甲氧西林耐药葡萄球菌SCCmec研究

目的明确甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）和溶血性葡萄球菌（MRSH）所包含的葡萄球菌染色体mec盒（staphylococcal cassette chromosome mec，SCC mec）类型，并比较两者的差异。方法分别收集本院住院患者临床标本中分离的60株MRSA和88株MRSH。共设计10对引物，采用PCR法分别扩增mec复合体和ccr复合体的各个特征序列，分析其SCCmec类型。结果60株MRSA均为Ⅲ型SCCmec；88株MRSH中7株为V型SCCmec，1株为Ⅲ型SCCmec，其余均为新的组合或是无法分型。结论SCCmec在MRSA和MRSH中分布特点差别较大，MRSH中可能存在较多新的型别。     

ICU中MRSA耐药基因检测及其PFGE分型

目的对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株进行分子分型,探讨ICU中MRSA医院感染的特点和流行规律。方法采用表型筛选和PCR扩增mecA基因方法鉴定MRSA菌株。脉冲场凝胶电泳方法（PFGE）进行分子分型。结果12株金黄色葡萄球菌表型筛选为MRSA,MRSA产生A型、B型、C型和D型4种耐药表型,优势耐药模式是A型（75．0％）,MRSA对苯唑西林、阿莫西林／克拉维酸和氨苄西林／舒巴坦等10种抗生素产生100％耐药性,11株MRSA携带mecA基因,携带率为91．7％,PFGE指纹图谱分两型,分别为R1型和R2型,11株MRSA为R1型（91．7％）,R1型各株间相似度为100％。结论ICU可存在MRSA爆发流行,MRSA产生多重耐药性（MDR）,MRSA携带mecA基因可表现为MDR,PFGE分型是理想的分子流行病学溯源手段。     

多重PCR对金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因的检测

目的应用多重PcR检测含Panton-Valentine杀白细胞素（PVL）基因的金黄色葡萄球菌。方法收集我院2005年1月至2006年1月从临床多种标本中分离的金黄色葡萄球菌，用多重PCR同时检测葡萄球菌16SrRNA基因、mecA基因和lukS/F-PV基因。多重PCR检测MRSA的SCCmec基因型及亚型。结果195株金黄色葡萄球菌经多重PCR检测，121株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），74株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA），共检测到26株金黄色葡萄球菌lukS/F-PV基因阳性，阳性率为13．3％（26，195）。其中19株为MRSA，阳性率为15．7％（19／121）；7株为MSSA，阳性率为12．2％（7／74）。19株lukS/F-PV基因阳性的MRSA的SCCmec基因型分别为SCCmec Ⅲ型10株、SCCmecⅢA型4株、SCCmecⅣ型4株及SCCmecⅠ型1株。26株lukS/F-PV基因阳性的分离株有11株分离自脓液或创面分泌物，10株分离自痰标本，3株分离自血液标本，2株分离自尿液。结论在温州地区分离的MRSA和MSSA中都能检测到Panton-Valentine杀白细胞素基因，含Panton-Valentine杀白细胞素基因MRSA的SCCmec基因型主要为SCCmec Ⅲ，含PVL基因的金黄色葡萄球菌主要引起化脓性感染和肺部感染。     

耐甲氧西林金黄葡萄球菌高变区基因分型及其与耐药性的关系

目的 调查本地区耐甲氧西林金黄葡萄球菌(MRSA)的高变区(HVR)基因分型,分析HVR基因型与MRSA耐药谱的关系,并初步探讨其在分子流行病学分析中的作用.方法 收集80株MRSA,采用PCR方法扩增MRSA的HVR,并根据扩增片段大小进行基因分型.同时统计各MRSA菌株对多种抗菌药物的药敏结果,并分析基因型与耐药性的关系.结果 根据PCR产物片段大小,80株MRSA被分为A、B、C、D、E 5种基因型,其中以D和E型多见,分别占61.25%和21.25%,A(3.75%)、B(5.00%)、C(8.75%)型少见.各基因型MRSA除对万古霉素敏感外,对头孢唑啉、庆大霉素、红霉素、阿奇霉素、克林霉素、环丙沙星、复方新诺明、阿米卡星的耐药率为61.5%～100%.结论 MRSA的HVR基因分型是一种快速、简单、可靠的分型方法,适用于MRSA感染的流行病学调查,有利于抗菌药物的选用.     

特异性引物聚合酶链反应乙型肝炎病毒基因分型法的建立及应用

目的应用型特异性引物聚合酶链反应法（PCR）进行乙型肝炎病毒基因分型并分析该法的可靠性。方法应用型特异性引物PCR和INNO-LiPA分别对深圳、长春、北京152份HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者的血清标本进行了基因型分型，对该两种分型法不一致的血清标本再进行S区基因测序分型，以确定该两法的可靠性。结果型特异性引物PCR和INNO-LiPA的总符合率为86．8％（132／152），不一致率为13．2％（20／152）。型特异性引物PCR检测到81份（53．3％）B型；58份（38．2％）C型；13份（8．5％）B＋C型混合感染，未检出其他基因型或混合感染的基因型。INNO-LiPA检测到74份（48．7％）B型；61份（40．1％）C型；5份（3．3％）B＋C型混合感染；另检出3份（2．0％）A＋B型混合感染；1份（0．7％）B＋E型混合感染；1份（0．7％）C型与D型，1份（0．7％）D型感染，3份（2．0％）B／C／D型及3份未能分型。20份两法分型不一致的标本中，6份无剩余血清，对其余14份进行了S区基因测序分型，结果型特异性引物PCR与S区基因测序分型法的符合率为71．4％（10／14），而INNO-LiPA与S区测序法的符合率仅为7．1％（1／14），前者明显高于后者（P〈0．05）。结论型特异性引物PCR和INNO-LiPA均可鉴定HBV基因型，但前者较为简便和可靠，且费用较低，可用于临床标本的检测和流行病学调查。     

金黄色葡萄球菌毒力基因检测及分子分型研究

目的：研究湖北省黄州区人民医院于2011—2013年分离的488株金黄色葡萄球菌的分子生物学特征及毒力基因分布情况。方法采用琼脂稀释法测定苯唑西林和头孢西丁对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（ minimum inhibitory concentration ,MIC）, PCR方法进行SCCmec分型（ staphy-lococcal cassette chromosome mec）和多位点序列分析（multilocus-sequence typing, MLST）,多重PCR方法检测31个常见的毒力基因。结果488株金黄色葡萄球菌中共检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）227株,检出率为46．5％,227株MRSA 中 SCCmecⅢ型居多,占81．5％;其次为Ⅳ型,占10．1％。 MRSA菌株中,主要的克隆型为CC（clonal complex）8,占81．1％,其次为CC59和CC5,分别占4．8％和3．1％,261株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）中,主要克隆型为CC1,占34．1％,其次为CC398、CC121和CC59,分别占21．8％、14．9％和13．0％。109株MSSA（48．2％）同时携带≥15个毒力基因,明显高于MRSA菌株（28．2％,P＝0．002）,肠毒素基因（sed、sej和ser）的分布与CC8和CC5密切相关,表皮剥脱素基因（ eta, etb）和lukED基因仅在CC1中检测到,与其他CCs相比,CC1和CC59克隆中pvl基因检出率更高（P＜0．05）。结论本地区MRSA的流行率为46．5％,与全国平均水平基本一致,MRSA菌株主要流行克隆为ST239-MRSA-SCCmecⅢ型,占79．3％,医疗卫生部门应采取有效措施控制MRSA的传播。 MSSA菌株毒力基因检出率明显高于MRSA,并且不同的CCs克隆呈现不同的毒力基因谱,表明毒力基因的携带与遗传背景有关。     

乙型肝炎病毒基因型分型方法研究进展

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）引起的危害严重的传染病。HBV基因型与其危害程度有一定的相关性。目前有多种HBV基因型分型方法,包括核酸测序、聚合酶联反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）、单克隆抗体ELISA法、型特异性引物-PCR法、PCR做板核酸杂交-ELISA法、线性探针分析（Line probe assay,LiPA）基因分型法、实时定量PCR解链曲线分析（Real- time PCR and mehing curve analysis）等。这些基因分型方法在HBV的临床诊断和流行病学调查应用中各有优缺点。     

广州地区小儿无症状乙肝病毒携带者的基因型研究

目的：扩增HBV DNA S基因，建立HBV DNA的分型方法，研究广州地区小儿无症状乙肝病毒携带者（AsC）的基因型。方法：利用PCR－RFLP基因分型方法，扩增HBV DNA S基因，以限制性内切酶AvaⅡ、MboI酶切分型。结果：60份AsC血清样本，B型37份（62．7％），C型20份（33．3％），B、C混合型2份（3．3％），未分型1份（1．7％），经序列分析证明为C型，C型共35％。结论：PCR－RELP分型方法经济实用，分型率达98．3％，广州地区小儿乙肝病毒的基因型以B型和C型为主，其中携带者中B型占优势。     

婴幼儿耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染状况和耐药基因的研究

目的了解感染婴幼儿的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）耐药性和耐药基因,明确检测青霉素结合蛋白2a（PBP2a）和甲氧西林耐药基因（mecA）的临床价值。方法用金黄色葡萄球菌乳胶凝集试验和梅里埃鉴定金黄色葡萄球菌,同时用纸片扩散法完成12种常用抗生素的药敏试验。对头孢西丁的结果,按当年CLSI标准执行,用于判断菌株甲氧西林的耐药性。采用PBP2检测试剂盒检测PBP2a蛋白,PCR检测mecA基因。结果 2007-2009年婴幼儿共检出245株金黄色葡萄球菌,其中MRSA检出率为17.6%（43/245）。MRSA对庆大霉素、复方新诺明、克林霉素、红霉素、氯霉素的耐药性均显著高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（P〈0.05）,其余抗生素的差异无统计学意义（P〉0.05）,43株MRSA的PBP2a蛋白和mecA基因的检测结果全为阳性,阳性率为100%。结论用头孢西丁（30μg）能有效地筛查MRSA,检测PBP2a蛋白和mecA基因均能正确地确认MRSA。且检测PBP2a蛋白方便快捷,特异性好,值得临床推广。     

MRSA mecI基因和mec启动子的多态性研究

目的 本研究的目的在于也解上海地区分离耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MESA）中mecI基因和mec启动子的多态性分布状况。方法 收集上海地区分离的金黄色葡萄球菌143株，用头孢西丁纸片扩散试验、苯唑西林MIC（最小抑菌浓度）测定和mecA基因检测等方法进行MRSA的筛选，RAPD法进行细菌的同源性分析，最后通过PCR和序列分析技术研究分布状况。结果 头孢西丁筛选试验、苯唑西林MIC试验与mec4基因PCR扩增相比有100％的一致性，均证实这些菌株为MRSA，RAPD法证实这些菌株分为4个型，在21株菌中有20株有mecI基因，所有的菌株有mec启动区，所有MESA都有mecI或mec启动子的改变，其中mecI的改变有mecI缺失、mecI43位碱基G→T和mecI202位碱基C→T。mec启动子的改变有G→T和C→A。结论 mecI或mec启动子突变在临床分离的MRSA中普遍存在，上海地区MBSA以mecl 202位碱基突变最常见。     

肝移植术后耐甲氧西林金黄色葡萄球菌血流感染危险因素的17年回顾性分析

目的探讨本院肝移植术后耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）血流感染的危险因素及临床结果。方法回顾分析1993年1月至2010年5月肝移植术后血液MRSA阳性感染者的资料。结果 695例肝移植患者中,53例（7.6%）出现革兰氏阳性球菌血流感染,以肠球菌最为常见,7例病人发生7次MRSA血流感染。分析肝移植术后MRSA血流感染的危险因素发现,急性排斥（P=0.03）是出现MRSA血流感染的危险因素。肝移植术后MRSA血流感染与非MRSA血流感染的15d、30d、1年病死率差异无统计学意义。结论急性排斥是出现肝移植术后MRSA血流感染的危险因素,但肝移植术后MRSA血流感染后15d、30d、1年的死亡率未明显增加。     

基因芯片分型与实时荧光PCR筛查成都地区妇女宫颈HPV-DNA感染结果比较

目的了解成都地区HPV亚型的感染情况;评价基因分型（genotyping）与实时荧光定量PCR（real-time PCR）两种人乳头瘤病毒（HPV）检测方法的差异性,为临床应用提供参考。方法对2012年1月-2013年6月间来院就诊的女性,其中3537名进行基因芯片检测,991名进行实时荧光PCR检测。所得数据用SPSS 17.0进行统计分析。结果基因芯片分型法检测出阳性1315例,阳性率37.18%;实时荧光PCR检测出阳性137例,阳性率13.82%,两种方法检出率差异明显。基因分型法显示,HPV6、11、16、58、43型位居前五;荧光定量PCR显示HPV6、11、16、52、58在前五位。结论成都地区低危感染以HPV 6、11型为主,高危以16型为主,次之52、58型;基因芯片分型与临床HPV-DNA筛查检出率高,优于荧光定量PCR法。     

广州地区患儿流感嗜血杆菌分离株荚膜基因分型的研究

目的用PCR方法进行流感嗜血杆菌荚膜编码基因分型,调查儿童急性呼吸道感染患儿流感嗜血杆菌的感染情况。方法以流感嗜血杆菌荚膜编码基因（bexA）和荚膜分型编码基因（Hi-a、Hi-b）作为靶基因设计引物,用PCR方法扩增标准菌株为ATCC9006、ATCC49247、EQA0609的3个编码基因并测序,在此基础上对临床分离的43株流感嗜血杆菌进行荚膜基因分型研究。结果PCR结果显示标准菌株ATCC49247未扩增出bexA编码基因,ATCC9006扩增出bexA和Hi-a编码基因,EQA0609扩增出为bexA和Hi-b编码基因,并且PCR产物序列与GenBank公布的序列一致性高。临床分离菌株Hi未扩增出bexA、Hi-a及Hi-b编码基因。结论本实验研究表明广州地区儿童急性呼吸道感染患儿所分离的流感嗜血杆菌主要是不可分型的无荚膜菌株。     

顺序特异性引物聚合酶链反应技术对HLA-DR DNA的分型

目的：应用顺序特异性引物聚合酶链反应技术(PCR—SSP)进行临床肾移植供受者HLA—DR位点DNA的分型。方法：设计并合成HLA—DR位点16对特异性引物和1对阳性对照引物，建立PCR—SSP法，对52份临床肾移植供受者的外周血淋巴细胞样本进行DR位点基因的分型。结果与微量PCR—SSP基因分型试剂盒分型方法比较。结果：所有临床样本的PCR—SSP基因分型均获得成功，结果与微量PCR—SSP基因分型试剂盒分型方法完全相同，分型时间3h，特异性和重复性100％。结论：应用合成引物为临床肾移植供受者进行HLA—DR位点PCR—SSP基因分型简便快捷，重复性好，适合于临床应用。     

实时荧光PCR直接检测样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌应用研究

目的 探讨实时荧光PCR直接检测病人样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的应用价值.方法 对80例经VITEK2COMPACT药敏鉴定系统鉴定为有金黄色葡萄球菌生长(其中MRSA40例,MSSA40例)及20例未检出金黄色葡萄球菌的患者样本进行实时荧光PCR扩增,检测样本中金黄色葡萄球菌特异性核酸片段(耐热核酸酶基因nuc)及耐药基因(mecA)并与药敏鉴定比较,判断实时荧光PCR法检测MRSA的敏感性及特异性;对于两种方法检测结果不一致的18例样本重新接种培养,收集金黄色葡萄球菌菌株进行实时荧光PCR扩增,检测nuc基因及mecA基因,以期发现两种方法检测结果差异原因.结果 100例临床样本两种方法检测结果一致共82例,其中MRSA一致40例,MSSA一致22例,非金葡20例;两种方法检测结果不一致18例,均为PCR基因检测为MRSA而药敏鉴定为MSSA.MRSA检测药敏鉴定阳性40例,检出率为40％,PCR基因检测阳性58例检出率为58％;PCR基因检出率明显高于药敏鉴定,二者结果差异有显著性(P＜0.05);以药敏鉴定为标准,PCR基因检测MRSA的敏感性为100％,特异性为70％;18例金黄色葡萄球菌菌株实时荧光PCR检测MRSA结果与药敏鉴定一致.结论 实时荧光PCR直接检测患者样本中MSSA具有高度敏感性及特异性,但检测MRSA会受到样本中其他含有mecA基因菌的干扰,对于临床结果解释需慎重.即便如此,该方法对于MRSA检测在院感防控方面仍有重要意义.     

广州地区老年人肺炎链球菌临床分离株的青霉素耐药研究与分子分型

目的调查广州地区老年患者肺炎链球菌分离株对青霉素的敏感性，并分析其亲缘关系。方法K—B纸片法对33株分离自老年住院病人的肺炎链球菌进行青霉素药敏试验；应用PCR技术检测青霉素结合蛋白基因pbp1a，pbp2x，pbp2b；用盒式PCR（BOX—PCR）分析菌株间亲缘关系。用多位点测序分型技术（multilocus sequence typing，MLST）检测青霉素耐药菌株的分子分型。结果青霉素的耐药率为3．03％（1／33）：用PCR方法鉴定PSSP的准确率为68．75％；BOX-PCR可将这33株肺炎链球菌分为21型。MIST分型显示，青霉素耐药菌株属ST271型。结论广州地区老年患者肺炎链球菌对青霉素耐药率较低．用PCR方法检测PSSP有一定的可行性。BOX—PCR显示了较高的分辨率，能快速可靠地检测菌株间的亲缘关系。广州地区流行的耐药克隆与Taiwan^19F-14株同源。     

五味消毒饮联合红霉素对MRSA生物膜作用的初步研究

目的探讨五味消毒饮联合红霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的体外抑菌效果。结论用微量稀释法分别测定红霉素、五味消毒饮的最低抑菌浓度（MIC）及MRSA生物膜MIC（SMIC）,再用微量棋盘稀释法进行联合抑菌试验,观察五味消毒饮联合红霉素抗MRSA的作用。结果五味消毒饮、红霉素单独及联合检测时MRSA的最低抑菌浓度（MIC）和MRSA生物膜MIC（SMIC）分别为〉1000g/ml、8μg/ml、2μg/ml＋/1000g/ml和〉1000g/ml、32μg/ml、8μg/ml＋1000g/ml。结论五味消毒饮联合红霉素可增强对MRSA的抑菌作用,为临床MRSA的感染提供了新的治疗思路。     

3种分型方法在HLA-B分型中的应用分析

在人类白细胞抗原（Human leucocyte antigen，HLA）的多种分型技术中，以血清学方法、序列特异性引物．聚合酶链反应（Polymerase chain reaction sequence—specific primer，PCR-SSP）方法和多聚酶链反应-序列特异寡核苷酸探针（PCR—sequence—specific oligonucleotide probes，PCR—SSOP）杂交配型技术实用性较强。我们采用此3种方法同时对30份标本进行HLA—B位点进行分型和比较，报道如下：     

基因芯片法特异性检测丙型肝炎病毒的基因分型

目的：采用基因芯片特异性检测血清中丙型肝炎病毒（HCV）并进行基因分型。方法：设计HCV基因型特异探针，将其固定在玻璃片上制成微阵列芯片。阳性组血清60份，阴性组血清15份，乙型肝炎血清5份（抗HCV阴性）。经核酸提取，多聚酶链式反应（PCR）扩增，与芯片上的探针杂交，最后分析结果并与测序分型结果比较。结果：阳性组血清全部检测到HCV-RNA，均有基因芯片分型结果。基因芯片分型结果与测序分型结果一致者56例。阴性组血清HCV-RNA全部阴性。乙型肝炎血清全部阴性。结论：基因芯片可准确对HCV感染血清做定性检测并同时检测HCV基因型，简便快捷，特异性好，并且不需荧光标记和昂贵的荧光扫描仪器，与乙型肝炎血清无交叉反应。可替代基因测序分型，适于临床大量样品的检测。     

基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱仪快速鉴别甲氧西林耐药和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌的研究

目的：分析基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱仪（ matrix-assisted laser desorption／ionization time-of-flight mass spectrometry , MALDI-TOF MS）快速鉴别甲氧西林耐药和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。方法收集浙江大学医学院附属第二医院已保存的临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）25株和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）30株用于模型的建立。同时选取34株临床分离株（12株MRSA和22株MSSA）用做模型验证菌株。 MALDI-TOF MS对所有菌株进行鉴定,ClinProTools 3．0软件对MALDI-TOF MS鉴定细菌所产生的质谱峰图进行分析。结果 ClinPro-Tools软件的4种算法所得出的结果基本一致,灵敏度均大于95．0％,其中遗传算法（GA）的灵敏度最高（100．0％）;除监督式神经网络算法（ SNN）外,其余3种算法的特异性均大于90．0％。质荷比为3279、6485、6555和3299 m／z的质谱峰是用于区分MRSA和MSSA的最为主要的特征性峰。受试者工作特征曲线（ ROC）显示,这4个特征性峰的曲线下面积（ AUC）均大于0．9;凝胶浏览图显示,MSSA组的3279、6485、6555 m／z峰的蛋白强度高于MRSA组,而3299 m／z峰的蛋白强度低于MRSA组。外部验证显示,GA模型对MRSA组的准确鉴定率为83．3％,对MSSA组的准确鉴定率为90．9％。结论在严格控制实验条件的情况下,MALDI-TOF MS可快速准确地鉴别MRSA和MSSA,具有耗时短,灵敏性高,特异性高的优点。准确鉴定的同时区分MRSA和MSSA,尽早为临床防治MRSA提供参考依据,限制其传播及暴发流行。