荧光定量PCR用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度检测的研究

目的：建立一种高效、简便的荧光实时定量PCR方法,用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度的检测.方法：利用Bac-to-Bac载体系统在E.coli菌株DH10 Bac中构建重组杆状病毒穿梭质粒（Bacmid）和在昆虫细胞中构建含人IL-18基因的重组杆状病毒,纯化的重组Bacmid作为PCR检测的标准模板,由昆虫细胞中收获的病毒母液用于空斑测定和病毒DNA提取.以10倍梯度稀释的重组Bacmid作为标准模板,进行荧光定量PCR扩增IL18基因片段并绘制标准曲线,然后以提取的重组杆状病毒DNA作为模板,采用同样体系进行实时PCR反应检测.同时,以琼脂糖空斑法测定病毒母液的滴度.结果：成功构建了重组杆状病毒并建立了病毒滴度的实时荧光PCR检测方法.运用标准模板进行的PCR反应显示该方法的线形范围为101～108拷贝,病毒母液的DNA拷贝浓度（vg/ml）值约为空斑检测的滴度pfu/ml值的10倍.结论：荧光定量PCR方法可灵敏快速地鉴定重组杆状病毒,并在较大的线性范围内检测重组杆状病毒滴度,较之空斑法更准确地反映了重组杆状病毒的实际数量.     

荧光定量PCR用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度检测的研究

目的：建立一种高效﹑简便的荧光实时定量PCR方法，用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度的检测。方法：利用Bac-to-Bac载体系统在昆虫细胞中构建含人IL-18基因的重组杆状病毒，收获的病毒母液以10倍梯度系列稀释后，提取病毒基因组DNA。以10倍梯度稀释的重组杆状病毒穿梭质粒（bacmid）作为标准模板，进行荧光定量PCR反应扩增IL-18基因片段并绘制标准曲线，然后以上述的重组杆状病毒基因组DNA作为模板，采用同样体系进行实时PCR反应检测，同时用琼脂糖空斑法测定病毒母液的滴度。结果：成功构建了重组杆状病毒并建立了病毒滴度的实时荧光PCR检测方法。运用标准模板进行的PCR反应显示该方法的线形范围为101-108拷贝，病毒母液的DNA拷贝浓度（vg/mL）值约为空斑检测的滴度 pfu/mL值的10倍。结论：荧光定量PCR方法可灵敏快速地鉴定重组杆状病毒，并在较大的线形范围内检测重组杆状病毒滴度，较之空斑法更准确地反映了重组杆状病毒的实际数量。     

荧光定量PCR技术研究进展

基于荧光能量传递技术的荧光定量PCR技术可实时监测PCR反应 ,准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等 ,它的出现 ,极大地克服了原有PCR技术存在的不足如交叉污染等问题 ,并改善了PCR技术的应用如可广泛应用于临床观测患者病情发展及预后 ,判断药物疗效等。本文概述了目前几种荧光定量PCR技术即Taqman、Amplisensor、分子信标、Lightcycler及复合探针法的原理及特点。便于更好地理解及应用这项技术。     

应用荧光定量PCR及ELISA法检测弓形虫感染分析

目的 :为了准确检测产前优生咨询妇女弓形虫感染及掌握不同时期弓形虫的量值变化情况。方法 :本室采用荧光定量PCR技术并结合ELISA法同时对 16 98例产前妇女进行联合检查。并将其结果进行对照分析。结果 :发现ELISA不同抗体阳性率和荧光定量PCR阳性率在检测结果上有一定的差异。在ELISA抗体仅一项阳性的患者中 ,IgG抗体阳性其荧光定量PCR检测值也为阳性的百分率最高 ,达 88.9% ,(P >0 .0 5 ,无差异 )。其次为IgM抗体阳性 ,符合率达 6 2 .5 % (P <0 .0 5 ,有差异 )。Cag循环抗原阳性最低 ,仅 31.8% (P <0 .0 1,有显著差异 )。在二项抗体同为阳性的患者中 ,IgG和IgM双阳其荧光定量PCR检测也为阳性的百分率最高 ,达 98.5 %。IgG与Cag双阳、IgM与Cag双阳的分别为 86 .8%、85 .4%。对 3项抗体全为阳性的 3名患者来说 ,两种方法结果一致。另外在 12 14名ELISA阴性的患者中 ,用荧光定量PCR法仍检测 5例阳性 ,阳性率为 0 .41%。结论 :由于荧光定量PCR技术增加了探针杂交 ,它的特异性及准确性都大大提高 ,可靠程度优于ELISA ,具有重要的临床参考价值。但在人体感染的某些时期 (Igm ,Cag单项阳性时 )荧光定量PCR法也会存在漏诊的情况。由此可见 ,这两种方法都各有其优缺点 ,只有将两种方法有机结合起来 ,才能对弓     

实时荧光定量PCR的应用体会

对于病毒的监测和疾病的诊断,定性检测已不能满足临床需要,实时荧光定量PCR技术(realtime quantitative PCR)于1996年由美国Aplied Biosystems公司推出.     

荧光定量PCR技术及其应用

荧光定量ＰＣＲ是新研制出的一种核酸定量技术。该技术在ＰＣＲ反应系统中引入了荧光标记探针,具有高灵敏性、高特异性和高精确性的特点。目前已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、基因表达、突变和多态性研究等多个领域。     

荧光定量PCR在淋菌性盆腔炎诊治和监测中的应用

近年来,性传播疾病(STD)日益增多,其中以淋病最常见,约占STD发病人数的70%～88%,淋病奈瑟氏菌可引起泌尿系、生殖系粘膜表面的急性或慢性化脓性感染外,还可经血行播散导致全身性感染.可造成输卵管内膜粘连、闭锁和输卵管周围粘连卷曲,引起女性终身不孕、甚至宫外孕.所以选择一种快速、明确的检测方法,对其进行诊断以及监测疗效越来越重要.早期PCR常因实验室管理不规范,极易引起由扩增产物污染所致的假阳性和不能定量.荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)克服了其缺点,它融汇了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点,直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果,不需要PCR后处理或电泳检测,完全闭管操作(整个过程中,仅有加入样品的一次开盖).2000年我院采用FQ-PCR诊断及监测治疗淋病患者40例,发现该方法操作简便,结果可靠,灵敏度高,并可定量研究,对淋菌性盆腔炎诊治、监测有很大帮助.现报道如下.     

实时荧光定量PCR在医学遗传学方面的应用

实时荧光定量 PCR是近年来发明使用的一种核酸检测技术 ,因高精确度、高灵敏性、污染少 [2 ,3]等优点已在生物医学基础科研及医学临床中得到广泛应用 ,本文就其在遗传学方面的应用作简要综述     

实时荧光定量PCR在细胞因子mRNA检测研究中的应用

RR-FQ-PCR技术是一种最新PCR技术,具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点.本文就RT-FQ-PCR概念、原理、方法、研究进展及其在细胞因子mRNA检测中的应用等作一综述.     

超声联合载BDNF逆转录病毒微泡开放血脑屏障治疗阿尔茨海默病

目的:制备载脑源性神经营养因子（BDNF）逆转录病毒超声微泡（MpLXSN-BDNF）,探讨其联合超声开放血脑屏障对阿尔茨海默病（AD）模型大鼠的治疗作用。方法:成年雄性SD大鼠32只,随机分为4组：超声+载pLXSN-EGFP微泡组（U+MpLXSN-EGFP组）、超声+载pLXSN-BDNF微泡组（U+MpLXSN...     

荧光定量 PCR与半定量PCR检测HBV DNA的对比分析

目的：对照分析荧光定量PCR与半定量PCR检测血清HBV DNA的载量，为临床基因检测实验室提供方法学选择依据。 方法： 取164份临床检测标本各用荧光定量PCR与半定量PCR检测，结果作统计学分析。 结果: 两种检测方法的灵敏度和特异度没有显著差异（χ2 =1.75，P>0.05）。 结论: 临床基因检测实验室可用半定量PCR法替代荧光定量 PCR法检测血清HBV DNA的载量。     

荧光定量PCR检测孕妇外周血中游离胎儿DNA在子痫前期中的价值

目的探讨孕妇外周血中的游离胎儿DNA水平作为子痫前期预测指标的可能。方法普通PCR检测子痫前期孕妇22例和正常孕妇25例的血浆中Y染色体性别决定基因（SRY）,然后应用荧光定量PCR技术对有SRY基因表达者的胎儿DNA水平进行定量分析并比较子痫前期孕妇组和正常孕妇组胎儿DNA水平的差异。结果22例子痫前期患者及25例对照组中各有12例出现SRY阳性信号。子痫前期组的胎儿DNA水平明显高于正常对照组（P〈0.01）。结论孕妇外周血中的游离胎儿DNA可望作为预测子痫前期的指标之一。     

荧光定量PCR技术对诊治阴道解脲脲原体感染价值的研究

目的　通过荧光定量PCR技术检测阴道内解脲脲原体感染状况 ,用以指导临床正确治疗。方法　对门诊的阴道炎患者 ,采用特制密封棉拭子宫颈管内取样 ,然后采用重量差减法 ,求出分泌物的重量 ,采用荧光定量PCR测定解脲脲原体。FQ -PCRUu的拷贝数 /g分泌物 ,与临床患者不同的症状体征作对照研究。结果　解脲脲原体拷贝数 /g≥ 1× 10 6的患者 ,82 9%具有典型阴道炎症状 ,71 9%具有阴道炎体征。拷贝数 /g <1× 10 6的患者 ,症状体征均不明显 ,二者之间差异显著     

多重定量荧光PCR技术在Y染色体AZF微缺失检测中的应用研究

目的建立检测Y染色体无精子症因子（AZF）微缺失的多重定量荧光PCR体系。方法以5’FAM、JOE和TAMRA荧光基团标记PCR引物,建立包含Y染色体AZF4个亚区（AZFa～d）15个序列标签位点（STS）的多重定量荧光PCR体系;并对无精子症组、严重少精子症组及精液正常组进行Y染色体AZF微缺失检测。结果成功建立了检测Y染色体AZF微缺失的多重定量荧光PCR体系;200例男性中检测到Y染色体AZF微缺失16例,其中72例无精子症组7例,缺失率为9．7％,78例严重少精子症组9例,缺失率为15．4％,50例精液正常组未检测到缺失。无精子症组、严重少精子症组缺失率与精液正常组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论多重定量荧光PCR技术是一种快速、简便检测Y染色体AZF微缺失的方法,具有重要临床应用价值。     

孕妇外周血中游离胎儿DNA的检测在早产预测中的价值

目的探讨孕妇外周血中的游离胎儿DNA检测的可行性及其水平变化在早产预测中的价值。方法普通PCR检测17例先兆早产孕妇和20例正常孕妇血浆中Y染色体性别决定基因(SRY),继应用荧光定量PCR技术对有SRY基因表达者的胎儿DNA水平进行定量分析并进一步比较早产孕妇组和正常孕妇组间DNA水平的差异。结果17例先兆早产患者及20例对照组中各有9例、10例出现SRY阳性信号。先兆早产组的胎儿DNA水平明显高于正常对照组(P<0.01)。结论孕妇外周血中的游离胎儿DNA可望作为预测早产的指标之一。     

Detection of Gallibacterium anatis by TaqMan fluorescent quantitative PCR

To better understand the prevalence of Gallibacterium anatis in different poultry species, a rapid and accurate method was developed to detect G. anatis using a TaqMan fluorescent quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Specific primers and a TaqMan probe were designed based on the reference gtxA gene sequence. The qPCR standard curve showed a good linear relationship, and the method showed good reproducibility, sensitivity, and specificity, indicating its suitability for G. anatis identification and quantitative analysis. A comparison of the detection results in 160 clinical swab samples showed that the detection rate (54.4%) of the qPCR for G. anatis was better than that of two conventional methods: gyrB gene-based qPCR for G. anatis (51.9%) and culture-based identification (34.4%). G. anatis was detected in layer chicken (77.3%), Silkie chicken (72.7%), and duck (27.1%) with relatively high detection rates, whereas dove (8.8%) and quail (3.0%) showed lower detection rates, indicating the different prevalence of G. anatis in different fowl species.     

荧光定量PCR分析FGFR2基因多态性与乳腺癌的相关性研究

目的 探讨成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growth faceor receptor 2,FGFR2)基因rs2981582位点单核苷酸多态性(single necleotide polymorhism,SNP)与乳腺癌易感性之间的关系.方法 建立新的荧光定量PCR检测rs2981582位点SNP,并对936例乳腺癌患者和471例良性乳腺疾病患者进行病例对照研究,分析该位点SNP与乳腺癌发生之间的关系.结果 对照组CC、CT、TT各基因型的例数及基因频率分别为234(49.68%)、181(38.43%)、56(11.89%).乳腺癌组总体各基因型例数及基因频率分别为426(44.56%)、400(41.84%)、130(13.60%),与对照组差异无统计学意义(P=0.183).进一步分层分析发现,雌激素受体(+)组各基因型例数及基因频率分别为189(41.27%)、202(46.12%)、67(14.63%),与对照组比较差异有统计学意义(P=0.035);而雌激素受体(-)组各基因型及基因频率分别为237(47.59%)、198(39.75%)、63(12.65%),与对照组比较差异无统计学意义(P=0.802).结论 FGFR2基因第2内含子SNPrs2981582与雌激素受体阳性乳腺癌的发生有显著关系,同时验证了用本方法检测大批量人群标本的SNP操作简便,检测耗时短,结果特异且费用较为低廉,适合于进行大规模样品的SNP快速测定.     

荧光定量PCR检测稽留流产患者沙眼衣原体和解脲支原体结果分析

目的探讨沙眼衣原体（CT）和解脲支原体（UU）感染与孕妇稽留流产的相关性,以及荧光定量PCR在稽留流产病因检测中的应用价值。方法采用荧光定量PCR检测稽留流产患者宫颈分泌物标本中的CT-DNA和UU-DNA的含量。结果 138例稽留流产患者中72例感染CT或UU,总检出率53.62%,其中CT阳性率21.74%,UU阳性率42.03%,混合感染10.14%。与正常人群对照差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论泌尿生殖系统CT和UU的感染与稽留流产有密切相关性,荧光定量PCR对稽留流产患者CT和UU的检测简单、快速、准确。