Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建、筛选与初步鉴定

目的:构建针对B细胞淋巴瘤Daudi细胞系噬菌体抗体库,从中筛选特异性抗体,并对所筛选出的阳性克隆进行鉴定.方法:以Daudi细胞免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗血清滴度后,分离抗体阳性的小鼠脾淋巴细胞,提取RNA.利用RT-PCR扩增抗体к轻链和重链Fd片段,经Sac Ⅰ/Xba Ⅰ和Xho Ⅰ/Spe Ⅰ双酶切,依次克降入噬菌体载体pComb3H-SS的相应酶切位点,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库.以Daudi细胞为抗原对抗体库进行6轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过ELISA法对随机挑选的克降进行抗原结合活性测定,获得的阳性克隆进一步做DNA序列测定、在大肠杆菌XL1-Blue中进行可溶性表达,并用Western blot对表达产物的特异性作了鉴定.结果:构建了容量为3.13 × 107的抗人B细胞淋巴瘤Daudi细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Daudi细胞系特异性识别结合的4株阳性克隆.氨基酸序列分析结果显示:阳性克隆的重链、轻链可变区序列分别与基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链、轻链可变区序列有80%～94%和88%～95%同源性.阳性克隆成功在大肠杆菌细胞中可溶性表达,Western blot结果表明所获得的可溶性表达产物可与Daudi细胞膜抗原特异性结合.结论:成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Daudi细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础.     

Raji 细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系噬菌体抗体库并从中筛选出特异性的抗体。方法以Raji细胞免疫BALB/c小鼠,RT-PCR法从脾淋巴细胞中扩增抗体轻链к和重链Fd基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Raji细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Raji细胞为抗原进行筛选,获得抗Raji细胞的抗体,通过ELISA法进行抗原结合活性的测定,并对所得阳性克隆进行基因测序分析。结果构建了容量为2.18×107的抗人B细胞淋巴瘤Raji细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Raji细胞系特异性识别结合的8株阳性克隆。对其中两个阳性克隆进行基因序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与免疫球蛋白基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区序列具有高度同源性。结论成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Raji细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础。     

BSA-Y-DOTA免疫噬菌体Fab抗体库的构建及鉴定

目的 :构建钇 十二烷四乙酸 (Y DOTA)免疫噬菌体Fab抗体库。方法 :将牛血清白蛋白 (BSA)与DOTA交联 ,并与金属Y鳌合制备成BSA Y DOTA ,用其免疫BALB/c小鼠。检测抗血清的滴度后 ,分离抗体阳性的小鼠脾淋巴细胞 ,提取总RNA。利用RT PCR扩增全套重链Fd和轻链基因 ,依次插入经改造的噬菌体载体pComb3M的相应酶切位点 ,构建成Fab噬菌体抗体库。用酶切、序列测定及ELISA等方法 ,对重组率、多样性及Fab的展示情况进行鉴定。结果 :成功得制备了BSA Y DOTA交联物 ,并获得较好的免疫效果。免疫小鼠的全套重链Fd片段和轻链均得到正确扩增 ;Fd片断和轻链基因均插入到载体pComb3M中 ;Fab抗体库的库容量达 8× 10 7;重组率约为90 % ,且具有良好的抗体基因多样性。另外 ,Fab片段也被展示于噬菌体表面。结论 :成功地构建了半抗原Y DOTA的Fab噬菌体抗体库 ,为筛选Y DOTA特异性抗体奠定了基础     

人源Fab噬菌体抗体库的构建与抗精氨酸加压素抗体的筛选

目的:构建人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗精氨酸加压素特异性抗体并进行初步鉴定。方法:从18位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA。利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,将其克隆至噬菌粒载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab噬菌体抗体库。以固相化的精氨酸加压素为靶抗原对抗体库进行五轮筛选后,随机挑取50个单克隆进行phage-ELISA检测,阳性克隆行DNA测序分析。结果:成功构建库容为2.4×108的噬菌体抗体库,从中筛选到6株阳性克隆能够与精氨酸加压素特异性结合,其中阳性值最高的C4克隆行DNA测序分析证实其重链属IgG亚类,轻链为λ链。结论:构建大容量人源天然Fab抗体库,从中获得了特异性抗精氨酸加压素人源Fab抗体片段,有望为临床上精氨酸加压素的快速检测技术的建立奠定基础。     

噬菌体呈现抗体库的构建及抗Fas—Fab抗体的研究

目的构建噬菌体抗体库,获得具有功能的抗Fas-Fab噬菌体抗体。方法以Fas重组蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠。取其脾细胞提取mRNA,采用RT-PCR方法扩增抗体基因,构建重链和κ链基因库,用重组Fas抗原对所构建的抗体库进行4轮筛选,并以ELISA法鉴定其功能。结果获得抗体重链Fd基因和κ链基因长度约700bp。构建的重链Fd基因为3.5×106的抗体重链基因库。构建的重链和κ链基因库的容量均为3.1×106。经VCSM13感染得到噬菌体的滴度为8.9×1016cFu/L的噬菌体抗体库,含有抗体重链和κ链基因的噬菌体占27％。用重组人Fas抗原进行4轮筛选,得到100％的富集,说明Fas重组抗原富集了抗Fas-Fab噬菌体抗体,经ELISA检测均有抗Fas抗体的特异性。结论制备的可溶性抗Fas-Fab抗体具有抗Fas抗体的特异性,为进一步的研究奠定了基础。     

人源化Fab段噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的:构建人天然Fab段噬菌体抗体库,为人源抗体的制备建立技术平台。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人抗体轻链和重链Fd段基因,构建噬菌体抗体库,酶切鉴定有无插入片段并测序分析,用IL-2和地高辛进行富集筛选。结果:最终构建的抗体库库容约为8.4×107,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率是70%,DNA测序分析证实抗体重链属IgG亚类,轻链为λ链。用IL-2和地高辛进行三轮筛选,抗体库均得到了不同程度的富集。结论:成功构建了一个天然的人源化噬菌体抗体库,可用于下一步胰淀素人源化抗体的筛选、纯化和表达。     

大容量人源Fab噬菌体展示抗体库的构建及抗CD276抗体筛选

目的构建大容量人源Fab噬菌体库,筛选并鉴定抗CD276的特异性抗体。方法通过采集10位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,插入噬菌体载体pCANTAB5H中,构建人源Fab噬菌体抗体库。通过固相化的抗原对抗体库进行3轮筛选后,随机挑取96个单克隆进行phage-ELISA鉴定,筛选出与抗原具有较强结合性的噬菌体克隆。结果成功构建库容为5×1010的噬菌体抗体库,从中筛选到11株阳性克隆,对其进行测序鉴定,表明该11株克隆的序列均一致,ELISA证实其对抗原CD276具有较强的结合性。结论构建了大容量人源Fab抗体库,从中获得具有抗CD276的人源Fab抗体片段,为进一步的研究和应用提供实验基础。     

人源性Fab段噬菌体抗体库的构建及抗人β1-AR抗体克隆的筛选

目的构建人源性Fab段噬菌体抗体库并筛选抗人β1-AR抗体克隆.方法通过RT-PCR从抗人β1-AR抗体阳性的扩张性心肌病(DCM)患者的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并利用噬菌体表面显示技术,以人β1肾上腺素受体细胞外第二环26肽(β1-ARECⅡ)为抗原肽,对此抗体库进行淘筛富集.结果成功地构建了库容量为1.4×106的人源性Fab段噬菌体抗体库,从此抗体库中筛选到了特异性抗人β1-AR Fab段噬菌体抗体阳性克隆.结论利用噬菌体抗体库技术可以获得表达抗人β1-AR抗体的重组克隆.     

从噬菌体抗体库筛选获得中和性人源抗甲型肝炎病毒Fab抗体

目的 研究人源抗甲型肝炎病毒基因工程抗体,为预防甲型肝炎病毒感染提供有效的方法。方法 采用噬菌体表面展示技术,从一名甲型肝炎恢复期病人的抗凝血中分离淋巴细胞,提取总ＲＮＡ逆转录后,用一组人ＩｇＧ Ｆａｂ特异性引物扩增。结果 克隆和表达了８株人源抗甲型肝炎病毒抗体Ｆａｂ段基因,经ＥＬＩＳＡ检测为特异性人抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ段抗体。结论 该８株人源抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ抗体都能与具有中和活性的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应,选其中的２株做体外中和实验,证明都有中和甲型肝炎病毒的活性。     

抗广州管圆线虫噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的以广州管圆线虫感染的小鼠脾细胞为源,构建抗广州管圆线虫抗体库,并筛选可用于广州管圆线虫病早期诊断的目的抗体。方法提取感染广州管圆线虫的小鼠脾细胞RNA,并逆转录合成cDNA第一链,PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻、重链基因先后连接到表达载体pComb3上,转化大肠杆菌XLI-Blue,构建组合文库。用广州管圆线虫排泄分泌抗原（EsAg）作为筛选抗原,进行富集筛选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果成功构建了小鼠抗广州管圆线虫噬菌体抗体文库,库容为2.32×106,滴度为1.7×1013cfu/ml。筛选到了抗广州管圆线虫排泄分泌抗原特异性抗体克隆5株,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行初步鉴定,具有一定的特异性。结论构建的抗广州管圆线虫噬菌体抗体库达到了要求,为研制广州管圆线虫金标诊断试剂盒奠定了基础。     

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。     

从噬菌体库中筛选抗SARS病毒S蛋白的Fab中和活性抗体研究

目的 从SARS病毒噬菌体抗体库中筛选出具有中和活性的抗S蛋白Fab片段抗体。方法ELISA方法对抗体库进行富集筛选及人源抗体克隆结合活性的测定，竞争ELISA初步筛选有中和活性的抗体，中和试验进一步确定中和活性，进而对其序列进行测定和分析。结果特异性富集了抗S蛋白噬菌体抗体，竞争ELISA筛选出两株抗体可部分阻断中和抗体2C5与S蛋白的结合，中和试验确定其具有一定巾和活性，编号为M1A和P8A，测序结果表明它们为两株不同的抗体克隆。结论筛选获得了两株抗体可部分中和SARS病毒活性，它们的获得为探索SARS病毒感染的被动免疫治疗打下了一定基础。     

噬菌体抗体库筛选技术研究进展

噬菌体抗体是指在其表面表达有Fab抗体或单链抗体(scFv)的噬菌体。用基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来, 组装到表达载体内并表达到噬菌体表面形成噬菌体抗体的群体, 即为噬菌体抗体库 [1]。经特定抗原或细胞筛选后, 便可获得特异性抗体。噬菌体抗体库的筛选是关键环节和步骤 [2, 3]。1　噬菌体呈现人抗体库的基本原理噬菌体抗体在膜表面表达, 是通过Fab段或ScFv与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白而完成。其特点是“它既可识别相应的抗原并与其结合, 又能够感染宿主菌进行再扩增”。利用其可再扩增的特性, 以靶抗原通过亲…     

人源噬菌体Fab抗体库构建过程中引物的优化和初步鉴定

目的 优化设计一套引物，扩增全套人抗体Fd片段和L链基因，改善扩增效率，益于人源噬菌体抗体库的构建。方法 根据V-BASE数据库提供的人抗体可变区胚系基因，在其家族分类基础上，根据FR1区5’端保守序列重新分组，设计特异性的5’端扩增引物。同时对设计引物的匹配情况进行分析，并应用PCR扩增和测序反应对其扩增效果进行鉴定。结果 Fd链5’端扩增引物有5条，κ轻链有6条5’端扩增引物，而λ轻链5’和3’扩增引物有10条。分析表明，人抗体可变区胚系基因与5’引物有较好的匹配率，数目较少，匹配率较高。PCR结果显示，全部的重链及轻链引物对均能高效扩增出特异性较高的目的片段。测序结果表明PCR扩增产物具有较好的亚类和可变区家族分布。结论 优化了一套扩增全套人抗体Fd片段和L基因的引物，为人源噬菌体抗体库的构建奠定了良好的基础。     

抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的: 构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性噬菌体抗体库, 搭建人源性抗体制备的技术平台, 为小儿呼吸道合胞病毒感染发病机制的研究、诊断、治疗和预防提供新的有效途径.方法: 从52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞中提取总RNA, 并逆转录为cDNA.用PCR扩增轻链和重链Fd段(即重链的可变区和第一恒定区)基因, 并将扩增的轻链和重链基因片段克隆于pComb3x噬粒载体, 电转化XL1-Blue大肠杆菌, 经辅助噬菌体M13K07超感染后构建成Fab段噬菌体抗体库.对此抗体库双酶切进行鉴定, 并用呼吸道合胞病毒颗粒作抗原进行初步筛选.结果: 经过重轻链基因的重组, 成功构建一免疫噬菌体抗体基因库, 共有2.6×106个不同的克隆菌, 其中70%的克隆均含有轻链和重链Fd 基因.因此, 所构建的噬菌体抗体库的库容量为1.8×106, 经初步筛选, 抗体库得到了不同程度的富集.结论: 利用基因重组技术和噬菌体展示技术, 成功构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性免疫噬菌体抗体库, 为进一步的研究奠定了基础.     

人噬菌体抗体库的构建和甲肝抗体的筛选

目的　构建人噬菌体抗体组合文库,筛选人单克隆抗体。方法　用RTPCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,电转化E.coli形成噬菌体抗体库;以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。结果　17对免疫球蛋白引物全部能够扩增出目的片段;经数次电转化构建了库容为693×107的抗体库,滴度为8×1014PFU/ml,Fab基因重组率为40%。以单抗捕获的甲肝抗原淘洗3轮,出现特异性富集;阳性克隆经直接ELISA和竞争抑制性ELISA实验证实具有良好的抗甲肝抗原特异性,无交叉反应性。结论　成功构建了抗体组合文库,从中获得抗甲肝抗原的特异性人抗体。     

天然人源IgG Fab噬菌体抗体库的构建及多样性分析

目的:构建天然人源IgGFab噬菌体抗体库并分析来源于健康人外周血B淋巴细胞的抗体基因可变区的多样性及优势选择。方法:以DNA重组技术从300名健康志愿者的外周血淋巴细胞中扩增出全套人抗体轻链及重链Fd基因,分别插入噬菌体载体pFabICN相应位置,构建天然人源免疫球蛋白G基因文库;进一步从抗体库中随机挑选克隆,获得重轻链基因进行核苷酸序列测定并利用IgBLAST数据库分析抗体基因可变区的同源家族。结果:从4×108库容的天然人源IgGFab噬菌体抗体库中随机挑选克隆,对其中32个轻链及重链Fd基因插入正确的克隆进行核苷酸序列测定和氨基酸序列的推算,获得29条彼此完全不同的Fd重链基因及轻链基因。以IgBLAST数据库比对分析显示29条重链基因的V区分别属于VH3(72.4%),VH1(10.3%),VH4(6.9%),VH5(6.9%)和VH7(3.4%)基因家族。29条轻链基因分别属于Vκ1(44.8%),Vκ2(15.4%),Vκ3(11.5%),Vκ4(23.1%)基因家族和Vλ1(11.5%)基因家族。结论:以300份健康人外周血淋巴细胞的抗体基因构建的天然人源IgGFab噬菌体抗体库基因多样性良好,重链VH3基因家族存在优势表达。     

抗SARS-CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库的构建

目的 :利用抗SARS冠状病毒IgG抗体阳性的SARS康复患者外周血淋巴细胞 ,构建人源Fab段抗体文库。方法 :制备外周血淋巴细胞总RNA ,逆转录成cDNA。以其为模板 ,利用针对家族特异性Ig基因的引物扩增重链Fd段和轻链基因 ,并重组到噬菌粒载体pComb3中 ,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL 1Blue,酶切鉴定抗体库的重组率 ,并测定噬菌体抗体库的库容量。结果 :构建了源于SARS康复患者血清中抗Fab段的抗体文库 ,轻链、重链Fd段基因的重组率分别为91%和 75 % ,库容量为 7.2 3× 10 7。结论 :成功地构建了抗SARS CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库     

抗肝癌细胞噬菌体单链抗体库的构建及筛选

构建抗人肝癌细胞单链抗体库 ,从中筛选与肝癌细胞特异结合的高亲和力单链抗体。从HepG2细胞免疫的BALB/c小鼠脾脏提取总RNA ,RT PCR扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因 ,用 (Gly4Ser) 3 连接肽基因 ,经重叠延伸反应 ,在体外将VH 和VL 连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,构建噬菌体单链抗体库。以HepG2细胞为抗原对抗体库进行淘选 ,ELISA法鉴定各单克隆与肝癌细胞的结合活性 ,并对阳性克隆进行表达。成功构建了库容为 1 1× 10 6抗肝癌细胞的噬菌体单链抗体库 ,经筛选得到了与HepG2细胞具有较强结合能力的单链抗体 ,实现了scFv在大肠杆菌中的可溶性表达。序列测定结果表明 ,VH 和VL 基因符合小鼠抗体可变区特征 ,scFv基因拼接正确     

抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定

目的 构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体。方法 提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL）,再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体（ScFv）。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能。将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。结果 成功构建噬菌体单链抗体库。经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体。结论 成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体。