两步法从CD34+造血干细胞诱导树突状细胞

目的：研究如何从有限的造血干细胞获得大量的树突状细胞（DC），为进一步研究树突状细胞的生化特性及临床应用提供技术支持。方法：利用免疫磁珠法（MACS）富集CD34^ 细胞，先在培养体系中加入FLT3配体（FL）、血小板生成素（TPO）及干细胞因子（SCF）等细胞因子，然后对富集的细胞进行扩增，扩增后的细胞在GM－CSF和IL－4的作用下诱导7d，诱导后的细胞用流式细胞仪分析树突状细胞特征性表面标记CD1a。结果：两步法能够获得大量的DC，在第一步中用TPO／FL／SCF／IL－3／IL－6来扩增CD34^ 细胞能获得最多的DC。在相同的培养时间下（3周），两步法能扩增出274倍的DC，大大的超过了直接诱导的扩增倍数（24倍）。并且，随着培养时间的增长，DC的扩增倍数不断上升。结论：两步法能从少量的脐血CD34^ 前体细胞诱导扩增出大量的DC，为从病人动员的CD34^ 细胞诱导扩增DC用于临床提供了实验依据。     

慢性粒细胞白血病患者DC对细胞因子诱导的杀伤细胞细胞毒作用的影响

目的 观察慢性粒细胞白血病（CGL）患者树突状细胞（DC）对自身细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞毒的影响。方法 从CGL患者和正常人末梢血中分离单个核细胞（PBMC），用细胞因子（rhGM-CSF,rhIL-4和rHTNF-α)联合定向诱导培养DC。用CGL细胞抗原致敏DC，再将致敏的DC与CIK共同培养后，检测CIK对不同靶细胞的杀伤作用。结果 CGL患者和正常人的PBMC经细胞因子联合诱导培养后，DC占20．78％－56．0％。CGL患者的CIK和经CGL细胞抗原致敏的DC作用后的CIK，对自身白血病细胞的杀伤活性分别为56．0％和83．4％；正常人对照组则分别为30％和62％。经CGL患者CGL细胞抗原致敏的DC作用后的CIK, K562和SGC－7901的杀伤活性较未致敏的CIK活性低，而正常人对照组则无此现象。结论 从CGL患者的PBMC中能定向诱导扩增出DC。经CGL细胞抗原致敏的DC，能明显增强CIK对自身CGL细胞的杀伤活性。     

WT1多肽致敏树突状细胞诱导杀伤K562细胞实验研究

目的：研究来自健康人外周血单个核细胞的树突状细胞（DC）负载WT1多肽抗原，体外诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对K562细胞的杀伤作用。 方法： 应用重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4（rhIL-4）、重组人肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子，自外周血单个核细胞诱导扩增，培养出DC，使DC负载WT1多肽抗原。实验分3组，WT1多肽致敏DC为实验组A，未致敏DC为实验组B，单纯自体淋巴细胞未加DC激活为对照组C，观察CTL对K562细胞的杀伤作用。 结果： 培养出具有典型特征的DC，体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应。在效靶比为20∶1时，实验组A诱导的CTL对K562细胞的杀伤率为86.1%±26.8%；实验组B为47.1%±20.8%；对照组C为27.7%±15.3% (P＜0.05)。 结论： WT1多肽抗原致敏DC能促使CD8阳性淋巴细胞扩增，并诱导激活特异性CTL，对K562靶细胞具有明显的杀伤作用。     

HBsAg重组腺病毒转染的树突状细胞诱导BALB/c小鼠抗HBV免疫的研究

目的 研究HBsAg重组腺病毒转染的小鼠树突状细胞（DC）体内外免疫刺激活性和诱导小鼠抗HBV免疫的特点。方法 BALB／c小鼠的骨髓细胞体外扩增为DC，转染HBsAg重组腺病毒Ad-S或被HBsAg蛋白冲击后，流式细胞术分析DC的表型，混合淋巴细胞反应（MLR）检测DC的刺激活性；或与pcDNA3．1（＋）-S质粒分别免疫小鼠后，LDH法测定脾细胞CTL活性，放免法检测血清抗．HBs；流式细胞术分析体外自体MLR中及免疫后小鼠脾脏T细胞内细胞因子。结果 DC／Ad-S、DC／HBsAg和各对照组DC之间的表型和MLR差异无统计学意义，并均刺激TH和Tc分泌IFN-γ。DC／Ad-S免疫后2周能诱导比DNA疫苗更强产生IFN-γ的TH（P〈0．05），以及比DC／HBsAg和DNA疫苗更强分泌IFN-γ的Tc（均P〈0．01）和特异性CTL（P〈0．05，P〈0．01）。但DC／Ad-S和DC／HBsAg诱导的CTL反应及Tc分泌IFN-γ在免疫后4周均明显减弱，且诱导抗．HBs作用弱于DNA疫苗。结论 HBsAg重组腺病毒转染的DC比HBsAg冲击的DC及DNA疫苗能诱导更强的TH1/Tcl（Ⅰ型）细胞免疫和特异性CTL反应，是诱导抗HBV细胞免疫的有效刺激细胞。     

登革病毒促进人树突状细胞分泌TNF-α、IL-6、IFN-γ的动态观察

目的：研究登革病毒（DV）对人树突状细胞（DC）产生细胞因子的影响。 方法： 人外周新鲜血常规分离单核细胞，经细胞因子GM-CSF、IL-4诱导培养DC，形态学特征、细胞表型和淋巴细胞刺激能力鉴定。用登革病毒2型感染DC，于作用后6、12、24、48、72 h分别收集上清液和细胞，间接免疫荧光法检测细胞上病毒抗原表达，ELISA法检测登革病毒感染后细胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ水平的动态变化。 结果： 人外周血经GM-CSF、IL-4诱导培养1周即可得到典型树突状细胞。间接免疫荧光法证明感染的DC胞浆和胞膜上携带登革病毒抗原，DV感染使DC分泌TNF-α、IL-6能力显著大于对照组（P<0.01），但其分泌IFN-γ的能力无明显改变。 结论： 树突状细胞是登革病毒的靶细胞，登革病毒感染可促进树突状细胞分泌TNF-α、IL-6。树突状细胞可能参与机体抗登革病毒感染的免疫防御机制。     

人胸腺基质淋巴生成素的研究进展

人胸腺基质淋巴生成素（hTSLP）是一种结构类似IL-7的新型细胞因子。正常情况下其mRNA主要表达于基质细胞、上皮细胞和肥大细胞，病理状态下，TSLPmRNA在一些前炎症细胞因子的作用下表达增加。hTSLP直接作用的效应细胞主要是树突状细胞（DC），通过调节DC的成熟来发挥作用。一方面，hTSLP-DC在外周能够诱导初始T细胞向一类特殊的Th2细胞分化，从而启动炎症反应；另一方面，hTSLP—DC能够促进胸腺中CD4^＋CD25^-T细胞分化成CD4^＋CD25^＋调节性T细胞，从而在免疫耐受的发生和调控中发挥作用。     

树突状细胞在实验性变态反应性脑脊髓炎免疫耐受时对细胞因子的影响

目的研究树突状细胞（DC）在实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）免疫耐受时对细胞因子的影响。方法建立EAE组、对照组和耐受组模型，采用混和淋巴细胞反应（MLR）检测各组脾脏DC培养上清液刺激淋巴细胞增殖的能力，采用ELISA双夹心法测量各组脾脏DC培养液中细胞因子水平。结果三组脾DC刺激淋巴细胞增殖能力的差异具有统计学意义，EAE组最强、EAE耐受组最弱。三组模型脾脏DC培养上清液的TNF-α、IL-10及IL-12水平每两组间进行比较，除了EAE组和对照组及EAE与耐受组之间比较IL—10水平没有统计学意义外，均有统计学意义。结论DC调控免疫反应及调节淋巴细胞的增殖可影响细胞因子分泌水平，可能在MS免疫耐受机制中起重要作用。     

香加皮羽扇豆烷乙酸酯(CPLA)对树突状细胞分化成熟的影响

目的：探讨香加皮羽扇豆烷乙酸酯（CPLA）对人外周血单个核细胞（PBMC）来源的树突状细胞（DC）在体外分化成熟及免疫活性的影响。方法：从人外周血分离单个核细胞，与细胞因子GM—CSF、IL-4共培养，于第5天加入DC的促成熟刺激剂TNF-α（阳性对照组）或CPLA。倒置显微镜和透射电镜下观察DC的形态；应用流式细胞术检测成熟DC的表面标志CD1a、CD83、CD80和CD86的表达情况；用ELISA检测DC培养上清中IL-12和IFN-γ的含量；用MTT法测定DC刺激T细胞增殖的能力。结果：培养10d后，经CPLA刺激的PBMC呈现出典型DC的形态学特征；成熟DC的特征性表面分子CD1a、CD83、CD80和CD86表达水平均明显上调（P〈0．05）；细胞培养上清中IL-12和IFN-γ含量明显增高（P〈0．05）；刺激T细胞增殖的能力明显增强（P〈0．05）。结论：CPLA可诱导PBMC来源的DC分化成熟，并可促进其细胞因子的分泌，增强DC的免疫调节活性。     

树突状细胞在抗HIV-1感染免疫预防与治疗中的应用

树突状细胞（DC）不仅是已知惟一能够激活初始T淋巴细胞的抗原提呈细胞，而且也是已知最强的抗原提呈细胞（APC），其对抗原的提呈能力远大于巨噬细胞。经抗原刺激的DC回输到体内后，能够迁移到淋巴结，释放多种细胞因子，同时激活T淋巴细胞的分化和分裂，产生抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL），这些细胞因子和特异性CTL能够有效地促进或直接杀伤表达该抗原的细胞。基于这个原理，利用HIV-1抗原刺激DC所诱导的免疫对HIV-1感染进行免疫预防和治疗的研究已取得初步进展；将高效抗逆转录病毒疗法（highly active antiretroviral therapy，HARRT）和DC免疫治疗相结合的方案也已成为治疗AIDS的较好方法之一。本文中将对近年来DC在抗HIV-1感染免疫预防与免疫治疗中的应用研究进展作一综述。     

转染HPV16E6基因人树突状细胞疫苗的制备及生物学特性

目的：制备来源于人外周血并转染HPV16E6基因的树突状细胞（DC）疫苗，检测其细胞形态、分子表型及诱导的免疫效应。方法：细胞因子扩增人外周血DC，Lipofectamine转染HPV16E6制备DC疫苗。动态形态学观察，免疫细胞化学及流式细胞术检测分子表达．体外诱导并测定CTL活性。结果：转染DC呈形态迥异的多突起状，其E6蛋白、CD80、CD86和CD83分子的表达率依次为47．3％、82．5％、79．8％和85．7％，诱导杀伤Caski细胞的活性明显高于对照组（P〈0．01）。结论：转染DC疫苗保持了功能成熟DC的形态特征，且内源性表达E6蛋白，能诱导高效的特异性抗肿瘤免疫应答。     

G-CSF 动员的外周血干细胞悬液冷冻保存后诱导培养树突状细胞的研究

目的：研究粒细胞集落刺激因子（G-CSF） 动员的外周血干细胞（PBSC）悬液中单个核细胞(MNC)冷冻保存后经不同诱导途径培养的树突状细胞(DC)的特性，探讨PBSC悬液冷冻保存后诱导培养DC的方法。 方法： 用两种保护液-80 ℃冷冻保存PBSC悬液，分析复苏MNC中CD34+细胞、CD14+细胞、CD14+PI+细胞，并分两种方法诱导培养复苏MNC: 贴壁细胞经粒细胞单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素4（IL-4）培养2周，培养结束前加入肿瘤坏死因子α（TNF-α）、布雷菲德菌素（BFA）；非贴壁细胞经酪氨酸激酶3配体（FL）、干细胞因子（SCF）、GM-CSF、IL-4培养1周, 再按前1种方法继续培养2周。培养结束后, 流式细胞仪分析DC特性。 结果： 两组复苏MNC与新鲜MNC比较：CD34+细胞含量均无明显差异(P>0.05)；而CD14+细胞少，CD14+PI+细胞百分率高（P<0.01）；贴壁细胞少，贴壁细胞诱导培养DC效果不佳；非贴壁细胞扩增诱导均能获得大量成熟的激活的能够分泌IL-12(p40)的髓系DC。 结论： PBSC悬液冷冻保存后能用于培养髓系DC，但培养方法应以扩增诱导为主。     

成熟DC固有胆碱能系统nAChRα7、ChAT和AChE及其调节的研究

目的：探讨成熟树突状细胞（dendritic cells，DC）是否存在非神经元性胆碱能系统及其调控机制。方法：分离正常小鼠骨髓细胞，体外用细胞因子（IL-4，GM-CSF）诱导、分化为DC，细菌脂多糖（LPS）刺激其成熟。光镜和流式细胞术进行DC鉴定。免疫荧光抗体方法、流式细胞术和RT-PCR方法进行DC烟碱样乙酰胆碱受体亚单位α7（nicotinic acetylcholine receptor subunitα7，nAChRα7）、胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase，CHAT）和乙酰胆碱酯酶（acetylchohnesterase，ACHE）检测。流式细胞仪检测神经节阻断剂美加明（meeamylamine，MEC）作用于成熟DC12小时nAChRα7的变化。结果：成熟状态DC表达nAChRα7、ChAT、AChE蛋白和时矾A。nAChRα7蛋白主要分布于细胞膜，ChAT和AChE分布于细胞浆。AChE表达最强，与ChAT比较（P〈0．05），nAChRα7表达量次之；MEC作用后nAChRα7蛋白明显下调（P〈0．05）。结论：成熟状态DC存在固有胆碱能系统通路物质，外源性因素（美加明等）可调节该通路。DC可能在胆碱能抗炎通路的免疫调节机制中发挥重要作用。     

脐血体外同时扩增造血干祖细胞、T细胞及树突状细胞

目的：探索体外同时扩增脐血中造血干祖细胞、T细胞及树突状细胞的可能性和最佳细胞因子组合方案。方法：采集健康正常足月产新生儿脐血，分离出单个核细胞，在不同的细胞因子组合作用下培养14天。培养于0、3、7和14天时收集细胞，用FCM分析扩增前后脐血CD34^＋、CD3^＋T及DCs细胞含量。结果：3组不同细胞因子组合实验组A：SCF＋IL-3，6；B：SCF＋IL-3，6，4；c：SCF＋IL-3，6，4（5X）均能显著扩增脐血中的单个核细胞和CD34’细胞，各组的CD34^＋细胞最高值出现在第7天，CD34^＋细胞平均增加倍数10—20倍不等。在扩增初期，各组CD3^＋T有所下降，7天时CD3^＋T细胞有不同程度的增加，14天时扩增最高的组别中CD3^＋T细胞是新鲜脐血的2倍。DCs标志CD1a、CDS0、CD83和CD86。在所有组别中培养3天时有所下降，第7天时在含IL4的组别中有显著上升，且CD1a和CD80表达高于CD83和CD86；14天时则有所回落。IL4对CD34^＋和CD3^＋T细胞扩增有一定促进作用。结论：脐血中T细胞、DC细胞在一定细胞因子组合下。可与CD34^＋细胞同时在体外被扩增和诱导分化。     

转染肿瘤总RNA的DC疫苗诱导抗肝癌特异性免疫

目的：探讨转染人肝癌总RNA的树突状细胞(DC) 疫苗体外诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的作用。 方法： 采用原发性肝癌（HCC）病人外周血单核细胞（PBMC），在粒/巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4) 刺激下增殖分化为DC细胞；从人肝癌细胞中体外扩增肝癌RNA。以HCCRNA转染DC细胞，并与PBMC混合培养诱导扩增CTL。MTT法测定CTL的杀瘤活性。 结果： 转染HCCRNA 48 h后， DC表面分子CD83、CD86和HLA-DR表达明显增高。转染HepG-2细胞HCCRNA的DC和病人HCCRNA诱导的CTL对HepG-2细胞和病人HCC细胞的杀瘤活性均明显高于正常肝细胞RNA+DC、脂质体+DC、Opti-MEM+DC以及空白对照组；而对胃癌SGC-7901细胞无杀伤活性。 结论： 以肝癌RNA为肿瘤抗原，DC作为疫苗的抗原提呈细胞，体外冲击致敏DCs，能诱导肝癌特异性CTL。本研究为HCC术后复发和转移的防治提供一种可能有效的疫苗治疗方法。     

CpG-ODN联合HBsAg体外对慢性乙肝患者外周血树突状细胞STAT、SOCS通路的影响

目的 研究含非甲基化CpG基序的免疫刺激寡核苷酸（CpG-ODN）联合重组HBsAg对慢性乙肝（CHB）患者外周血树突状细胞（dendritic cell，DC）表面标志、功能及胞浆信号传导与转录激活因子（STAT）、细胞信号转导抑制因子（SOCS）表达的影响。方法由CHB患者和健康者外周血单核细胞诱导扩增DC，以CpG-ODN或联合HBsAg刺激DC，并与TNF-α比较，评价其对DC表面标志、分泌IL-12 p70及刺激同种T细胞增殖能力的影响；应用Western blot法检测DC胞浆STAT1、3、4、5、6以及SOCS1、3蛋白的表达。结果与PBS组比，TNF-α、CpG-ODN或联合HBsAg能明显提高CHB患者DC表面分子HLA-DR表达，IL-12 p70分泌增加，刺激同种T细胞增殖能力增强，CpG-ODN联合HBsAg还能明显提高CD1a的表达；CpG-ODN或联合HBsAg、TNF-α对DC胞浆STAT1、4、6和SOCS1、3的表达呈不同程度增强作用，对STAT3、5的表达无明显影响。结论CpG-ODN与TNF-α一样能促进CHB外周血DC分化、成熟；CpG-ODN或联合HBsAg能增强DC的特异性抗原提呈作用；其作用机制可能是通过调节DC细胞内STAT1、4、6以及SOCS1、3等信号蛋白的表达。     

SP2/0细胞膜抗原负载DC诱导体外特异性CTL效应

目的 研究SP2／0细胞膜抗原负载树突状细胞（DC）诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肿瘤细胞的杀伤活性。方法 密度梯度离心法分离SP2／0细胞膜，负载经rmGM-CSF和rmIL-4诱导扩增的小鼠骨髓来源的DC，活化T淋巴细胞获得肿瘤特异性CTL，MTT法检测对SP2／0细胞的杀伤效果。结果 骨髓单个核细胞在rmGM-CSF和rmIL-4作用下获得了高表达CDS0、CD86和MHC-Ⅱ分子的DC，致敏的CTL对SP2／0骨髓瘤细胞具有高杀伤率，显著高于对I5178Y淋巴瘤细胞的杀伤活性（P〈0．01）。结论 SP2／0细胞膜抗原负载DC能诱导明显的特异性抗肿瘤免疫应答。     

树突状细胞疫苗对慢性乙型肝炎的治疗作用

目的：探讨自体乙肝疫苗致敏的树突状细胞（DC）对慢性乙型肝炎（CHB）免疫治疗的作用。 方法： 取患者外周血20 mL分离单个核细胞，加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rGM-CSF）和白细胞介素4（IL-4）进行DC体外扩增，于培养第5 d加入50 mg/L乙型肝炎疫苗，7 d收获细胞。34例慢性乙肝患者根据年龄和发病时间分为治疗1、2、3组，皮内回输DC。对照组患者注射等量生理盐水，均每周1次，连续8次。于回输DC后2周检测患者血清乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）含量。 结果： 培养可得到形态及功能典型的DC，治疗1、2、3组患者回输DC后血清HBV-DNA拷贝数均显著低于对照组（P<0.01），总应答率58.8%（20/34），对照组输注前后没有明显差异（P<0.05）；治疗1组与3组相比HBV-DNA定量拷贝数降低幅度有显著差异（P<0.01），治疗1组与2组、2组与3组相比无显著差异（P＞0.05）。 结论： 经乙型肝炎疫苗致敏的DC回输患者后，其血清HBV-DNA含量明显降低，且降低幅度与感染病毒时间和/或患者年龄有一定关系。     

凋亡癌细胞抗原致敏IL-23基因转染的树突细胞抗肿瘤免疫反应的研究

目的：探讨IL-23基因转染的树突状细胞（DC）负载癌细胞抗原后诱导的免疫应答对小鼠胰腺癌细胞的抑制作用。方法：克隆并构建IL-23基因真核双表达载体，转染DC并负载肿瘤抗原后制备成疫苗。观察各组脾脏T淋巴细胞IFN-γ和IL-4的分泌量以及DC诱导的CTLs对胰腺癌细胞的杀伤作用。结果：基因测序证实IL-23基因克隆及双表达载体构建成功，转染后DC对共刺激分子MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达增强。接种IL-23修饰DC疫苗后小鼠的免疫防御能力显著增强；DC介导的免疫应答促进了IFN-γ生成型Thl细胞的产生，IL-23转染组IFN-γ的分泌与其他各组比较差异显著（P〈0．01）；IL-23转染组T细胞对抑制性细胞因子IL-4的分泌减少，与DC疫苗组和IL-23DC组比较有显著差异（P〈0．05）。转染的DC疫苗在体内诱导出高水平的CTLs活性（P〈0．05）。结论：IL-23使DC抗原递呈能力更强，IL-23修饰DC疫苗可强化宿主针对特异肿瘤的CTLs免疫应答，使宿主不仅产生防御性免疫反应而且增强自动免疫能力。     

糖基化修饰的DC疫苗特异性抗骨髓瘤活性的体外研究

目的：探讨经过糖基化修饰改造过的肿瘤相关糖抗原冲击树突状细胞（DC）制备的DC疫苗特异性抗骨髓瘤作用。方法：采用化学方法及肿瘤细胞的生物工程法使骨髓瘤细胞表达新肿瘤相关抗原N-丙酰多聚唾液酸（NPrPSA）；在无血清培养条件下，采用GM—CSF／IFN-α及TNF-α从MM患者外周血单核细胞诱导培养DC。然后用表达新抗原的肿瘤细胞冲击DC制备DC疫苗，将其刺激T细胞后，通过LDH释放法观察其对骨髓瘤细胞的杀伤效力，并采用ELISA法测定了T细胞分泌细胞因子IFN-γ的能力。结果：糖基化修饰的CD138^＋Npr—DC组LDH释放率较CD138^＋未修饰DC组明显增高（P〈0．01）。CD138^＋Npr—DC组T细胞分泌IFN-γ与CD138^＋未修饰DC组相比亦明显增加（P〈0．05），而CD138^＋Npr—DC组与CD138^-未修饰DC组之间无统计学意义（P〉0．05）。结论：糖基化修饰的DC疫苗可以有效地激活Th1细胞免疫应答，分泌高水平的细胞因子IFN-γ；可诱导出较普通DC疫苗更明显的抗骨髓瘤作用，并具有一定的安全性。     

TGFβ1基因转染对大鼠树突状细胞分子表型和细胞因子分泌的影响

目的：研究转化生长因子β1（TGFβ1）基因转染大鼠树突状细胞（DC）表面分子表达以及细胞因子分泌的影响。方法：构建TGFβ1重组真核表达质粒TGFβ1-pcDNA3，以脂质体Amine介导转染大鼠骨髓DC，经过Western blot、RT-PCR、免疫细胞化学以及免疫荧光染色检测转染效率，应用FACS和免疫细胞化学等方法检测TGFβ1-DC分子表型以及细胞因子分泌的变化。结果：结果显示TGFβ1基因转染后可得到一定数量稳定的TGFβ1-DC，并获得有效TGFβ1的mRNA和蛋白表达。并发现TGFβ1-DC表面RT1B、B7-2、ICAM-1和OX62等分子表达均明显低于对照组，TGFβ1-DC分泌的Th2型细胞因子TGFβ1和IL-10的表达明显高于反义TGFβ1转染对照组，而Th1型细胞因子IL-12的合成则受到一定程度的下调。结论：TGFβ1基因转染可调节大鼠骨髓DC分子表型和细胞因子的分泌，增强DC的免疫耐受性，在器官移植治疗中有应用前景。