范围。伊曲康唑治疗HIV/AIDS组第1周、第2周、疗程结束时、停药后两周真菌清除率分别为16.67%、50.00%、61.11%、66.67%。结论 HIV/AIDS患者口咽部念珠菌感染的最常见致病菌是白念珠菌,最常见靶部位是舌和口腔侧壁。HIV/AIDS患者的口咽部念珠菌病抗真菌疗效与免疫状态有关。     

卡泊三醇、维A酸及雷公藤内酯醇对角质形成细胞及COLO16细胞中血管内皮生长因子生成的影响

目的 探讨卡泊三醇、维A酸及雷公藤内酯醇对角质形成细胞及COLO16细胞中血管内皮生长因子(VEGF)生成的影响.方法 采用RT-PCR法检测原代培养的人角质形成细胞及COLO16细胞中VEGFmRNA的水平.结果 卡泊三醇作用于正常人角质形成细胞4h和24h后,以及作用COLO16细胞24h后,均可抑制VEGFmRNA的表达,呈剂量依赖性,IC₅₀值分别为1.19×10^-4μg/mL、1.51×10^-4μg/mL和3.16×10^-5μg/mL.维A酸作用于正常人角质形成细胞4h后可抑制VEGFmRNA的表达,作用于正常角质形成细胞24h后及作用于COLO16细胞4h和24h均无抑制作用.雷公藤内酯醇对正常角质形成细胞和COLO16细胞中VEGFmRNA表达均无抑制作用.结论 在转录水平抑制VEGF生成可能是维A酸与卡泊三醇抗银屑病的作用机制之一.     

蕈样肉芽肿皮损中增生性T细胞与树突细胞的研究

目的 探讨蕈样肉芽肿(MF)不同时期浸润性皮损中增生性T细胞与树突细胞的分布特征。方法 皮肤肿瘤组织石蜡切片,单克隆抗体免疫组化染色。结果 MF皮损中Ki-67⁺细胞和皮肤淋巴细胞相关抗原阳性(CLA⁺)细胞均明显增多,多数Ki-67⁺细胞CD4⁺和cLA⁺,MF肿瘤期真皮浸润组织中的Ki-67⁺细胞明显多于斑片期/斑块期(P<0.01),且形态多不规则,异型性明显;未见CD83⁺/Ki-67⁺树突细胞,但树突细胞周围可见大量的Ki-67⁺增生性T细胞,CD83⁺树突细胞与Ki-67⁺肿瘤T细胞紧密接触。结论 CLA⁺/Ki-67⁺T细胞在MF皮损中表达的程度和免疫病理特征对于MF的早期发现和转化进展可能具有免疫病理学诊断意义。     

疑似深部真菌感染患者血中(1→3)β-D-葡聚糖的检测

目的 探讨疑似深部真菌感染患者血中(1→3)-β-D-葡聚糖的浓度与感染的关系。方法 采用日本生化学工业株式会社的(1→3)-β-D-葡聚糖测定G-testTE试剂盒检测了13例患者血浆中的(1→3)-β-D-葡聚糖的含量,以UV-2450紫外可见光分光光度仪检测波长545nm的吸光度值,根据特定检测浓度换算公式得出标本的(1→3)-β-D-葡聚糖含量。结果 13例被检测患者中9例经培养证实为深部真菌感染者血浆的β-D-葡聚糖含量皆较高,最高者可达352.94pg/mL(为真菌混合感染患者),平均可达203.47pg/mL;4例真菌培养阴性患者血浆β-D-葡聚糖水平,3例超过54.40pg/mL,1例为16.16pg/mL。所有标本采用UV-2450紫外可见光分光光度仪在波长545nm检测,皆可出现较明显的吸收峰。采用GtestTE试剂盒检测13例疑似深部真菌感染患者血浆的β-D-葡聚糖含量,分析诊断深部真菌感染的有效性,结果其敏感度为92.31%,特异度100%,阳性预测值100%,阴性预测值为98.36%。结论 GtestTE方法简便,反应快速,可用于真菌感染的早期诊断。     

系统性红斑狼疮患者CD1a、CD68、HLA-DR等的研究

目的 研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外观正常及病变皮肤中朗格汉斯细胞(LC)一些重要表面标志的变化。方法 应用CD1a、CD68和HLA-DR等单克隆抗体和ABC免疫组化技术对9例SLE患者外观正常和皮损部位的组织进行了免疫表型检测。结果 ①SLE皮损中LC的数量减少,且其形态与表面标志亦有变化;②SLE病损处的角质形成细胞(KC)强弱不等地表达HLA-DR抗原,个别病例的外观正常皮肤KC也可局灶性表达HLA-DR抗原;③SLE外观正常皮肤或皮损的表皮中均未见细胞间粘附分子1和CD4阳性LC,仅在真皮的浸润细胞中见到较多的阳性细胞;④发现在SLE外观正常皮肤和皮损表皮内出现两类CD68阳性的树枝状细胞;在SLE皮损的浸润细胞中CD68阳性树枝状细胞大量增加;⑤细纤维状CD68阳性物质呈网状围绕基底部的KC,这些细纤维状阳性物质有些与表皮树枝状细胞相连,有些则没有明显的关系。结论 SLE外观正常和病变皮肤中LC一些重要表面标志的变化有所不同。外观正常皮肤和皮损表皮内出现两类树枝状细胞,一类可能为LC,而另一类则来源不清;在SLE皮损的浸润细胞中这些CD68阳性树枝状细胞大量增加,表皮内存在CD68阳性纤维状染色,其意义尚需进一步研究。     

成人正常皮肤CD68阳性单核-巨噬细胞分布的研究

目的 观察正常真皮内CD68阳性单核-巨噬细胞的分布、形态和密度。方法 正常成人8例,每例均取面部、躯干、四肢近端、四肢远端、手掌和足跖6个部位皮肤进行表皮铺片和纵行与水平连续切片。CD68单克隆抗体染色,观察单核-巨噬细胞的分布。结果 真皮浅层CD68阳性细胞可表现为树枝状及非树枝状,呈网状分布。真皮浅层CD68阳性细胞密度为:四肢远端(562±230)个/mm²,腹部(517±162)个/mm²,面部(509±235)个/mm²,手掌(507±192)个/mm²,四肢近端(472±138)个/mm²,足跖(361±78)个/mm²。真皮深层CD68阳性细胞密度低,多为树枝状,散在于胶原纤维间。结论 CD68阳性单核-巨噬细胞在真皮浅层形成较致密网状分布。提示单核-巨噬细胞在真皮内有明确的方向性,其防御的方向是穿透表皮进入真皮的入侵物。     

脓肿分枝杆菌致全身播散性皮肤感染一例

目的 报道1例罕见的全身播散性脓肿分枝杆菌皮肤感染.方法 对患者作全面临床检查.应用流式细胞仪检测患者细胞免疫水平,同时进行组织病理检查、组织培养.用PCR-RFIJP、基因测序方法对分离自患者皮损的分枝杆菌做鉴定.结果 患者女,22岁,1年多前,无明显诱因面颈部出现对称性红斑,并在此基础上渐出现丘疹、结节和斑块,逐渐扩展至躯干四肢;患者CD4⁺T细胞低于正常,HIV抗体检测阴性.对皮损进行两次多管体外培养,3～5天后,Löwenstein-Jensen培养基上(37℃和32℃)出现阳性菌落.PCR-RFLP比较分析发现,临床分离株的酶切(BstEⅡ和HaeⅢ)图谱与脓肿分枝杆菌的酶切图谱相符合;对临床分离株的hsp65、16S rRNA基因进行了序列分析,发现该二序列与脓肿分枝杆菌同源性最接近,分别是99.75%和100%.予以患者口服利福平、异烟肼、左氧氟沙星、克拉霉素,胸腺肽肌内注射,2个月后皮损明显好转.复查该患者的免疫状况,CD4⁺T细胞已在正常范围;6个月后颈部、躯干及四肢皮损基本痊愈.结论 结合表型特征、DNA酶切图谱和序列分析,临床分离株符合脓肿分枝杆菌;抗生素联合化疗辅以免疫调节剂综合治疗有效.     

寻常型银屑病皮肤中皮肤归巢T细胞免疫组化研究

目的 探讨皮肤归巢T细胞在寻常型银屑病(PV)发病中的作用。方法 采用间接免疫荧光双标法研究正常人皮肤和PV患者皮肤中浸润的皮肤归巢T细胞分类及其变化。结果 ①正常人皮肤及PV皮损中浸润的T细胞绝大多数表达皮肤淋巴细胞相关抗原(CLA),CLA⁺细胞高度表达CD45RO,只有个别为CD45RO阴性。②进行期皮损CD4⁺CLA⁺及CD8⁺CLA⁺T细胞数高于静止期皮损(P<0.05),静止期皮损CD4⁺CLA⁺细胞数高于消退期皮损(P<0.05),消退期皮损CD8+CLA+细胞数高于PV外观正常皮肤(P<0.05),进行期皮损周边外观正常皮肤CD4⁺CLA⁺及CD8⁺CLA⁺细胞数高于静止期皮损周边外观正常皮肤(P<0.05).③部分病例皮损的表皮中见大量CLA⁺树突状细胞,正常人皮肤未见此细胞。结论 正常人皮肤及PV皮损中T细胞绝大多数为皮肤归巢T细胞;进行期及静止期PV皮损中浸润的细胞主要为CD3⁺、CD4⁺、CD45RO⁺、CLA⁺T细胞,CD3⁺、CD4⁺、CD45RO⁺、CLA⁺T细胞可能在PV发病中起重要作用。     

银屑病患者骨髓CD34+细胞体外定向分化的T细胞活性研究

目的 研究有家族发病倾向的银屑病患者骨髓CD34⁺细胞体外定向发育的T细胞活性.方法 免疫磁珠法分离家族史阳性银屑病患者及正常对照骨髓CD34⁺细胞,在骨髓基质细胞条件培养液构建的微环境下,在胸腺基质细胞的支持下,使其在体外向T细胞定向分化,免疫磁珠法收集CD3⁺T细胞,流式细胞仪检测CD4⁺CD8^-细胞及CD4^-CD8⁺细胞比例.分别采用MTT法及ELISA法检测自然增殖组及链球菌超抗原刺激后T细胞增殖活性及分泌细胞因子水平.结果 ①经骨髓CD34⁺细胞定向分化并扩增的CD3⁺T细胞中可检测到CD4⁺CD8^-、CD4^-CD8⁺T细胞,且银屑病患者组与正常对照组CD4⁺CD8^-及CD4^-CD8⁺T细胞比例无显著差异.②银屑病患者骨髓CD34⁺细胞定向分化的T细胞自然增殖组及链球菌超抗原刺激组增殖活性均显著高于正常人对照组.③银屑病患者T细胞自然增殖组培养上清白介素4、白介素8及干扰素γ与正常对照组差异无统计学意义,链球菌超抗原刺激后白介素4表达水平无显著改变,而白介素8及干扰素γ水平却显著高于正常人.结论 有家族发病倾向的银屑病患者外周血T细胞活性异常可能与骨髓造血细胞相关.