B族链球菌表面蛋白LrrG的分段表达及其免疫原性和功能研究

目的研究LrrG蛋白不同片段的免疫原性及保护功能,为B族链球菌(GBS)蛋白疫苗及组分疫苗的研究奠定基础。方法采用生物信息学的方法预测LrrG蛋白的抗原表位,结合该蛋白的一级结构特征构建3个多肽片段(Gn、Gr、Gc)并重组表达;通过免疫动物及萃取组织液检测其免疫原性;体外调理吞噬试验检测各多肽片段的保护功能。结果成功构建和表达纯化了Gn、Gr、Gc多肽片段,且3个多肽片段均可在小鼠血清诱导产生较高水平的特异性IgG抗体,Gn免疫原性好于Gr、Gc。Gr、Gc 30μg剂量的免疫原性均好于其10μg和50μg剂量。除了Gr在肺、直肠组织产生的IgA抗体有较明显升高外,Gn、Gc对黏膜及血清IgA无明显刺激作用。体外调理吞噬试验表明3个多肽片段的抗体均具有促进吞噬细胞对GBS的吞噬功能。Gr、Gc的调理吞噬活性高于Gn,与B细胞表位预测结果相符。结论重组多肽片段均具有较强的免疫原性,在一定免疫剂量范围内,血清特异性IgG水平呈剂量依赖关系;皮下免疫对黏膜免疫影响不大;调理吞噬作用可能是LrrG蛋白具有保护作用的机制,3个多肽片段均具有潜在保护作用,支持将其作为GBS蛋白疫苗及组分疫苗的候选成分。     

5 型肺炎链球菌荚膜多糖与CRM197 蛋白结合疫苗的制备及免疫原性的研究

目的:研制5 型肺炎链球菌荚膜多糖(PN5PS)与白喉无毒突变体(CRM197)结合疫苗。方法:采用还原胺化 法制备结合物,即以肺炎5 型多糖的邻位羟基作为活化位点,用高碘酸钠进行氧化,形成的醛基与CRM197 蛋白上的氨基生成 席夫碱反应,在氰基硼氢化钠的作用下形成共价结合物,并将制备的结合物与两种不同铝佐剂吸附,用间接ELISA 法检测大 鼠血清中针对肺炎5 型多糖的抗体效价,比较结合疫苗与不同佐剂吸附前后的免疫原性。结果:当多糖活化度为7.3 时,总糖 及蛋白的回收率较高,游离糖含量较低,糖蛋白结合比在1.2 ~2.7 时结合疫苗具有较强的免疫原性,结合比为1.9 时结合疫 苗的免疫原性最强;结合物吸附磷酸铝佐剂后所产生的抗体水平略高于氢氧化铝。结论:通过还原胺化法制备的PN5PS-CRM197 结合疫苗具有较好的免疫原性。     

围生期新生儿B族链球菌感染

曹云教授受《中国循证儿科杂志》编辑部委托,在＂第三届上海国际新生儿医学论坛＂会议期间,很荣幸邀请到美国哈佛大学波士顿儿童医院Michael Wessels教授和上海市（复旦大学附属）公共卫生临床中心妇产科蒋佩茹教授就围生期新生儿B族链球菌（GBS）感染进行讨论。     

肺炎链球菌毒力蛋白在侵入性感染中的免疫原性评价

目的观察肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)及肺炎链球菌溶菌素(Ply)激发自然途径感染肺炎链球菌机体保护性体液免疫应答的情况,评价这三种毒力蛋白作为治疗性肺炎链球菌疫苗候选抗原的免疫原性。方法采集侵入性肺炎链球菌感染患者(实验组)及同期确诊为侵入性其它细菌感染患者(对照第一组)和同期确诊为非感染性疾病患者(对照第二组)各36例急性期(第0+3天)及恢复期(第21±3天)血清样本,酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中肺炎链球菌3种毒力蛋白抗原特异性抗体IgG水平变化。结果实验组与两组对照组间第(0+3)天血清的3种肺炎链球菌毒力蛋白特异性抗体水平无显著性差异(P>0.05)。第一组对照组恢复期较急性期血清中3种毒力蛋白特异性抗体水平无显著变化(P>0.05),而实验组恢复期血清3种肺炎链球菌毒力蛋白特异性抗体水平明显高于急性期血清抗体水平8～30倍(P<0.01),其中PspA和Ply蛋白抗原特异性抗体水平升高更明显,血清中针对PspA家族1(PspA-Faml)特异性抗体水平高于针对PspA家族2(PspA-Fam2)的特异性抗体水平(P<0.01)。结论 PsaA,P...     

A族链球菌表面蛋白Fba单克隆抗体的制备及其对应表位的初步鉴定

目的：制备抗A组溶血性链球菌（GAS）表面蛋白Fba（fibronectin-binding proteins a）的单克隆抗体（mAb）,并对单抗的生物学功能及其相应表位进行了初步鉴定。方法：以重组Fba蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术及间接ELISA筛选出针对Fba的杂交瘤细胞株,以Western blot鉴定mAb的特异性,并将获得的mAb与Fba＋GAS和Fba-GAS分别行全菌ELISA、与Fba的分段表达蛋白行Western blot,初步鉴定mAb针对的表位所在区域。结果：获得了稳定分泌抗Fba-mAb的杂交瘤细胞株,其中一株mAb能特异结合天然Fba＋链球菌,且该单抗针对的表位包含了Fba蛋白的第104-108位氨基酸,该位点也是链球菌Fba蛋白结合补体调节蛋白FH的位点。结论：成功地制备了抗GAS表面Fba蛋白的mAb,其中一株mAb对应的表位为位于菌体表面的天然表位,并检测出了该mAb对应的表位所在区段,这为深入研究GAS的致病机制提供了有力工具。     

Fba蛋白对化脓性链球菌结合FH和FHL-1的促进作用

A族链球菌（group A Streptococcus，GAS）在临床上存在着反复感染及难以治愈等问题。Cleary的研究证明，GAS可以侵入细胞而逃避攻击。Fba，是一种新型表面蛋白，由MI血清型GAS90．226分离株表达。以往研究资料显示，M1血清型GAS能通过其表面的Fba蛋白结合宿主补体旁路激活途径中协助工因子降解C3b的两种重要蛋白FH、FHL-1，并以此促进GAS进入上皮细胞，可能与逃避抗生素作用及免疫系统攻击有关。     

孕妇B族链球菌的检测及其临床价值

目的 探讨免疫层析法在检测孕妇B族链球菌(GBS)感染中的临床价值.方法 选取2014年12月至2015年12月间我院待产孕妇320例,各取2份阴道分泌物标本.1份用免疫层析法快速检测GBS;另1份用于接种THB培养基,第2天转至血平板,并对可疑菌落进行生化鉴定.同时对320例孕妇的妊娠结局进行随访.结果 免疫层析法检测出GBS感染41(12.81％)例,培养法检测出GBS感染36(11.25％)例,以细菌培养法为参考标准,免疫层析法的符合率为98.4％.通过临床跟踪随访,320例孕妇中有16例发生早产、胎膜早破等异常情况,其中有13例GBS阳性.结论 GBS与早产、胎膜早破等异常妊娠关系密切;免疫层析法较传统细菌培养法检出率无统计差异,且有步骤简单、省时等优点,适合应用于临床筛查GBS感染.     

A 族链球菌多价疫苗的完善制备及其动物免疫保护作用研究

目的:完善A 族链球菌(GAS)多价疫苗并探究其免疫保护效果。方法:构建GAS 的多肽疫苗F7M6,将其中的M6 多肽克隆作为对照,表达纯化后,将两种蛋白连同本室保存的GAS M1 蛋白分别免疫小鼠,末次免疫后10 d,半数小鼠行ELISPOT 检测IL-4 和IFN-β,ELISA 检测各组的IgG、IgG1、IgG2a;同时,以F7M6 蛋白为诊断抗原检测其与抗链“O冶阳性人血清的特异性结合;致死量的M1GAS 攻毒并计算存活率。结果:无论是诱导细胞免疫,还是诱导抗体产生,F7M6 组的水平均为最高;攻毒后F7M6 蛋白的生存率为66.7%。F7M6 蛋白检测抗链“O冶阳性血清的阳性检出率为95%。结论:GAS 的多肽疫苗F7M6 能诱导特异性细胞和体液免疫应答,对GAS 感染具有良好的保护效果,且F7M6 的多价表位涵盖于时下流行的大部分GAS 的血清型中。     

A族链球菌表面蛋白FbaA单克隆抗体FbaAmAb2的免疫功能研究

目的 通过侵袭抑制及攻毒试验检测A族链球菌表面蛋白FbaA的单克隆抗体FbaAmAb2的免疫功能,为进一步探索A族链球菌的致病机制和感染后的治疗策略奠定基础.方法 通过亚克隆、全菌ELISA方法筛选稳定分泌高效价FbaAmAb2的杂交瘤细胞,并将其接种子小鼠腹腔制备腹水.通过侵袭试验对FbaAmAb2能否阻止H因子与A族链球菌的结合进行研究.而后将获得的腹水倍比稀释为1:1、1:2、1:4、1:8、1:16行试管凝集试验,选定合适的稀释度被动免疫动物后用致死量A族链球菌(FbaA+)标准菌株(7.5×107个)攻击,连续观察15 d计算保护率.结果 侵袭试验中FbaAmAb2能够竞争性抑制H因子与A族链球菌表面蛋白FbaA的结合,减少了H因子介导的A族链球菌侵入上皮细胞的数量.与全菌结合的ELISA效价为1:1600,试管凝集效价为1:8.在单抗被动免疫试验中,腹水原液、1:2稀释组的动物保护率高达66.67％,1:4稀释组保护率为50％,经SPSS10.0统计软件分析各实验组与PBS组保护牢差异有统计学意义(P＜0.05).结论 FbaAmAb2有望用于紧急预防及治疗A族链球菌感染,并为深入研究A族链球菌的致病机制、治疗策略及疫苗预防方面提供新的靶标.     

妊娠晚期B族链球菌感染及干预措施对妊娠结局的影响

目的:探讨妊娠晚期孕妇B族溶血性链球菌(Group B streptococcus,GBS)感染情况,及产时预防性抗生素治疗对妊娠结局的影响.方法:对2018年3月至2020年3月本院行GBS筛查并最终分娩的1826例孕妇进行回顾性分析,其中GBS筛查阳性的66例为GBS阳性组,同期GBS筛查阴性的66例作为对照组;根...     

母B族链球菌定植致新生儿巨噬细胞相关细胞因子及免疫功能改变的研究

目的：探讨母B族链球菌(GBS)定植致新生儿巨噬细胞相关细胞因子及免疫功能改变的研究。方法：前瞻性选取2020年3月至2022年1月广州医科大学附属第二医院收治确诊为母GBS定植的新生儿43例(研究组)及同期健康新生儿40例(对照组)。对比两组巨噬细胞相关细胞因子及T淋巴细胞亚群水平、NK细胞水平。分析母GBS定植后新生儿的临床表现。结果：研究组CD3⁺T、CD19⁺T、CD3⁺CD8⁺T、CD4⁺/CD8⁺T、NK细胞水平均高于对照组,CD3⁺CD4⁺T低于对照组(P<0.05)。研究组患儿IFN-γ、IL-13、IL-4、IL-10水平均高于对照组(P<0.05)。研究组患儿血清巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、CXCL9、CXCL10、CCL3水平均高于对照组(P<0.05)。Person相关性分析显示,血清CD3⁺T、CD19⁺T、CD3     

荧光PCR体系检测B族链球菌的性能验证

目的对荧光聚合酶链式反应(PCR)体系检测B族链球菌(group B Streptococcus,GBS)的精密度、准确性和检测限进行验证。方法取1例GBS-DNA为阳性的临床样本重复扩增10次,以验证精密度;扩增20例结果已知的临床样本,将结果与实际结果比对,以验证准确性;将阳性对照参考品稀释至10^4CFU/mL,重复扩增10次以验证检测限。结果重复扩增10次的检测结果均为阳性,且所有通道的CT值变异系数CV<5%;20例标本的检测结果比对完全相符,符合率为100%;稀释到检测限的10次重复实验结果均为阳性。结论荧光PCR体系检测GBS结果稳定、可靠,适用于医学实验室对GBS的检测。     

B族链球菌表面蛋白C5a肽酶系统及鼻内黏膜免疫的研究

目的 研究B族链球菌表面蛋白C5a肽酶(streptococcal C5a peptidase,ScpB)系统及其鼻内途径免疫后在小鼠血清及肺、直肠、阴道等黏膜部位特异性抗体水平,探讨ScpB蛋白黏膜免疫应答的效果.方法 在大肠杆菌BL21中表达ScpB蛋白,亲和层析法进行纯化,质谱分析法对所纯化的蛋白进行鉴定.小鼠随机分为5组,每组10只.分别为对照组、皮下30μg组、鼻内5μg组、鼻内10μg组和鼻内30μg组.用ELISA法检测小鼠血清及黏膜萃取液中特异性抗体水平;调理吞噬试验检测SepB蛋白抗血清的保护性功能.结果 成功表达并纯化了ScpB蛋白;质谱分析和蛋白质库比较证实其为B族链球菌表面蛋白C5a肽酶的可能性分值为175;ELISA显示ScpB蛋白皮下30μg及鼻内不同剂量(5 μg、10 μg、30μg)免疫后均可诱发小鼠产生高水平特异性IgG抗体(P＜0.01),30 μg剂量组IgG大于5μg及10μg剂量组(P＜0.05);鼻内不同剂量(5μg、10μg、30μg)免疫后均可诱发小鼠产生高水平的黏膜特异性IgA抗体,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01);黏膜免疫组间无差异;30 μg ScpB蛋白皮下免疫后黏膜特异性IgA抗体与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).SepB抗血清对细菌具有调理吞噬作用,吞噬指数为12.3,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 B族链球菌表面蛋白C5a肽酶鼻内途径免疫小鼠后可在血清、肺及阴道、直肠等免疫近端和远端黏膜中产生相应高水平IgG及IgA抗体,上述ScpB抗体具有促进吞噬细胞吞噬B族链球菌的功能.     

应用免疫层析法快速检测孕妇生殖道B族链球菌的临床研究

目的 运用免疫层析法快速检测B族链球菌(GBS),研究其应用于妇女孕期GBS感染的临床价值.方法 通过与微生物鉴定培养法的结果进行对比,研究免疫层析法的灵敏度、特异性和符合率.结果 免疫层析法的灵敏度、特异性和符合率分别为100％、96.3％、96.8％.结论 该方法和传统培养法具有较高一致性,且简便、灵敏,适合在临床检验使用.     

肺炎链球菌蛋白疫苗候选蛋白研究进展

肺炎链球菌能够引起肺炎、脑膜炎、中耳炎等疾病,在世界范围内具有很高的致病率和致死率。患者主要集中在婴幼儿、老年人和免疫力低下的人群。据统计,每年大约有一百万的五岁以下儿童死于肺炎链球菌引起的疾病。抗生素是肺炎链球菌引起疾病最常用的治疗药物,但是,耐青霉素和多重耐     

肺炎球菌PsaA抗原及其在结合疫苗中的应用

目的 应用基因工程技术表达和制备肺炎链球菌表面黏附素A(pneumococcal surface adhesin A,PsaA),并与细菌荚膜多糖耦联制备成多糖蛋白结合疫苗,探讨PsaA作为肺炎球菌蛋白载体在增强结合疫苗中其他细菌多糖抗原的免疫原性的同时,还能获得对肺炎球菌的抗体反应,从而达到用一种结合疫苗能诱导出针对两种细菌的抗体免疫应答的目的 .方法 从肺炎链球菌基因组中扩增psaA基因,将目的 基因插入原核表达载体pET-28a,获得重组质粒pET28a-psaA,通过转化进入大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,采用DEAE-阴离子交换层析法纯化基因重组rPsaA蛋白.将纯化到的rPsaA蛋白与A群脑膜炎荚膜多糖(group A meningococcal polysaccharide,GAMP)耦联成多糖蛋白结合疫苗后,用小鼠动物模型进行免疫实验,检测该疫苗的免疫原性,用ELISA法测定该疫苗在小鼠体内产生的针对肺炎球菌和脑膜炎球菌两种病原菌特异性抗原的抗体水平.结果 成功克隆基因重组表达质粒,而且表达的PsaA蛋白在载体上的组氨酸标签之前终止表达,不带有组氨酸标签,保证疫苗的安全性.SDS-PAGE技术分析表明:rPsaA蛋白高效表达,约为菌体蛋白的60%,蛋白质相对分子质量约为37×103,而且蛋白的可溶性好,不形成包涵体,用DEAE-阴离子交换层析法纯化其纯度可达80%以上.纯化到的PsaA蛋白与荚膜多糖耦联成功,应用于小鼠免疫实验,PsaA蛋白载体能显著增强A群脑膜炎荚膜多糖抗原的免疫原性,并同时产生针对肺炎球菌蛋白抗原和脑膜炎球菌多糖抗原的特异性抗体.结论 利用基因工程技术获得无组氨酸标签的PsaA蛋白,并将它与A群脑膜炎荚膜多糖耦联,可以在增强荚膜多糖抗原免疫原性的同时,提高疫苗的免疫保护效果,探讨了给儿童接种一种疫苗能同时预防肺炎和脑膜炎两种传染病的可能性.

Abstract：

Objective To express and purify the pneumococcal surface adhesin A(PsaA) protein,discuss its application as a protein carrier in conjugates vaccine. Methods The gene encoding for the PsaA protein was amplified from the genomic DNA of Streptococcus pneumoniae using PCR. The PCR product was then cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a and the recombinant was transformed into host cell E. coli BL21 (DE3). The expression of the recombinant protein(rPsaA) was induced by IPTG and purifled by using DEAE anion-exchange chromatography. The rPsaA was successfully conjugated with group A meningococcal polysaccharide(GAMP). The mice were immunized subcutaneously with the conjugate and the immune responses against GAMP and PsaA were detected by ELISA. Results The recombinant PsaA was expressed as a 37 × 103 soluble protein without His-Tag. The rPsaA was successfully conjugated with GAMP. In addition to the immune response against PsaA, The antibody response against GAMP was significant improved in the mice immunized with conjugate vaccine in comparison with those immunized with GAMP alone. Conclusion The recombinant protein PsaA without His-Tag was obtained and conjugated with GAMP. The strong antibody responses against PsaA and CAMP were obtained in the immunized mice at the same time which may provide the protection against pneumonia and meningitis simultaneously.     

甲型副伤寒结合疫苗的制备及其免疫原性研究

目的 研制预防沙门菌属A组甲型副伤寒沙门菌感染的多糖蛋白结合疫苗。方法 通过对甲型副伤寒沙门菌尼泊尔株NTP-6的发酵培养，热酚水法提取脂多糖（LPS），酸水解脱毒，纯化出有效的型特异O-SP抗原；然后用CDAP对O-SP活化、ADH衍生后，在EDAC的缩合作用下，结合到破伤风类毒素TT上，制备出甲型副伤寒结合疫苗。用含2．5μg多糖甲型副伤寒结合疫苗免疫小鼠，以LPS为包被抗原，用间接ELISA法测定血清抗甲型副伤寒LPS IgG抗体；并测定血清多糖抗体的补体介导杀菌活性；在小鼠和豚鼠体内观察甲型副伤寒结合疫苗的安全性。结果甲型副伤寒结合疫苗第2次免疫NIH后，小鼠血清抗甲型副伤寒LPS IgG抗体平均几何滴度（GMT）均较第1次有4倍以上升高，第3次免疫后，有明显的加强效应；抗体的补体介导杀菌活性效价达1：1280以上；小鼠和豚鼠体内甲型副伤寒结合疫苗安全性良好。结论 成功建立了甲型副伤寒结合疫苗的制备工艺；制备的甲型副伤寒结合疫苗有良好的免疫原性，并具有明显的加强效应；刺激的血清多糖抗体有较高的补体介导杀菌活性效价；安全性达到人用生物制品相关要求。     

围产期孕妇生殖道B族链球菌感染和耐药情况及其对妊娠结局的影响

目的 分析围产期孕妇生殖道B族链球菌(GBS)感染情况以及对妊娠结局的影响.方法 收集2014年1月至2017年1月期间在我院进行产前检查的476例35～ 37周孕妇生殖道分泌物,通过实时定量PCR技术以及培养法检测B族链球菌感染情况,对分离培养出的GBS菌株进行药敏试验,并将实时定量PCR检测GBS阳性孕妇按不同治疗方案分为A、B两组,A组孕妇分娩开始即静脉注射敏感性抗生素直至分娩结束,B组孕妇在发现GBS阳性时即口服抗生素7d,其余治疗方法同A组,分析两组治疗方案孕妇妊娠结局.结果 476例孕妇围产期生殖道分泌物经实时定量PCR检测GBS阳性者148例,阳性率为31.1％,细菌培养法检测阳性者38例,阳性率为8.0％.分离培养的38株GBS对青霉素、万古霉素、利奈唑胺、红霉素、左氧氟沙星、克林霉素的耐药率为0％、0％、0％、23.7％、31.6％、52.6％.A组孕妇宫内感染、胎膜早破、早产以及新生儿感染发生率均高于B组孕妇,两组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 围产期孕妇生殖道GBS感染发生率高,GBS感染可导致宫内感染、胎膜早破、早产以及新生儿感染等不良妊娠结局发生率增加,GBS感染后采用敏感性抗生素预防治疗可以改善孕妇妊娠结局.     

A族链球菌表面新发现蛋白Fba真核表达质粒的构建及其诱导的免疫应答

目的：构建新发现的A族链球菌（GAS）表面蛋白Fba的真核表达质粒,并将其以及Fba蛋白、M蛋白分别免疫小鼠,对它们诱导的体液免疫及细胞免疫应答进行评价分析。探讨Fba蛋白作为GAS候选疫苗的可能性。方法：以SSI-9菌株（GASM1血清型标准株）作为模板,采用PCR方法扩增Fba基因,测序正确后克隆至真核表达质粒pcDNA3.1,构建真核表达质粒pcDNA3.1/fba;将雌性CD1小鼠随机分成6组,分别为Fba蛋白免疫组、M蛋白免疫组、pcDNA3.1/fba＋Fba蛋白免疫组、pcDNA3.1/fba免疫组、pcDNA3.1空质粒对照及PBS对照组。ELISA检测各免疫组血清IgG的动态变化水平;脾细胞增殖试验检细胞增殖水平,并用流式细胞术检测小鼠体内CD4＋、CD8＋淋巴细胞的变化。试验结果经SPSS10.0统计处理。结果：成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1/fba;质粒或蛋白免疫后小鼠IgG产生水平以Fba蛋白免疫组增高最为明显,其次为Fba质粒蛋白混合免疫组及Fba质粒组。特异性抗原诱导后体外脾细胞增殖试验显示：pcDNA3.1/fba免疫组增殖水平明显高于其它组,流式细胞检测结果与此一致,并显示以CD4＋T细胞水平升高为主,CD8＋T细胞水平在各组别之间也有一定的差异。结论：（1）Fba蛋白与M蛋白一样均能有效地诱导机体产生抗体,提示Fba蛋白很有希望成为GAS的候选疫苗。（2）成功构建了Fba蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1/fba,且该重组质粒能有效地诱导抗链球菌所需的抗体,并能增强CD4＋T细胞、CD8＋T细胞的增殖功能。