苯并（a）芘作用下人支气管上皮细胞蛋白表达谱的改变

[目的]观察苯并（a）芘（BaP）作用下人支气管上皮细胞（16HBE）蛋白表达谱的改变。[方法]以0、1、2、4、8、16、32、64um01／L的BaP染毒细胞24h,应用双向凝胶电泳和ImageMaster软件分析BaP处理后细胞内蛋白质表达谱的改变,基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF）结合数据库检索鉴定差异表达蛋白质斑点。[结果]各浓度染毒组与对照组相比,成功鉴定了17个差异表达蛋白质斑点,其中表达上调的有9种,下调的有8种。这些蛋白质包括细胞骨架蛋白、与能量代谢有关的蛋白、与DNA损伤修复有关的蛋白、肿瘤标志物、伴侣蛋白、与信号转导有关的蛋白和与氧化应激有关的蛋白。[结论]BaP作用于16HBE后导致与细胞损伤、DNA修复、应激、细胞恶性转化等有关的蛋白质表达发生改变。     

反式BPDE诱发的转化细胞与成瘤细胞FHIT基因变化研究

目的:探讨苯并(a)芘[B(a)P]代谢产物反式二氢二醇环氧苯并芘[anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxidebenzo(a)pyrene,BPDE]引起的细胞FHIT基因突变情况。方法:PCR、RT-PCR、多聚酶链聚合反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)。结果:PCR-SSCP结果提示反式BPDE诱发的恶性转化细胞及其裸鼠成瘤细胞FHIT基因的Exon1-9出现了异常的小片断。结论:反式BPDE可作用于细胞染色体3p14.2的脆性部位FRA3B,引起FHIT基因的重排或缺失,导致FHIT基因功能失活。推测FHIT基因可能是反式BPDE致癌作用的靶分子之一。     

Ras基因家族在二羟环氧苯并(a)芘恶性转化细胞中的表达研究

目的检测环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞Ras基因家族表达的影响。方法以正常人支气管上皮细胞为对照组,经BPDE恶性转化人支气管上皮细胞为实验组,分别利用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学方法,检测Ras基因家族在mRNA和蛋白水平表达变化。结果RT-PCR实验表明,BPDE恶性转化细胞H-Ras、K-Ras和N-Ras mRNA表达水平分别是正常细胞的2.237、1.254和3.616;Western blot实验显示,H-Ras、K-Ras和N-Ras蛋白表达量分别是正常细胞的1.273倍、1.547和1.600倍;免疫细胞化学实验表明,恶性转化细胞H、K和N-Ras蛋白表达明显强于正常细胞。结论BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在H-Ras、K-Ras和N-Ras基因过表达。     

反式二羟环氧苯并(a)芘所致人支气管上皮细胞POLK基因高表达

目的观察不同剂量反式二羟环氧苯并(a)芘(anti-BPDE)处理对人支气管上皮细胞(16HBE)POLK基因表达的影响。方法分别以0.25、0.50、1.00、2.00μmol/L的反式-BPDE1次或3次处理16HBE细胞,采用TaqmanMGB探针实时定量聚合酶链反应方法相对定量POLK和POLZ基因表达,同时对反式-BPDE转化的16HBE及肺癌H1299细胞POLK基因表达进行了分析。结果反式-BPDE1次处理及3次处理可诱导正常16HBEPOLK基因高表达。反式-BPDE转化16HBE和肺癌H1299细胞POLK基因表达明显增高,分别是正常16HBE的2.25和5.49倍。结论反式-BPDE处理可致16HBEPOLK基因高表达。     

苯并(a)芘致神经元线粒体膜电位和胞质细胞色素C的变化

目的 探讨苯并(a)芘[B(a)P]致神经元凋亡中线粒体膜电位和胞质中细胞色素C(CytC)蛋白变化.方法 选用新生1～3 d的SD大鼠分离大脑皮质进行神经元培养,在细胞培养第5天,选取生长良好的同批次神经细胞,以B(a)P同时加S9分别对神经元染毒,使B(a)P终浓度分别为0、10、20、40 μmol/L.继续培养40 h,应用Annexin V和碘丙啶(PI)双染法进行细胞凋亡的检测,加入Rh123,应用流式细胞仪测定细胞线粒体膜电位,免疫印迹(Western blot)法测定神经元胞质中Cyt C蛋白的表达.结果 随着B(a)P浓度的增加,神经细胞的早期、晚期凋亡率逐渐增高,中、高剂量组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),趋势检验表明,早期凋亡率增高具有剂量依赖性.随B(a)P染毒浓度的增加,神经细胞线粒体膜电位下降,低、中、高剂量组神经细胞膜电位分别为5.02±1.32、4.36±1.26、3.15±1.47,与对照组(8.89±2.18)比较,差异均有统计学意义(P<0.05),线粒体膜电位与早期凋亡率之间呈负相关(r=-0.763,P<0.05);随着B(a)P浓度的增加,胞质中Cyt C蛋白的表达逐渐升高,Cyt C蛋白表达与早期凋亡率间呈正相关(r=0.831,P<0.01).结论 B(a)P可致神经细胞凋亡,线粒体膜电位降低以及Cyt C的释放可能是诱发凋亡的主要因素.     

DEHP与BaP联合诱导Chang liver细胞线粒体 介导细胞凋亡作用

目的 研究邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)与苯并(a)芘(BaP)联合染毒对Chang liver细胞的毒性。方法 DEHP(62.5、125、250、500和1 000 μmol/L)与BaP(64 μmol/L)单独或联合染毒Chang liver细胞24 h,检测细胞活力、细胞内活性氧(ROS)含量、线粒体膜电位(MMP)、细胞凋亡率和Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)以及半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表达量。结果 联合染毒各组细胞存活率均低于DEHP单独染毒组(t=6.22、4.64、6.64、5.84、7.29,P<0.01),但胞内ROS水平均升高(t=4.57、2.23、2.39、2.22、2.16,P<0.05或P<0.01);≥250 μmol/L DEHP与BaP联合染毒组的MMP分别为(80.12±6.41)%、(69.92±5.56)%和(53.76±1.88)%,均低于BaP单独染毒组的(165.93±5.09)%(t=10.92、12.51、14.62,P<0.01);细胞凋亡率分别为(7.73±1.91)%、(11.00±3.04)%和(14.20±3.96)%,均高于BaP单独染毒组的(1.55±0.21)%(t=3.96、6.06、8.11,P<0.01);此外,活化caspase-3的高表达和升高的Bax/Bcl-2比值也被检出。结论 较高浓度DEHP与BaP联合染毒Chang liver细胞促发ROS水平升高和线粒体膜电位降低,并导致了细胞凋亡;Bax、Bcl-2和活化caspase-3参与了此调控过程。     

苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘诱发人支气管上皮细胞恶性转化

以不同浓度的苯并 (a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘 (BPDE)多次处理人支气管上皮细胞 16HBE ,并观察转化细胞的恶性特征。发现BPDE可诱导 16HBE细胞恶性转化 ,形成转化灶。转化灶细胞失去接触抑制 ,排列紊乱 ,无方向性 ,交叉重叠生长。转化的细胞可在软琼脂上生长 ,各浓度处理组细胞集落形成率均显著高于对照组 ,有良好的剂量—反应关系。经BPDE处理的细胞在裸鼠体内成瘤 ,病理学诊断为鳞状细胞癌。本实验以反式BPDE成功地诱发了人支气管上皮细胞恶性转化 ,为后期进一步研究其致癌的分子机制、寻找致癌相关基因提供了理想的生物学材料。     

不同代谢活化系统增强苯并(a)芘诱导人支气管上皮细胞转化效应

目的探讨不同的代谢活化系统在苯并(a)芘[B(a)P]诱导人细胞转化模型中的应用。方法选择人支气管上皮细胞HBETR,采用3种不同的代谢活化方式:分别为加入大鼠S9组分(S9-Mix)、高表达代谢关键酶P450CYP1A1(HBETR-1A1细胞)和染毒前48小时用低剂量B(a)P诱导(HBETR-IN细胞)。通过软琼脂克隆形成试验和裸鼠皮下成瘤试验来比较在不同的代谢活化系统下,间接致癌物B(a)P诱导细胞转化的效能。结果通过蛋白印迹和酶活性检测结果验证HBETR-1A1细胞构建成功。细胞的生物学特性没有明显的改变。20μmol/LB(a)P染毒作用下HBETR-1A1、HBETR-IN细胞出现转化时间均为11周,而未加入活化系统时,HBETR细胞需14周才能获得恶性转化。HBETR细胞在加入和不加入S9-Mix的条件下,转化时间分别是14周、20周。上述转化的效果与CYP1A1酶活性以及蛋白表达水平相一致。结论三种代谢系统都能够促进间接致癌物B(a)P的代谢活化,缩短细胞的转化间期,提高细胞转化效率。从试验操作难度、试验的重复性及结果的可靠性等几个方面比较三种代谢系统应用的可行性,低剂量诱导作为新的代谢活化的方法在细胞转化试验中有着潜在的应用前景。     

锦州水和空气环境中苯并(a)芘(Bap)的污染水平及与二氧化硫(SO_2)相关性的调查

本文调查分析了锦州市、县、乡镇和普通村庄空气中苯并(a)芘的污染水平,并用相关系数说明空气中苯并(a)芘的浓度与二氧化硫的浓度呈正相关。同时,我们调查了流经市区的小凌河水中苯并(a)芘的污染水平,发现河水流经市区后,苯并(a)芘的浓度显著升高;对农家院里的井水调查,发现4.2%的井水中苯并(a)芘浓度超过饮用水标准(10ng/L)。     

PP2Ac去甲基化在BaP诱导HBE细胞恶性转化中的作用

目的探讨蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2Ac)去甲基化在苯并(a)芘(benzo[a]pyrene,BaP)诱导人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial,HBE)恶性转化中的变化及可能作用。方法用40μmol/L BaP处理人支气管上皮细胞,每周一次,共15周,构建BaP诱导的HBE细胞恶性转化模型,采用软琼脂试验和裸鼠成瘤试验鉴定恶性转化是否构建成功,使用蛋白免疫印迹(Western blot)分析比较恶性转化细胞和同期对照组细胞中PP2Ac去甲基化及其调节蛋白表达变化。结果软琼脂试验和裸鼠成瘤试验结果显示,经BaP处理后的细胞能在软琼脂中形成细胞集落,接种BaP诱导转化细胞的裸鼠可见肿块,说明恶性转化成功。蛋白免疫印迹(Western blot)检测蛋白表达发现,经BaP诱导恶性转化的HBE细胞和经100μmol/L BaP单次刺激24 h的HBE细胞与正常HBE细胞相比,总PP2Ac表达均无差异,亮氨酸羧基甲基转移酶1(LCMT1)表达均明显下降,蛋白磷酸酶甲基酯酶1(PME-1)和PP2Ac去甲基化(Dem-PP2Ac)表达均明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 PP2Ac去甲基化在BaP诱导细胞恶性转化中发挥作用,可能通过增强PP2Ac去甲基化促进BaP致肺癌发生。     

硫化镍转化人细胞翻译启动因子的异常表达

目的探讨结晶型硫化镍(NiS)在诱发人支气管上皮细胞(16HBE)恶变过程中蛋白质翻译启动因子(TIF3)的异常表达，以阐明不容性硫化镍的人类分子致癌机制。方法应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，以及敏感先进的荧光定量PCR方法，对异常表达的蛋白质翻译启动因子TIF进行检测。结果相对于非转化对照细胞，RT-PCR实验初步显示，这些镍转化细胞和成瘤细胞的TIF3基因表达水平显著升高，平均分别是对照细胞的2和4倍，表明TIF3的异常表达水平与硫化镍诱发人支气管上皮细胞的恶变程度有关。结论不容性结晶型硫化镍在诱发人支气管上皮细胞恶变过程中，存在明显的蛋白质翻译启动因子TIF3异常表达现象，其表达水平与细胞的恶变程度密切相关，可能是结晶型硫化镍诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机制之一。     

反式—BPDE诱发人支气管上皮细胞系P53基因突变的研究

目的 检测苯并（a）芘的代谢产物反式－BPDE诱发的人支气管上皮细胞系P53基因突变,探讨苯并（a）芘在人肺癌发生中的作用。方法 用银染PCR－SSCP方法检测P53抑癌基因第5、6、7、8外显子的突变情况。结果 经反式－BPDE处理的人支气管上皮细胞系,20d,后P53基因第8外显子出现点突变。结论 结果提示,P53基因突变可能是苯并(a)芘诱发肺癌的早期分子事件。     

基因芯片筛选BPDE转化16HBE相关基因

目的 采用基因芯片技术筛选二羟环氧苯并芘（BPDE）转化的人支气管上皮细胞（16HBE）相关基因，探讨该技术在分子毒理学研究中的应用。方法 将实验组（BPDE-16HBE）和对照组（16HBE）的mRNA逆转录合成cDNA掺入荧光分子为探针，杂交于H40S基因芯片。分析2组基因的差异表达。结果 在4096种人类基因中。BPDE转化的16HBE和正常16HBE问存在差异表达的基因有143条，其中高表达52条，低表达41条。结论 基因芯片技术在筛选BPDE转化的16HBE相关基因改变上，具有高通量、高敏感、快速等特点，在毒物的分子致癌机制研究中意义萤大．     

硫化镍对16HBE细胞中基因的影响

目的 检测结晶型硫化镍(NiS)对K-ras基因和P15基因的改变及基因组不稳定性的影响，从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。方法 采用限制性片段长度多态性分析和聚合酶链反应一单链构象多态性分析方法探查结晶型NiS在诱导16人气管上皮细胞(HBE)恶变过程中的K-ras基因Exonl第12密码子及第12密码子以外的密码子改变情况。采用PCR-SSCP分析方法探查结晶型NiS在诱导16HBE细胞恶变过程中的P15基因Exon2存在状况。采用随机扩增多态性技术来对结晶型NiS在诱导16HBE细胞恶变过程中的基因组不稳定性进行分析。结果 K-ras基因Exonl和P15基因Exon2未发生改变。本实验所选用的7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带。其中P4、P5、P7两条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异，其余4条引物均有差异。对于同一随机引物他们都具有特异的带型。结论 P15基因第2外显子和K-ras基因第1外显子(包括第12、13密码子)可能不是结晶型NiS作用的靶部位。在结晶型NiS诱发细胞恶性转化过程中，基因组变得逐渐不稳定。     

二羟环氧苯并芘诱发细胞恶变后基因和蛋白表达差异分析

目的研究苯并(a)芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘(反式-BPDE)诱发人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的基因和蛋白表达的改变,探讨苯并(a)芘致癌的分子机制.方法应用含4096条人类全长基因的cDNA芯片检测反式-BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化的基因表达谱的变化;应用二维凝胶电泳技术和相应软件ImageMaster2D 3.10分析反式-BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化的蛋白质组变化,基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱结合数据库检索鉴定部分表达有差异的蛋白斑点.结果BPDE诱发的恶性转化细胞与阴性对照细胞比较,cDNA芯片结果显示差异表达基因有143条,其中52条基因在BPDE诱发的恶性转化细胞中表达增高,91条基因在恶性转化细胞中表达降低;二维凝胶电泳显示有72个蛋白斑点出现表达差异,其中44个蛋白斑点在BPDE诱发的恶性转化细胞中表达升高,28个蛋白斑点在恶性转化细胞中表达降低,对其中7个表达明显差异的蛋白斑点的鉴定显示,原癌基因v-erbb2同源3、锌指蛋白127、硫氧还原蛋白过氧化物酶2、KIAA0471蛋白在恶性转化细胞中高表达,而钙结合蛋白5、锌指蛋白Aiolos、Kelch样蛋白3在恶性转化细胞中低表达.结论反式-BPDE诱发16HBE恶性转化的基因表达谱和蛋白表达谱发生了显著的变化,这些表达改变的基因和蛋白可能参与了BPDE诱发细胞恶变的过程.     

DNA聚合酶β对苯并[a]芘致DNA损伤修复的影响

目的揭示聚合酶β(polβ)的表达水平与苯并[a]芘(BaP)诱导的DNA损伤效应的关系。方法采用3种具有相同遗传背景的小鼠胚胎成纤维细胞polβ野生型(polβ+/+)、polβ缺陷型(polβ-/-)和野生型polβ高表达型(polβoe)作为模型细胞。首先用RT-PCR和Western blot鉴定3种细胞中polβ在mRNA和蛋白质水平的表达情况,然后通过MTT试验和单细胞凝胶电泳(彗星试验)观察BaP作用下3种细胞的存活率及DNA损伤和修复效应。结果3种细胞在polβmRNA和蛋白表达水平上存在明显差异,polβ-/-细胞中polβ基因缺失,而polβoe细胞中polβ基因则较野生型polβ+/+细胞高出2倍以上;BaP能诱导3种细胞DNA的损伤以及细胞存活率的降低;与polβ+/+细胞相比,polβ-/-细胞的IC50更低,DNA损伤更严重且更加不易修复;反之,polβoe细胞的IC50更高,DNA损伤效应更弱,DNA修复速率加快。结论polβ在修复外源性致癌物BaP导致的DNA损伤中发挥着重要的作用,polβ基因缺陷使细胞DNA修复能力降低,而polβ基因的高表达则能帮助细胞应对DNA损伤,在一定程度上对细胞的存活起到了保护作用。