E血清型沙眼衣原体主要外膜蛋白B细胞表位的预测

基于E血清型沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)主要外膜蛋白(Major outer membrane protein, MOMP)氨基酸序列,采用Hopp-Woods的亲水性方案、Emini表面可及性方案、Jameson-Wolf 抗原指数方案和Janin可及性方案等,辅以对MOMP蛋白的二级结构中的柔性区域及跨膜区域的分析,预测CT MOMP蛋白的B细胞表位.推测最有可能的B细胞表位位于MOMP蛋白N端第73～81区段、217～225区段、第377～386区段、第261～270区段和第161～175区段内或它们的附近.用多参数预测CT MOMP蛋白的B细胞表位,为进一步研究蛋白特性及表位疫苗研制奠定了基础.     

E型沙眼衣原体重组主要外膜蛋白诱导恒河猴的交叉免疫效应

目的 探讨E型重组主要外膜蛋白(rMOMP)对恒河猴诱导产生的衣原体交叉免疫应答效应.方法 恒河猴分3组,每组2只,分别为佐剂蛋白组、佐剂组、对照组.于第0、2、4周双侧肱三头肌注射.末次免疫后两周,ELISA检测恒河猴血清中沙眼衣原体特异性IgG抗体和细胞因子IFN-γ,MTT法检测恒河猴淋巴细胞特异性增殖反应,观察恒河猴的迟发型超敏反应,以及恒河猴的血清抗体中和试验.结果 佐剂蛋白组产生了较强的抗rMOMP反应和高水平细胞因子.淋巴细胞特异性增殖反应、迟发型超敏反应明显强于对照组,抗体中和试验蛋白佐剂组血清能抑制D/E/H/L2型沙眼衣原体生长.结论 沙眼衣原体rMOMP能刺激恒河猴产生有效的交叉免疫.     

沙眼衣原体主要外膜蛋白第四可变区DNA的克隆、序列分析及初步应用

用聚合酶链反应快速扩增出临床分离的沙眼衣原体主要外膜蛋白基因第四可变区ＤＮＡ，建立起含此ＤＮＡ片段的重组质粒克隆，对重组片段序列进行了测定。从分子水平证实了沙眼衣原体母婴垂直传播。     

重组卡介苗表达的MalE蛋白T细胞表位的鉴定

目的 鉴定重组卡介苗表达的MalE蛋白T细胞表位。方法 用抗原提呈试验、T细胞增殖试验、ELISPOT试验和表位作图测试重组MalE蛋白的T细胞表位。结果 重组BCG.MalE功能性表达了MalE蛋白的4种H-2^d限制性T细胞表位。结论 在4种表位中，p68-82是重组MalE蛋白的主要T细胞表位，而其余3个为次要表位。     

沙眼衣原体主要外膜蛋白在减毒鼠伤寒杆菌中的表达及 …

目的 采用作为疫苗载体的减毒鼠伤寒杆菌致死性平衡系统,构建能异源表达沙眼衣原体（Ｃｔ）主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）的重组菌株。方法 以Ｄ型Ｃｔ的ＤＮＡ为模板,用所设计的特异性引物扩增编码Ｃｔ ＭＯＭＰ高变区（ＶＤＩ～ＶＤＩＶ）基因,并将扩增产物定向克隆至质粒ｐＵＣ１９中。序列分析后,再亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０互补的质粒ｐＹＡ３３４１中,以重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０。结果 对构建的重     

含E型沙眼衣原体MOMP基因的重组腺病毒和DNA疫苗联合免疫效果的研究

目的探讨E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）DNA疫苗和重组腺病毒联合免疫小鼠诱导的免疫效应。方法构建、纯化重组腺病毒Ad-MOMP及重组真核表达质粒pVAX1-MOMP。设计4种免疫方案,分别为DNA免疫（ DNA组）、重组腺病毒免疫（ Ad组）、DNA初次免疫-重组腺病毒加强免疫（ DNA/Ad组）、重组腺病毒初次免疫-DNA加强免疫（ Ad/DNA组）。末次免疫后2周检测小鼠血清特异IgG、IgG1、IgG2a、IgA抗体,阴道分泌物SIgA抗体及脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-10水平。结果DNA组诱导较弱免疫应答,未产生SIgA抗体及Th1反应。 Ad组诱导出Th1反应及SIgA抗体,且血清抗体显著高于DNA组。联合免疫均能诱导明显强于单独免疫的黏膜SIgA、血清抗体及Th1反应。 Ad/DNA组的Th1反应强于DNA/Ad组;而DNA/Ad组的血清抗体和黏膜抗体水平强于Ad/DNA组。结论Ad-MOMP能诱导黏膜免疫及Th1细胞免疫应答,DNA/Ad及Ad/DNA联合免疫产生的特异性免疫应答明显强于单独免疫。其中Ad/DNA的Th1反应优势更明显,DNA/Ad的血清抗体和黏膜抗体反应更强。接种顺序会影响联合免疫的强弱及类型,这为Ct疫苗的设计研究提供新的思路和实验依据。     

E型沙眼衣原体主外膜蛋白DNA疫苗和重组蛋白疫苗联合免疫诱导出的免疫效应

目的 研究沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)DNA疫苗和重组蛋白(rMOMP)疫苗联合免疫小鼠诱导出的免疫效应.方法 3～4周BALB/c雌鼠60只,分5组,每组12只,于第0、2、4周通过双侧股四头肌肌注免疫相应的疫苗.通过血清IgG抗体和IFN-γ含量、阴道冲洗液sIgA抗体含量、脾淋巴细胞增殖指数、迟发型超敏反应、阴道脱落细胞种植等指标进行小鼠免疫效应的测定.结果 DNA蛋白联合组小鼠血清IgG抗体水平A405值为0.629±0.052;sIgA,A450值为0.379±0.052;脾淋巴细胞增殖指数为5.682±0.484;淋巴细胞培养上清液中IFN-γ含量为(1265±128)ps/ml.DNA蛋白联合组小鼠的各项指标均好于EB阳性对照组除外的其他组(P<0.01).结论 沙眼衣原体DNA疫苗和蛋白疫苗联合免疫可以增强免疫保护效应.     

Recognition of the 60 kilodalton cysteine-rich outer membrane protein OMP2 by CD4(+) T cells from humans infected with Chlamydia trachomatis.

T cell-mediated immunity is important in the control of chlamydia infection but chlamydia-specific T cells are also implicated in the inflammation and tissue damage which characterize chlamydia associated diseases. To investigate target antigens of the T cell-mediated immune response to chlamydia infection, Chlamydia trachomatis-specific CD4+ T cell clones were isolated from a patient with chlamydia-induced reactive arthritis. T cell immunoblotting indicated that an antigen of approximately 60 kilodaltons molecular mass was recognized, and recombinant 60 kilodalton cysteine-rich outer membrane 2 (OMP2) proved to be stimulatory. By using deletion constructs and synthetic peptides an epitope presented by HLA-DRB1*0401 was defined and proved to contain the nonamer peptide within the OMP2 sequence predicted to have the greatest binding affinity for DRB1*0401 The sequence of the epitope is conserved in all C. trachomatis strains but not in C. pneumoniae. Investigation of patients with acute urethritis and additional patients with sexually acquired reactive arthritis showed that OMP2-reactive T cells were readily detectable in peripheral blood and synovial fluid. Thus OMP2 is a target antigen of the T cell-mediated immune response to CT infection.     

HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合DNA诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫的研究

目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV)6b结构蛋白L1和沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)多表位嵌合DNA(HPV6b L1/Ct MOMP)诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫效应,及HPV6b L1对Ct MOMP多表位基因诱导细胞免疫的增强作用.方法 将Ct MOMP多表位基因连接在经真核密码子优化的HPV6b L1羧基端,构建嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP多表位,经酶切和测序证实后,转染COS-7细胞,间接免疫荧光鉴定其在真核细胞中的表达;将纯化后的嵌合重组质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,并设置pcDNA3.1(+)/Ct MOMP多表位质粒、pcD-NA3.1(+)和PBS三组对照.采用0、2、4周免疫程序,DNA剂量为每只150μg/次.于末次免疫后2周,分别用乳酸脱氢酶(LDH)释放法和细胞内细胞因子染色-流式细胞术(ICS-FAGS)检测小鼠脾细胞对Ct MOMP多表位蛋白和HPV6b L1蛋白的特异性CTL活性,胞内细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10产生水平等细胞免疫应答指标.结果免疫后,在效靶比(E∶T)分别为40∶1、20∶1时,pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合重组质粒免疫组小鼠产生了针对Ct MOMP多表位蛋白特异性CTL杀伤活性(44.56%±4.02%,35.35%±2.89%)和HPV6b L1蛋白特异性CTL杀伤活性(27.08%±2.04%,21.68%±4.06%),与各对照组比较差异有统计学意义(F=72.87,F=114.55,P＜0.05;F=30.04,F=10.47,P＜0.05),且显著高于pcDNA3.1(+)/Ct MOMP多表位质粒组(35.50%±2.68%,30.24%±1.75%;12.27%±3.36%,9.32%±3.07%;P＜0.05);而pcDNA3.1(+)/Ct MOMP多表位质粒组小鼠仅显示了Ct MOMP多表位特异性的CTL杀伤活性,与对照组比较差异也有统计学意义(F=58.85,F=120.21;P＜0.05).胞内细胞因子IFN-γ的产生水平,pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合质粒组(4.34%±0.06%)高于pcDNA3.1(+)/Ct MOMP多表位质粒组(3.14%±0.18%),与对照组比较差异有统计学意义(F=473.83,P＜0.05),而重组质粒组较空载体组和PBS对照组差异也有统计学意义(F=211.72,P＜0.05);但IL-4和IL-10水平则各组间差异无统计学意义(F=0.97,P＞0.05;F=2.25,P＞0.05).结论 pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合DNA质粒可诱导BALB/c小鼠同时产生针对HPV6b L1蛋白和Ct MOMP多表位蛋白特异性的细胞免疫效应;真核密码子优化的HPV6b L1能显著增强Ct MOMP 多表位基因诱导的小鼠特异性细胞免疫效应.     

EB病毒潜伏膜蛋白2多表位的原核表达及其抗原特性分析

目的 对EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)中富含T、B细胞多表位肽段基因进行原核表达,并分析该多表位蛋白的抗原特性.方法 利用计算机在线软件预测EBV LMP2蛋白的CTL表位、Th表位.选取富含CTL表位和Th表位的肽段,兼顾其上下游已预测的B细胞表位,组成含多个T、B细胞表位的EBV LMP2多表位,该多表位基因序列经原核密码子优化后全序列合成,并克隆入原核表达载体pET32a(+)得到pET32a(+)/EBV-LMP2多表位重组质粒,经IPTG诱导在E.coli BL21(DE3)表达并纯化,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定;采用EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清进行Western blot分析其抗原特性;并利用EBV-LMP2多表位蛋白免疫BALB/c小鼠,分别采用LDH和ELISA方法检测小鼠脾细胞特异性CTL杀伤效应及血清特异性抗体IgG水平,以分析该表位蛋白的免疫原性.结果 LMP2(aa195-232)和LMP2(aa419-436)肽段富含CTL、Th和B细胞表位,将其串联后作为EBV LMP2多表位,该多表位基因在大肠杆菌中获得了表达.表达产物的相对分子质量(Mr)约27×103,与预期Mr相符;经Western blot证实EBV-LMP2多表位具有抗原特异性,可被EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清特异性抗体识别;小鼠免疫结果显示EBVLMP2多表位可诱导机体产生特异性的CTL杀伤效应,随着效靶比(1:5,1:10,1:25)增加,CTL杀伤活性逐渐增强(12.52%±2.59%,21.80%±1.08%,23.68%±3.74%),同时产生了特异性血清IgG抗体反应(A490=0.258±0.040),与对照组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 本研究没计的EBV-LMP2多表位具有良好的抗原性和一定的免疫原性.     

沙眼衣原体CPAF免疫活性区域重组蛋白的表达及在临床诊断中的应用

目的分析沙眼衣原体(Ct)蛋白酶样活性因子(CPAF)免疫优势区的免疫活性,探讨其在Ct感染诊断中的应用价值。方法构建原核表达重组质粒pGEX-6p-2/CPAF′,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用该纯化的表达产物包被酶标板,建立间接ELISA检测病人血清中的Ct特异性IgM和IgG抗体,同时与晶美公司Ct ELISA试剂盒检测结果进行对比分析。结果含pGEX-6p-2/ CPAF′的大肠杆菌BL21大量表达相对分子质量(M_r)约为43×10~3的目的蛋白,用该重组蛋白包被酶标板,建立间接ELISA检测Ct IgM、IgG阴性和阳性参考血清各50份,符合率均为100%;同时检测250份临床血清标本,与晶美公司ELISA试剂盒检测结果的符合率IgM为96.8%,IgG为98.4%。结论表达的Ct CPAF免疫优势区(AA_(200)～AA_(338))重组蛋白具有良好的免疫反应活性,可望用于Ct感染的临床诊断。     

沙眼衣原体主要外膜蛋白核酸疫苗诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答

目的构建沙眼衣原体主要外膜蛋白核酸疫苗,并观察其诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫。方法将核酸疫苗(pcDNA3.1MOMP)或对照空质粒(pcDNA3.1)注射于4～6周龄小鼠后腿股四头肌,每次剂量为100mg。间隔2周加强免疫2次。末次免疫后,ELISA法测定脾淋巴细胞培养上清液中IFNγ及小鼠血清中抗MOMP水平;MTT法测定脾淋巴细胞特异性增殖反应。结果小鼠接种核酸疫苗后,能产生特异性抗体,第3次免疫后抗体最高滴度达1∶1024,培养上清液中IFNγ达(532.0±45.4)pg/mL;实验组小鼠脾淋巴细胞刺激指数为3.94±0.25,其抗原特异性反应明显高于对照组。结论沙眼衣原体主要外膜蛋白核酸疫苗能刺激机体产生特异的细胞免疫和体液免疫。     

Expression and Purification of the Major Outer Membrane Protein of Chlamydia Trachomatis in Prokaryotic Cell

Chlamydiatrachomatis(C.trachomatis)isanobligate intracellularbacterialpathogen.Ocularinfectionwith C.trachomatisserovarsA,B,BaandCleadstotracho ma,aleadingcauseofpreventableblindnessinmanyde velopingcountries[1].Urogenital tractinfectionwithC. trachomat…