柯萨奇B1病毒VP1基因序列分析

柯萨奇病毒Ｂ组 (ＣＶＢ)有 6个血清型 (ＣＶＢ1～ 6 ) ,是引起人类病毒性心肌炎等疾病的主要病原 ,近年来其发病呈上升趋势 ,目前尚缺乏有效防治措施。ＣＶＢＶＰ1基因编码其主要中和抗原 ,本研究拟克隆柯萨奇Ｂ1病毒 (ＣＶＢ1)中国分离株的ＶＰ1基因并测定其序列 ,以期为我国ＣＶＢ1感染的防治提供理论基础。1　材料和方法1 1　材料　ＣＶＢ1中国分离株由哈尔滨医科大学克山病研究所提供。ｐＭＤ18 Ｔ(ＴａＫａＲａ公司 )为 2 7ｋｂ的ＴＡ克隆载体。Ｖｅｒｏ细胞和ＪＭ10 9菌株由中国预防医学科学院病毒学研究所诊断二室提供。ＶＰ1的Ｐ…     

柯萨奇B3病毒引起心肌细胞凋亡的初步探索

目的 以病毒性心肌炎（ｖｉｒａｌ ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ,ＶＭＣ）细胞感染模型为基础,研究柯萨奇Ｂ３病毒（ＣｏｘｓａｃｋｉｅＢ３ ｖｉｒｕｓ,ＣＶＢ３）感染与心肌细胞凋亡的关系。方法 在嗜鼠心肌柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３ｍ）感染心肌细胞后２４ｈ电镜观察细胞超微结构的改变,同时取细胞悬液以流式细胞仪检测“凋亡峰”,了解细胞亡率,并采用酶联免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）定量测定ＣＶＢ３ｍ病毒感染后１、２、４、     

反义硫代寡核苷酸体外抑制柯萨奇病毒B3增殖的研究

目的 在ＣＶＢ３易感的Ｖｅｒｏ细胞系中观察与ＣＶＢ３ＲＮＡ５’ＮＣＲ的ｎｔ５８１－６０１区域区补的２１聚硫代ＡＯＤＮ抗病毒活性。方法 采用ＭＴＴ法测定细胞活性,直接观察ＣＰＥ,测定培养上清ＴＣＩＤ５０,并分别用ＥＬＩＳＡ和往点杂交法检测ＣＶＢ３抗原及其ＲＮＡ。结果 １．ＡＯＤＮ可推迟和减轻ＣＰＥ,且随ＡＯＤＮ浓度增加,对ＣＰＥ的抑制作用增强,感染细胞存活率也随ＡＯＤＮ浓度升高而升高;２．ＡＯＤＮ可     

柯萨奇B3病毒VP1基因在原核中的表达及其临床意义

目的：研究柯萨奇B3病毒（CVB3）VP1基因在大肠杆菌中的表达及其临床意义。方法：将柯萨奇B3病毒中国分离株VP1基因克隆入PQE-30载体,转导入大肠杆菌（Ml5）中,使CVB3的VP1基因在大肠杆菌中得到稳定的表达,采用NAT亲和方法纯化,间接ELISA方法做免疫学活性鉴定。结果：表达的VP1产物与抗柯萨奇B3病毒的兔抗CVB3（多克隆抗体）血清产生较强的免疫反应,与天然的CVB3蛋白抗原（病毒组织培养抗原）的抗原性近似。应用无关兔抗体对照呈阴性反应。应用表达的VP1产物作为抗原,对临床急性病毒性心肌炎患者血清进行了特异性IgM酶联免疫吸附试验检测,其结果与组织培养的CVB3制备的细胞蛋白抗原对上述患者血清的特异性IgM检测结果基本一致。结论：采用基因工程方法制备出的CVB3-VP1蛋白抗原产量高,纯化后免疫反应原性基本没有变化。试用表达CVB3的VP1基因工程抗原代替目前实验用有感染危险的病毒培养抗原的方法,快速、特异地检出CVB3的感染,为急性心肌炎的早期诊断和及时的临床治疗提供可靠的实验室诊断指标。     

柯萨奇病毒B3通过caspase依赖途径诱导HeLa细胞凋亡

目的 评价柯萨奇病毒B3（CVB3）致HeLa细胞死亡的方式及分子机制。方法 用CVB3作用于HeLa细胞,在不同时间收集细胞,通过相差显微镜、电子显微镜、流式细胞仪以及分子生物学手段,HeLa细胞的病变及caspase-3基因mRNA和蛋白质的表达。结果 CVB3作用于HeLa细胞后,细胞很快发生变性和坏死,24h后较多细胞凋亡;caspase基因在病毒作用早期即被活化,表现在caspase-3 mRNA在病毒作用后6h内,迅速增高达峰值。在24h内,又降至接近病毒作用前的水平。caspase-3蛋白表达在42h内逐渐增高。结论CVB3可诱导HeLa细胞发生坏死和凋亡两种反应,坏死早于凋亡,细胞凋亡与caspase-3的表达密切相关。     

柯萨奇B3病毒对心肌细胞钙平衡的影响

目的 探讨柯萨奇Ｂ３病毒（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ Ｂ３,ＣＶＢ３）对膜离子通道及离子交换载体的影响,了解病毒感染导致细胞内钙超载的原因。方法 酶灌注法获得单个心肌细胞后用光聚焦显微镜和钙离子荧光探针（Ｆｌｕｏ ３／ＡＭ）检测ＣＶＢ３感染对心肌细胞内游离钙离子浓度的影响及利用模片钳全细胞电流记录技术观察ＣＶＢ３对Ｌ型钙通道电流,钠通道电流和钠钙交换电流的影响。结果 ＣＶＢ３感染使细胞内的游离钙     

应用合成肽研究柯萨奇B病毒衣壳蛋白VP1共的抗原表位

对柯萨奇Ｂ４病毒（ＣＶＢ４）衣壳蛋白ＶＰ１保守区的亲水性和二级结构进行分析和预测，选择可能代表优势抗原表位的肽段进行合成（ＶＰ１－１肽，ＲＩＹＦ ＫＰＫＨＶＫ ＡＹＶ），并截取了该肽段的前１２个残基（ＶＰ１－２肽）用同样方法进行合成。用ＶＰ１－１肽免疫家兔制备出高效阶抗体，应用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测，这些抗体与ＣＶＢ１－６病毒均有结合反应，ＶＰ１－１肽与型特异性ＣＶＢ１－６抗体均有良好的     

柯萨奇B3病毒心肌株与非亲心肌株感染小鼠心肌细…

柯萨奇Ｂ３非亲心肌株病毒（ＣＶＢ３ｏ）是否引起心肌炎还缺乏直接的实验依据。我们采用柯萨奇Ｂ３亲心肌株（ＣＢＶ３ｍ）和ＣＶＢ３ｏ感染鼠培养心肌细胞，对两株病毒感染细胞的特性进行了比较，结果表明，ＣＶＢ３ｏ与ＣＶＢ３ｍ在乳鼠心肌细胞培养液中的滴度，１２小时和２４小时无明显差别，４８小时后ＣＶＢ３ｍ的滴度变化不大，面ＣＶＢ３ｏ有所下降；两株病毒均能使鼠心肌细胞死亡，但随着时间的延长ＣＶＢ３ｍ感染后心肌细     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白DNA 疫苗诱导小鼠产生免疫应答的研究

目的 制备4种柯萨奇B3病毒（CVB3）结构和非结构蛋白重组质粒DNA疫苗,并探讨其诱导机体产生体液和细胞免疫应答的效果。方法 用基因重组技术构建4种CVB3结构和非结构蛋白重组质粒,将各重组质粒体外转染真核细胞,用Western blot检测表达产物;于BALB／c小鼠后腿胫骨前肌注射免疫,于0、4、8周共免疫3次,100μg/次。免疫后不同时间检测体液和细胞免疫应答指标。结果 4种重组质粒酶切出相应大小的片段,经测序证实为CVB3序列,Western blot证实能够在体外真核细胞中表达。pcDNA3/vp2、pcDNA3/VP1、pcDNA3/2A和pcDNA3/3D均可诱导小鼠产生相应的特异性抗体、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和淋巴细胞增殖反应、迟发型超敏反应（DTH）,并对致死量的CVB3m、CVB5和CVB2攻击具有保护作用,表现为病毒攻击后第3天血中病毒滴度降低,第10天心肌病理变化比对照组明显减轻,且小鼠生存率显著提高。其中以pcDNA/VP1和pcDNA3／3D组保护作用最明显。结论 CVB3结构蛋白VP1和非结构蛋白3D质粒DNA有可能用作CVB DNA疫苗的候选基因,值得进一步深入研究。     

柯萨奇病毒B组3型2B蛋白诱导细胞自噬及其基序鉴定

目的 探讨柯萨奇病毒B组3型(CVB3) woodruff病毒2B蛋白对细胞自噬的诱导作用,及其自噬相关基序的鉴定.方法 分别构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与CVB3 woodruff病毒2B蛋白及其9种截短蛋白的融合蛋白(EGFP-2B、EGFP-2B1-249、EGFP-2B1-201、EGFP-2B1-153、EGFP-2B1-105、EGFP-2B1-57、EGFP-2B106.201、EGFP-2B106-249、EGFP-2 B205-297、EGFP-2B106-201)真核表达载体,红色荧光蛋白(mCherry)与微管相关蛋白轻链3(LC3)的融合蛋白真核表达载体pmCherry-LC3;应用激光共聚焦与蛋白质免疫印迹(Western blot)检测病毒2B蛋白对宫颈癌细胞(HeLa) LC3表达的影响;荧光显微镜观察9种截短蛋白在HeLa细胞中的表达;Western blot检测pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249转染细胞后LC3的表达;观察自噬抑制剂3-甲基腺苷(3-MA)处理后,pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249诱导细胞自噬的情况.结果 CVB3攻击HeLa细胞后,mCherry-LC3呈现细胞核周点状聚集表达,Western blot检测出现清晰LC3-Ⅱ条带;pEGFP-2B与pmCherry-LC3共转染后也可见细胞核周围绿色荧光与红色荧光均成点状聚集并相互重叠,且LC3-Ⅱ条带明显;9种截短融合蛋白质粒分别转染HeLa细胞后,其中可见细胞核周围绿色荧光点状聚集的最短截短蛋白为EGFP-2B106-249;pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249转染细胞后可检测出现清晰LC3-Ⅱ条带;3-MA处理后,pEGFP-2B和pEGFP-2B106-249分别与pmCherry-LC3共转染的细胞均未见绿色和红色荧光的核周点状聚集.结论 CVB3 woodruff病毒2B蛋白可以诱导宿主细胞发生自噬,其中截短蛋白2B106-249是病毒蛋白2B诱导HeLa细胞发生自噬的功能基序.     

乙肝免疫球蛋白不能阻断乙肝病毒感染人绒毛膜癌细胞

目的: 观察不同浓度乙肝免疫球蛋白(HBIG)在体外对乙肝病毒(HBV)感染人绒毛膜癌细胞系JAR细胞的影响。方法: 实验分为HBIG实验组、空白对照组(胎牛血清)、阴性对照组(健康人血清)。HBIG实验组又分为高浓度HBIG组(HBV+10³IU/L HBIG、HBV+10² IU/L HBIG)、最低保护浓度HBIG组(HBV+10 IU/L HBIG)、低浓度HBIG组(HBV+1IU/L、HBV+0.1 IU/L)和HBV组;采用MTT法检测HBIG对细胞生长的影响;采用实时荧光定量PCR检测细胞内HBV-DNA的表达;采用细胞免疫荧光染色法检测细胞内乙肝表面抗原(HBsAg)的表达变化。结果: (1) 不同浓度的HBIG对JAR细胞生长无影响;(2) 不同浓度HBIG组的细胞内HBsAg的荧光强度无显著差异(P>0.05);(3)不同浓度HBIG组的细胞内HBV-DNA无显著差异(P> 0.05)。结论: HBIG不能阻断HBV感染体外培养的JAR细胞。     

减毒麻疹病毒联合拉米夫定体内抗鸭乙型肝炎病毒作用的研究

目的 观察减毒麻疹病毒与拉米夫定（3TC）联合用药在鸭体内抗乙型肝炎病毒的作用。方法 以感染鸭乙型肝炎病毒（DHBV）的广州麻鸭为实验动物模型,在感染后分别给予口服3TC、肌注麻诊疫苗和联合使用麻疹疫苗与3TC,并以无环鸟苷（ACV）口服作为用药对照组,肌注生理盐水作为病毒对照组。于给药前（T0）,给药第5天（T5）,第10天（T10）及停药第3天（T13）留取血清,采用斑点杂交方法测定DHBV DNA。结果 3TC组在T5和T13两点病毒量略有下降,但与T0比较,差异均无显著性（P＞0．05）;麻疹疫苗组在给药早期病毒量无下降,T13点时病毒量与T0比较有显著下降（P＜0．01）,与病毒对照组的同期比较,差异也有显著性（P＜0．05）;麻诊疫苗与3TC联合使用组在给药早期（T5）出现病毒量明显下降（与T0比较,P＜0．01）,其A值与有确定疗效的ACV组T5比较也无差异（P＞0．05）,停药第3天时的病毒量与给药前与病毒对照组同期比较,差异均有显著性（P＜0．01,P＜0．05）。结论 减毒麻疹病毒与3TC联合给药较单独给药对DHBV－DNA具有更早而持久的抑制作用。     

一氧化氮供体和他汀对B组柯萨奇病毒感染的实验研究

目的研究硝酸酯类和他汀类等一氧化氮（NO）供体的抗柯萨奇病毒B组3型（CVB3）的作用及其特点和机制。方法用TCID50和空斑形成实验测定CVB3的毒力；MTT法确定NO供体药物的无毒性浓度；利用细胞病变效应（CPE）抑制实验和空斑形成抑制实验分析NO供体药物对CVB3在HeLa细胞和ECV．304细胞中增殖的抑制作用；并分析硝酸甘油（GRIN）不同给药次数、NO浓度变化以及NO浓度与GTN对CVB3抑制效应间的相关性。结果硝酸酯类药物GTN、硝酸异山梨酯可明显抑制CVB3所致的CPE及空斑形成（P〈0．05），他汀类药辛伐他汀、洛伐他汀均未显示抑制CVB3所致的CPE（P〉0．05）；CVB3接种前预先与GTN作用、CVB3接种同时加入GTN两种条件下CPE抑制率差异无统计学意义（P〉0．05）；CVB3攻击后多次给予GTN的组间CPE抑制率差异无统计学意义（P〉0．05），但在CVB3攻击前不同时间点给予GTN的组间CPE抑制率差异有统计学意义（P〈0．05）；NO浓度与不同时间点给予GrIN的CPE抑制结果呈正相关（r=0．97，P〈0．01）。结论NO供体类药物硝酸酯类具有明确的抗CVB3感染作用，其抗CVB3增殖的作用与NO浓度呈正相关；他汀类药物在本实验条件下未观察到抗CVB3增殖作用，原因可能是细胞类型与他汀不匹配。     

减毒麻疹病毒在体内外对HBV的影响

目的     

乙型肝炎病毒preS1 多肽在大肠杆菌中的表达与纯化研究

目的　获得大量完整的重组乙肝病毒（ Ｈ Ｂ Ｖ）ｐｒｅ Ｓ１ 多肽纯品,以利于ｐｒｅ Ｓ１ 功能与免疫学性质的研究。方法　比较不同表达载体及不同的培养、诱导和纯化条件,最大限度地使表达产物免受大肠杆菌蛋白酶的降解。结果　分析不同长度ｐｒｅ Ｓ１ 基因在两种不同载体,两种表型宿主菌中表达产物的状况,可看出在ｐｒｅ Ｓ１ 第５６ 和６４ 位氨基酸之间存在两个 Ｅ．ｃｏｌｉ 蛋白酶切割点。用ｐ Ｑｅ９载体和 Ｍ１５（ｐ Ｒ Ｅ Ｐ４） 宿主菌, Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导１２ 小时以 Ｎｉ Ｎ Ｔ Ａ 琼脂糖柱在变性条件下纯化,能获得１０ ｍｇ／ Ｌ 以上具有良好免疫学活性的电泳纯ｐｒｅ Ｓ１ 蛋白。结论　缩短诱导时间、用一步法在变性条件下纯化表达产物可获得无明显降解的ｐｒｅ Ｓ１ 完整蛋白。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1“饵”载体的构建及在酵母中的表达

目的 构建乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1（ HBEBP1）真核表达载体,并在酵母细胞中进行表达.方法 以HepG2细胞来源的eDNA为模板,PCR扩增获得HBEBP1基因,克隆至pGEM-T载体.测序正确后双酶切pGEM-T-HBEBP1,回收目的片段并连接至酵母表达载体pGBKT7中,转化酵母菌AH109,在色氨酸缺陷型培养基（SD/-Trp/卡那霉素）上筛选阳性菌落后大量表达并提取重组蛋白,再进行SDS-PAGE和Western Blot分析.结果 成功构建酵母表达载体pGBKT7-HBEBP1,Western Blot结果显示重组蛋白表达产物存在于胞内,条带清晰、大小正确,相对分子质量约33 × 103.结论 利用真核表达载体在酵母细胞中成功表达HBEBP1蛋白,为研究HBEBP1蛋白的生物学功能奠定了基础.     

乙型肝炎病毒携带及感染患者硬膜外麻醉的效果研究

目的观察乙型肝炎病毒携带及感染者行剖宫产手术时应用硬膜外麻醉的临床效果。方法选取妇科产行剖宫产的乙型肝炎病毒携带者、感染患者及非HBV感染的孕妇各35例为研究对象,记为携带组、感染组和对照组。通过回顾性研究,记录三组患者实施硬膜外麻醉的临床麻醉效果及置管时的出血情况。结果三组研究对象在麻醉起效时间、麻醉完善时间、麻醉效果、低血压发生率、心率减慢发生率差异无统计学意义（P〉0．05）。HBV感染组与HBV携带组的置管出血率均高于对照组（P〈0．05）,但HBV感染组与HBV携带组的置管出血率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论对HBV携带及感染患者行剖宫产时,应用硬膜外麻醉,其麻醉效果与未感染HBV正常人麻醉效果基本相同,但HBV携带及感染患者置管出血率高于常人,应引起临床重视。     

靶向核糖核酸酶在体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究

目的 观察HBV靶向核糖核酸酶(targeted ribonuclease,TR)的体外抗病毒作用。方法 将包含HBV核心蛋白(HBVc)和人类嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(hEDN)编码基因克隆入pcDNA3．1(-)，构建HBV TR重组真核表达载体p／TR，构建包含HBV核心蛋白、人类嗜酸性粒细胞来源的神经毒素以及突变失活的HBV TR编码基因的重组真核表达载体p／HBVc、p／hEDN、p／TRmut(hEDN的Lysll3→Arg,失去其RNase活性)作为对照。脂质体转染p／TR、p／HBVc、p／hEDN、p／Trmut、pcDNA3．1(-)进入2．2．15细胞。转染后，RT-PCR证实转染基因的表达，通过观察转染细胞的形态核MTT法检测转基因表达的细胞毒性。用固相放免法测定转染细胞培养上清HBsAg浓度。结果 转基因在2．2．15细胞内都有表达，且对细胞无毒性。与空转染组相比，pcDNA3．1(-)/TR转染组HBsAg含量下降58％；对照各质粒无此变化。结论 TR在体外可以抑制HBV复制，同时对宿主细胞无毒性。TR可以作为一种新型的抗病毒制剂治疗乙肝病毒感染。     

乙型肝炎病毒对载脂蛋白A1表达的影响及其机制探讨

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)对载脂蛋白A1( ApoA1)表达的影响及其调节机制.方法 RT-PCR和Western blot检测HepG2和HepG2.2.15中ApoA1 mRNA和蛋白的表达,全自动生化分析仪检测HBV患者和健康对照者ApoA1和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)血清学水平,SPSS13.0分析其统计学差异;将HBV感染性克隆pHBV1.3与ApoA1基因启动子共转染HepG2细胞,并测定荧光素酶的活性;RT-PCR和Western blot检测HepG2细胞转染pHBV1.3后ApoA1 mRNA和蛋白表达的变化.结果 HepG2.2.15细胞中ApoA1 mRNA和蛋白的表达水平较HepG2低;ApoA1和HDL-C在乙型肝炎感染者血清学水平明显低于健康对照组(P＜0.05);pHBV1.3在HepG2细胞中抑制ApoA1启动子活性、mRNA和蛋白表达.结论 HBV能够在体内外抑制ApoA1的表达.