副粘病毒Tianjin株RT—PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立检测副粘病毒Tianjin株的RT-PCR方法,为临床标本的检测提供参考依据。方法根据副粘病毒Tianjin株F蛋白的基因序列,设计出一对特异性引物,以Tianjin株总RNA逆转录的cDNA为模板进行PCR扩增,然后对该方法的敏感性、特异性进行检测。并将该方法应用于临床84例下呼吸道感染患儿支气管肺泡灌洗液（BALF）标本的检测。结果通过此方法成功扩增出约500bp的预期条带。将Tianjin株鸡胚尿囊液（血凝效价为1：1280）稀释到320倍时仍可出现阳性条带,对新城疫病毒、甲型流感病毒鼠肺适应株、人副流感病毒Ⅰ型、柯萨奇病毒B3m株、单纯疱疹病毒Ⅰ型及鸡胚尿囊液的PCR检测结果均呈阴性。84例下呼吸道感染患儿BALF标本中,其中2例阳性,阳性率为2．38％,与本实验室建立的双抗体夹心ELISA法检测结果相接近。结论建立的副粘病毒Tianjin株RT—PCR检测方法是一种快速、灵敏、特异的方法,为患病儿童中Tianjin株感染情况的调查奠定了重要的基础。【     

一株致普通棉耳狨猴严重下呼吸道感染的副粘病毒种系进化分析

目的探讨副粘病毒Tianjin株的种系进化地位。方法将副粘病毒Tianiin株HN核苷酸、氨基酸序列与GenBank发布的副粘病毒相应序列进行比较，构建种系进化树，阐明副粘病毒Ti枷in株在副粘病毒科中的分类地位。结果基于HN核苷酸序列的种系进化分析表明，副粘病毒Tianjin株属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、呼吸道病毒属，与仙台病毒亲缘关系最近。Tianjin株与仙台病毒BBl株HN核苷酸、氨基酸序列同源性分别为94．8％、95．1％，与其他仙台病毒，在84．8％～88．7％和89．6％～91．7％之间。Tianiin株与BBI株HN核苷酸序列的差异明显大于同一进化分支内的仙台病毒之间的差异。Eanjin株HN蛋白存在18个独特的氨基酸残基变异。结论结合种系进化分析结果、病毒的宿主来源和致病特点，提示副粘病毒Tianjin株不属于仙台病毒现有的3个进化分支而自成独立的一支。     

副粘病毒F蛋白HR1和HR2在特异性膜融合中的作用

目的了解副粘病毒融合蛋白（F）分子上的七肽重复序列（HR1、HR2）在特异性膜融合中的作用。方法采用基因定点突变方法，在新城疫病毒（NDV）F与人副流感病毒（hPIV）F基因上创造相同的酶切位点。酶切后采用基因重组方法将F的HR1基因片段相互交换，得到交换HR1的两个嵌合体（chimera），即NDVC-HR1和hPIVC-HR1。用同样的方法又得到交换HR2的两个嵌合体。即NDVC-HR2和hPIVC-HR2。将各种嵌合体DNA与同源及异源HNDNA共转染BHK21细胞后，在真核细胞中表达。Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能，荧光强度分析（FACs）检测F蛋白的表达效率。结果交换HR1后，NDVC-HR1的融合功能只有野毒株的53．91％，hPIVC-HR1的融合功能达到野毒株的83．15％；交换HR2后，NDVC-HR2的融合功能略高于野毒株，达到野毒株的107．23％，hPIV C-HR2的融合功能却只有野毒株的12．01％。FACS分析表明，交换HR1后的NDVC-HR1和hPIVC-HR1的表达效率均下降。交换HR2后，NDVC-HR2的表达效率没有改变，而hPIVC-HR2的表达效率下降。结论NDVF的HR1对其特异性膜融合具有重要作用，而HR2则没有病毒特异性；hPIVF的HR1和HR2对hPIV的特异性膜融合都有重要作用。     

风疹病毒JR23株E1包膜糖蛋白的基因克隆与序列分析

目的：建立风疹病毒包膜糖蛋白E1的克隆载体，研究E1基因变异情况，并对其序列进行系统发生树分析。方法：利用RT－PCR方法扩增并回收风疹病毒JR23株的包膜糖蛋白E1的基因片段，将其与PMD－18T载体连接，经氨苄青霉素筛选，酶切鉴定，以获得风疹病毒E1蛋白基因的克隆，将此基因测序后，利用DNASTAR和WINSTAR软件包绘制系统发生树进行序列之间的比较分析。结果：筛选出含有风疹病毒E1蛋白基因的克隆，序列分析及发生树的绘制表明：JR23株与日本TCRB株及英国THOMAS株差别最小，分别为0．9％和1．2％，与北京BRD2株及香港XG379株差别最大，分别为7．6％和7．3％，与其它各株的差别均小于3％（除NC株为3．7％外），系统发生也与THO－MAS株、TCRB株最近，与BRD2株最远。结论：克隆载体的建立为进一步研究E1基因与糖蛋白功能的关系提供基础。系统发生表明中国不同地区风疹流行株基因序列存在明显差异，这对风疹病毒遗传与变异，分子流行病学研究，以及制备有效的亚单位疫苗提供了资料。     

1型星状病毒上海分离株基因组序列测定及分析

目的 了解上海地区腹泻患儿感染的星状病毒基因组分子结构特点和基因型.方法 用RT-PCR方法分段扩增星状病毒基因组,克隆于pMD18-T载体上,测定序列并拼接,用MEGA、DNAStar软件对所得序列进行分析.结果 本次分离株基因组全长6807 bp,命名为HAstV-SH,提交到GenBank上的序列号为FJ375759,有3个开放阅读框架,非结构基因ORF1a、ORF1b共长4290 bp,位于基因组83～4372 nt之间;编码结构蛋白的ORF2基因全长2364 bp,位于基因组4764～6727 nt之间.与GenBank中星状病毒ORF2基因组序列同源性比较发现,HAstV-SH与1型星状病毒核苷酸同源性最高(97%),与其他基因型的同源性为63%～70%.结论 上海地区儿童感染的星状病毒HAstV-SH属于1型星状病毒,与日本分离株AB009985亲缘关系较近,氨基酸同源性为97.5%.     

日本立克次体ompB蛋白基因克隆及序列分析

参照立氏立克次体分子量为１２×１０＾４蛋白基因序列合成引物，分两段扩增日本立克次体的１２×１０＾４蛋白基因，扩增ＤＮＡ的长度分别为２．５和２．６ｋｂ。含有启动子区的２．６ｋｂ片段在ｐＵＣ１９质粒中不稳定。从这段ＤＮＡ删去启动子及８５个氨基酸编码子区的扩增产物可被克隆。     

北京地区人偏肺病毒融合蛋白F编码基因的序列分析

目的进一步了解北京地区人偏肺病毒（hMPV）编码基因的特征。方法在原先工作的基础上，从分属于hMPV的两个不同基因进化簇（即基因型）的两份临床标本BJ1816和BJ1887中扩增F蛋白全基因，克隆至pBS-T载体中并进行测序，与GenBank中hMPV的基因序列进行比较分析和种系进化分析。结果BJ1816和BJ1887的F基因全长均为1620个核苷酸，编码539个氨基酸。BJ1816和BJ1887F蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为83．8％和94．4％，与同一基因簇内的hMPV有相当高的氨基酸同源性（98．3％～99．6％）。BJ1816和BJ1887的F蛋白是典型的I型糖蛋白，具有与迄今已发现的hMPV相同的裂解位点（RQSR）。BJ1816和BJ1887之间F2亚单位的氨基酸同源性高于F1亚单位的同源性（96．9％vs93．8％）；除位于羧基末端的跨膜区和胞质尾区外，F1亚单位的其余部分较保守（95．4％）；糖基化位点保守。种系进化分析显示BJ1816和BJ1887属于不同的进化簇。结论F蛋白的序列分析进一步证明BJ1816和BJ1887分属于不同的基因型，其F蛋白的基因特征与其他国外文献中所报道的hMPV相似，是病毒的膜表面糖蛋白，提示其在病毒的感染与免疫中起到重要的作用。     

可溶性CD8α链基因克隆及序列分析

可溶性 CD8抗原(sCD8)是从 CD8~ 细胞分泌或脱落至细胞外的白细胞分化抗原,sCD8与免疫调控和再生障碍性贫血等疾病有着密切关系。为从膜 CD8抗原基因中获得具有编码可溶性 CD8分子的基因,我们以 CD8抗原复合体分子的主要亚基α链基因为改构对象,采用逆转录重组 PCR 方法,在基因扩增的同时进行 DNA 重组拼接,除去编码 CD8α链穿膜序列的 DNA,从而克隆出 sCD8α链基因,并对重组的sCD8α链基因进行了序列分析.sCD8α链基因的克隆为进一步研究其表达及可溶性 CD8抗原在免疫调控中的功能奠定了基础.     

西安地区一株TT病毒的基因克隆及序列分析

目的 对TTV阳性扩增产物进行克隆及测序,以了解西安地区TTV基因及基因结构的特点。方法 采用巢式PCR从转氨酶活性异常增高的患者血清中,得到TTV阳性扩增产物,将其插入pGEM-T easy载体,进行克隆及序列分析。结果 获得1个pGEM-TTV重组载体。序列分析表明,插入片段为196bp。该序列与AF065400株等对应位置的核苷酸同源性分别为：AF065400（中国株）94．9％、AF351132（中国株）98．0％和NC－002076（日本株）99．0％。结论 西安地区TTV阳性扩增序列与报道的AF065400株、AF351132株和NC－002076株的序列具有高度的同源性,属同个基因型别。     

5株呼吸道合胞病毒地方株F蛋白基因序列分析

目的呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）Ｆ蛋白是ＲＳＶ感染免疫中最重要的病毒蛋白，为了解我国ＲＳＶ地方株Ｆ蛋白的基因状况和变异特征，随机选取北京、广州、长春和河北四个地区具有不同流行特征的ＲＳＶ地方株（Ａ亚型）５株，进行ＲＳＶＦ蛋白全基因的核苷酸序列分析。方法以提取的病毒ｍＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增、目的基因的克隆及序列测定，对地方株及原型株的序列进行比较分析。结果地方株Ｆ蛋白基因与原型株Ａ２株有很高的同源性，核苷酸全序列的同源性为９５．１％～９６．１％，氨基酸同源性为９６．７％～９７．４％。核苷酸有义突变率为２２．６％～２５．９％。３非编码区的核苷酸序列比蛋白编码区变异显著。河北地方株（Ｅ７３株）在３非编码区有６个核苷酸的插入。Ｆ２亚单位的氨基酸变异高于Ｆ１亚单位。在北京地方株（ＺＨＳ１３株）Ｆ１亚单位内，由具有中和能力单克隆抗体所识别的抗原表位区中存在一个氨基酸的变异。结论我国ＲＳＶ地方株与原型株之间的Ｆ蛋白基因尽管存在一定的变异，但仍有很高的同源性。地方株间Ｆ蛋白的核苷酸、氨基酸变异的位置及形式很相似，提示我国ＲＳＶ的不同流行特征可能并非由于Ｆ蛋白的基因变异所致。     

Molecular cloning and sequence analysis of the duck enteritis virus UL5 gene

Duck enteritis virus (DEV) is a herpesvirus that causes an acute, contagious, and fatal disease. In the present article, the DEV UL5 gene was cloned and sequenced from a vaccine virus. According to the consensus sequence of herpesvirus UL5 and UL3 gene degenerate oligonucleotide primers were designed and were used in the polymerase chain reaction (PCR) to amplify DNA products with 4577 bp in size. DNA sequence analysis revealed a 2568 bp open reading frame (ORF) encoding a 855 amino acid polypeptide homologous to herpesvirus UL5 proteins. The DEV UL5 gene has a base composition of 769 adenine (29.95%), 556 cytosine (21.65%), 533 guanine (20.76%) and 710 thymine (27.65%). Sequence comparison revealed that the nucleotide sequence of the DEV UL5 gene was highly similar to other alphaherpesviruses. Phylogenetic tree analysis showed that the fifteen herpesviruses viruses analyzed fell into four large groups, and the duck enteritis virus itself branched and was most closely related to meleagrid herpesvirus 1, gallid herpesvirus 2 and gallid herpesvirus 3 subtrees.     

Molecular analysis of structural protein genes of the Yamagata-1 strain of defective subacute sclerosing panencephalitis virus. IV. Nucleotide sequence of the fusion gene

The full-length cDNA corresponding to the mRNA of the fusion (F) protein of the Yamagata-1 strain of subacute sclerosing panencephalitis (SSPE) virus was cloned, and its complete nucleotide sequence was determined. The F gene was composed of 2369 nucleotides and contained a single large coding region, which is located between two noncoding regions. The 5-terminal noncoding region consisted of 584 nucleotides comprising 44.9% cytosine, and had several inverted repetitious sequences. The 3-terminal noncoding region had a relatively low homology of 91.7% with the MV. The coding region was expanded for nucleotides 585–2189, which encoded 534 amino acids with a molecular weight of 57,963. The homology of the amino acid sequence of the F protein between the MV and SSPE virus was 96.27%, and the positions of cysteine and proline were almost identical in the two viruses. The functional domains of SSPE-virus F protein closely resembled those of MV F protein, including the cleavage site, a signal sequence, the fusion-related stretch, the transmembrane region, and four potential glycosylation sites. Four antigenic epitopes on the MV F protein were also conserved on the SSPE-virus F protein.However, deletion of one nucleotide (position 2155) of the SSPE virus was found when compared with the MV, and shifted the coding frame, causing the substitutions of 27 C-terminal amino acids of the MV F protein with 11 different residues. The variations of the C-terminal region of the F protein were observed with two other SSPE viruses, suggesting that this may be a common property of SSPE virus that differs from MV.     

汉坦病毒ZJ5株M和S全片段的分子特性及序列的比较分析

目的 对浙江新分离的汉坦病毒疫苗后备筛选毒株ZJ5株的M和S全片段进行基因序列测定与基因分型,了解该毒株分子基础,并分析与其他病毒株以及20年前浙江分离的汉坦病毒ZIO、Z37疫苗株的差异.方法 提取汉坦病毒Z15株感染细胞总RNA,进行逆转录PCR扩增,产物纯化后克隆于T载体并测定序列.结果 扩增出ZJ5病毒M和S全片段并测定了序列,经对核苷酸和氨基酸序列分析表明,与汉城型(SEO)病毒有最高的同源性,为SEOV,但与国内外已知的SEOV核苷酸差异高达11.7%～19.2%和6.7%～14.5%;用M和S片段核苷酸序列所构建的系统进化树显示,病毒株分在SEOV发生群,与SEOV的Gou3株亲缘关系最近,但独自构成一进化支.结论 ZJ5株为一不同于现已报道的SEO型毒株的新亚型.     

两株登革2型病毒E、NS1蛋白基因序列测定及其系统发生分析

目的　对从登革出血热 (denguehemorrhagicfever,DHF)病人血清分离到的一株登革 2型病毒 (denguevirustype 2 ,DEN 2B株 )和DEN 2NGC株作E、NS1蛋白部分基因序列测定并进行系统发生树分析 ,了解其变异及分子进化特征。方法　利用RT PCR法扩增B株和NGC株E、NS1部分基因片段 ,PCR产物直接测序 ;利用DNAssist软件预测其氨基酸序列 ,以及PHYLIP软件的CLUSTAL方法绘制系统发生树。结果　B株与NGC株E蛋白基因区第 1～ 4 76nt( 4 76bp)碱基序列存在 8个位点的差异 ;编码氨基酸存在 4个位置的不同 ;NS1基因区第 5 89～ 10 0 2nt( 4 13bp)碱基序列存在 7个位点的差异 ,编码氨基酸有 2个位置的改变 ;B株与NGC株和DEN 2 4 4株E区部分片段核苷酸同源性分别为99 .1%和 98.7% ;与NS1区部分片段核苷酸同源性分别为 98.3%和 98.1%。B株E基因、NS1基因序列已登录GenBank ,注册号分别为AY179733和AY2 384 71。结论　B株E、NS1基因序列和氨基酸序列与NGC株存在差异 ;B株与我国海南 1989年流行的DEN 2 4 4株和NGC株系统进化关系较近。     

新分离登革2型病毒福建株基因组全序列的测定

目的 对新近分离的导致1999年福建省登热流行的登革2型病毒FJ－10株进行基因组全序列测定及系统发生树分析。方法 利用RT－PCR和5′、3′RACE法扩增FJ－10株cDNA,并进行克隆测序,利用DNASTAR折Clustal方法绘制系统发生树。结果 JF－10株基因组全长10723个核苷酸,有1个单一开放读码框架（ORF,第97－10269nt）,编码3391个氨基酸,5′和3′非编码区长度分别为96和454个核苷酸,通过与标准株NGC株和我国其他地区分离株DEN2－04、43、44株比较,核苷酸同源性分别为94.0%、92.8%、93.9%和93.9%,氨基酸同源性分别为97.9%、97.2%、97.7%和97.9%。以47株登革2型病毒E／NS1连接区240个核苷酸序列进行发生树分析,福建株与印度尼西亚和斯里兰卡分离株亲缘关系较近,同属第Ⅳ基因型。结论 FJ－10株基因组全序列一级结构与其他登革2型病毒类似,其基因型不同于我国其他地区分离株DEN2－04、43和44株。     

贵州省一例犬伤致人患狂犬病的病原学及病毒基因分析

目的 从病原学角度证实贵州省凯里市一起犬伤人致儿童死亡病例为狂犬病所致,了解狂犬病病毒的基因特征.方法 采用dFA实验初步检测犬和患儿脑组织狂犬病病毒抗原,以RT-nested PCR检测狂犬病病毒核酸,测定狂犬病病毒N基因全长序列,根据同源性比较及系统进化树进行分子流行病学分析.结果 dFA与RT-nested PCR检测显示犬脑和人脑组织标本均为狂犬病病毒抗原和核酸阳性.经测序拼接均得到长度为1353 bp的核苷酸序列,同源性分析显示犬脑组织(GZD)和人脑组织(GZH)检出的狂犬病病毒N基因核苷酸与推导的氨基酸同源性均为100％,与我国各省已报道的狂犬病病毒基因1型流行毒株及疫苗株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.4％～99.6％和98.2％～100％,与我省往年报道的毒株N基因核苷酸和推到的氨基酸同源性最高.此外,在与疫苗株的比较中,与CNT株的核苷酸和氨基酸同源性最高.进化树分析显示犬脑和人脑组织标本狂犬病病毒N基因亲缘进化关很近,同属于基因1型狂犬病病毒.结论 从病原学和病毒分子生物学证实了贵州省一起犬伤人致儿童死亡病例为狂犬病所致,其病原为狂犬病病毒基因1型,与疫苗毒株中的CNT毒株的亲缘进化关系最近,该起病例可能为我省境内传播,因此,应加强我省狂犬病疫区的防制工作.     

登革2型病毒海南分离株全长E基因的测定与分析

目的 测定我国登革2型病毒海南分离株E基因的全序列，并分析其病毒学特性和分子进化特征。方法 运用RT-PCR法扩增我国登革2型病毒海南分离株D2V—HN89)E基因，测序并用计算机分析序列，作毒株感染细胞及乳小白鼠试验。结果 D2V-HN89株E基因核苷酸全长1464bp，核苷酸和氨基酸序列与D2V—NGC株的同源性分别为95％和980A，系统树分析显示其与登革2型牙买加株及登革2型巴西90株的亲缘关系最近。D2V—HN89株的细胞病变效应与D2V—NGC株相同，但对乳小白鼠神经毒力较弱。结论 D2V-HN89株的E基因区有缺失，该流行毒株可能来源于牙买加或巴西登革热流行区。     

副黏病毒F蛋白融合活性位点中病毒特异性氨基酸基因突变分析

目的 了解副黏病毒融合蛋白(F)融合活性位点中的病毒特异性氨基酸在细胞融合中的作用.方法 以新城疫病毒(NDV)和人副流感病毒(hPIV)为例,在已确定的F蛋白融合活性位点中对病毒特异性氨基酸进行定点突变,然后将突变体F基因与同源或异源的血凝素.神经氨酸酶(HN)基因共转染BHK21细胞后,在真核细胞中表达.Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测F蛋白的表达效率.结果 在NDV F的突变体中,N150D-L152D的融合功能达到野毒株的46.31%;而N257D-N258D-Q259E、G271D-N272D和Q279E-Q281E的融合活性却几乎消失,分别只有野毒株的1.25%、3.14%和2.23%;N296D-N297D的融合功能是野毒株的97.68%.在hPIV F的突变体中,D143A-E145A的融合功能达到野毒株的32.63%;E223Q-K224A几乎不能形成合胞体,其融合活性只有野毒株的1.91%;K263A-R265A、D268A-D270A和R475A-R476A的融合功能分别是野毒株的14.63%、19.52%和28.95%.FACS结果表明,NDV F的N257D-N258D-Q259E、G271D-N272D和Q279E-Q281E突变体及hPIVF的E223Q-K224A突变体F蛋白在细胞表面几乎没有表达;其余所有突变体F蛋白的表达效率与野毒株相比,基本不变.结论 对于NDV F来说,N257、N258、Q259、G271、N272、Q279、Q281对NDV F的特异性细胞融合功能起重要作用;N150和L152也起一定的作用,但是N296和N297却没有作用.对于hPIV F来说,E223和K224对hPIV F的特异性细胞融合功能起非常重要的作用;D143、E145、K263、R265、D268、D270、R475、R476的作用也很重要.