γδT细胞经唑来膦酸刺激后对骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的:探讨外周血γδT细胞经唑来膦酸刺激后对骨肉瘤细胞株HOS的体内外杀伤作用及相关机制。方法:取健康人外周血5 mL,经唑来膦酸刺激后,在含IL-2的培养液中,培养14 d。用流式细胞仪测定γδT细胞所占的比例,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测其对骨肉瘤细胞株HOS的体外杀伤作用,并用抗人γδTCR抗体、抗人NKG2D抗体和穿孔素/颗粒酶阻滞剂CMA分别预处理γδT细胞,观察杀伤作用的变化。另用骨肉瘤细胞株HOS注入BALB/c裸鼠皮下建立骨肉瘤裸鼠种植瘤模型。随机将裸鼠分为2组,分别为未治疗组、γδT细胞治疗组。观察裸鼠瘤体大小及称量瘤重。结果:PBMCs经唑来膦酸刺激14 d后γδT细胞阳性率达到(95±3)%。当效靶细胞比为6∶1、12∶1、25∶1、50∶1时,对HOS细胞的杀伤率分别为26.8%、31.5%、37.8%、40.9%。用Anti-γδTCR抗体、Anti-NKG2D抗体及CMA预处理γδT细胞后,当效靶细胞比为25∶1时,对HOS的杀伤率分别为32.3%、4.7%、16.7%。体内抑瘤实验中,γδT细胞治疗组的肿瘤生长抑制率为42.78%。结论:PBMCs经唑来膦酸刺激后,可获得高纯度的γδT细胞,在体内外其对骨肉瘤细胞株HOS有较强的杀伤作用。     

唑来膦酸刺激健康人和骨肉瘤PBMCs体外扩增γδT细胞

目的:探讨唑来膦酸(Zol)联合IL-2对健康人和骨肉瘤患者末梢血γδT细胞的扩增和细胞毒性作用的影响。方法:取健康人和骨肉瘤患者外周血来源的单个核细胞,分别使用IL-2和Zol联合IL-2刺激体外扩增,流式细胞技术检测γδT细胞的纯度,并计算其扩增倍数。以Daudi细胞作为阳性对照、Raji细胞为阴性对照,并以人成骨细胞系hFOB细胞作为正常对照,用LDH法检测扩增后γδT细胞的细胞毒活性的变化。结果:健康人和骨肉瘤患者外周血单核细胞经过体外14 d的培养,Zol联合IL-2组可高度选择性扩增γδT细胞,并且扩增后γδT细胞具有杀伤活性,而对正常细胞无杀伤活性。结论:健康人和骨肉瘤患者PBMCs经唑来膦酸联合IL-2刺激后,可获得高纯度具有较强的杀伤作用的γδT细胞。     

结核分枝杆菌抗原和TCRγδ抗体诱导人γδT细胞分化并产生IL-17

目的探讨结核分枝杆菌耐热抗原(MTB-HAg)和抗T细胞受体γδ单克隆抗体(TCRγδm Ab)在刺激人γδT细胞诱导分化产生IL-17中的作用。方法健康人外周血单个核细胞经过免疫磁珠分选得到纯化的γδT细胞后,加入MTB-HAg或包被的TCRγδm Ab,再加或不加CD28 m Ab进行刺激,同时加或不加IL-17极化细胞因子组合(CK)(IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-23),极化诱导培养10~12 d。然后收集诱导极化培养的γδT细胞,经佛波醇酯和离子霉素再刺激6 h后,用ELISPOT法检测产生IL-17的细胞数。结果经刺激和诱导分化培养的γδT细胞用ELISPOT法检测产生IL-17的细胞数发现,TCRγδm Ab联合CK组与TCRγδm Ab组相比明显增加,TCRγδm Ab联合CD28 m Ab组与TCRγδm Ab同时联合CD28 m Ab和CK组相比明显减少。TCRγδm Ab同时联合CD28 m Ab和CK组与TCRγδm Ab联合CK组相比明显增多。MTB-Hag同时联合CD28 m Ab和CK组与TCRγδm Ab同时联合CD28 m Ab和CK组相比显著减少,但与MTB-HAg联合CD28 m Ab组相比明显增多。结论诱导Th17分化的CK(IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-23)也能诱导人γδT细胞分化产生IL-17,TCRγδm Ab刺激γδT细胞增殖后诱导分化产生IL-17的活性比MTB-HAg更强。另外,CD28在TCRγδm Ab激活γδT细胞诱导产生IL-17的过程中也有重要作用。     

一种体外扩增γδT细胞的新方法

目的:建立一种新的γδT细胞扩增方法。方法:从健康人外周血中分离外周血单个核细胞(PBMCs),与用唑来膦酸预处理过的未成熟DCs按10:1混合,在含IL-2 400 U/ml和10%小牛血清的RPMI1640培养基中培养,用MTT法测定细胞增殖倍数。用流式细胞仪对γδT细胞进行表型分析并检测其细胞内的颗粒酶B、穿孔素和CD107a含量。用乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测细胞杀伤活性。结果:经唑来膦酸预处理的树突状细胞与自身外周血单个核细胞共培养,到11天时γδT细胞增殖倍数达到(120±15)倍,第8天和11天γδT细胞百分率分别达到70.26%±3.56%、90.11%±4.67%。γδT细胞细胞内颗粒酶B、穿孔素及CD107a在第8天时分别为81.66%±4.32%、86.62%±5.21%和80.12%±3.78%,均高于对照组。培养的γδT细胞对SGC-7901、SW-1990、SW-480肿瘤细胞株杀伤活性至第8天时达到峰值。结论:此法能有效诱导γδT细胞体外扩增,培养的γδT细胞颗粒酶B、穿孔素及CD107a均显著高于对照组,并有较强的抗肿瘤活性。     

产生IL-17的γδT细胞概述

IL-17是一类重要的促炎症因子,近年由于Th17细胞这种以产生IL-17为主的CD4+αβT亚群的发现而备受关注。然而大量研究发现γδT细胞也是IL-17的重要来源。在多种疾病的小鼠模型中,γδT细胞的某些亚群能通过早期产生大量IL-17,在感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等的发生发展中扮演重要角色。有趣的是,γδT细胞经历了异于Th17细胞的胸腺内发育发育过程,未经胸腺内抗原致敏的γδT细胞即能分化为产生IL-17的功能亚群。最近有研究证实人类的γδT细胞也能产生的IL-17。下面就产生IL-17的γδT细胞的特征,发育及生物学作用等方面作一简短综述。     

γδT细胞对肿瘤发生、发展的影响及其在肿瘤免疫治疗中的应用

γδT细胞是不同于传统αβT细胞的独特T细胞亚群,其TCR由γ链和δ链组成.作为固有免疫和获得性免疫之间的桥梁,γδT细胞参与多种免疫应答过程,包括肿瘤发生、发展进程中的多种免疫反应.γδT细胞对多种肿瘤细胞具有直接的杀伤作用,也可间接的通过影响其他免疫细胞(如树突状细胞、CD8+T细胞等)的功能发挥抗肿瘤免疫应答.然...     

不同治疗剂量白细胞介素2对人外周血γδT细胞增殖和表型的影响

目的研究治疗剂量范围内白细胞介素2(IL-2)对T细胞的增殖作用,特别是对人外周血γδT细胞数量和功能亚群的影响。方法采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,在不同浓度IL-2作用下培养2周,利用免疫荧光染色和流式细胞术分析培养前后不同淋巴细胞的表型和比例,采用台盼蓝染色和血球计数法进行细胞计数。结果Vδ1和Vδ2型γδT细胞的4个功能亚群中,CD27+细胞(包括CD27+CD45RA+和CD27+CD45RA-)可以表达淋巴组织归巢受体CCR7,CD27-细胞(包括CD27-CD45RA+和CD27-CD45RA-)不表达CCR7,具有分布于外周组织的潜能;各个γδT细胞的功能亚群均能表达活性相关受体,在丝裂原刺激下可以迅速产生不同水平的细胞毒作用相关效应分子。虽然高剂量IL-2对CD4 T细胞的增殖产生抑制作用,但对γδT的增殖反而有促进作用,增殖的γδT细胞以CD27-CD45RA-的效应细胞为主。结论治疗剂量范围内的IL-2具有刺激人外周血γδT细胞增殖的作用,在基于IL-2的抗肿瘤治疗中可能具有重要的生物学意义。     

ERK1/2信号通路参与瘦素促人γδT细胞增殖调控

为探讨ERK1/2信号通路在瘦素促进人γδT细胞增殖中的作用机制。我们用MTT法观察不同浓度瘦素促γδT细胞的增殖效应,以及用ERK1/2特异性抑制剂PD98059阻断ERK1/2信号通路对瘦素促细胞增殖效应的影响,Western blot法检测瘦素干预对ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达水平的影响。结果显示,瘦素在一定浓度范围内促进人γδT细胞增殖。瘦素可使ERK1/2信号通路中的靶蛋白发生磷酸化激活,用PD98059阻断ERK1/2信号通路可显著抑制瘦素促细胞的增殖效应,亦可抑制瘦素对γδT细胞ERK1/2蛋白磷酸化。因此,我们认为瘦素促人γδT细胞增殖效应可能与激活ERK1/2信号通路有关。     

二膦酸盐防治骨质疏松症的进展

骨质疏松症是一种骨量减少和骨微结构破坏为特征，骨脆性增加，易导致骨折的全身性疾病。其主要病理生理机制是破骨细胞所介导的骨吸收增加。二膦酸盐在体内能抑制破骨细胞的骨吸收，因此被用于骨质疏松的治疗。二膦酸盐是焦磷酸盐的类似物，是碳（Ｃ）原子替代了焦磷酸盐...     

γδT淋巴细胞的抗肿瘤作用

粘膜免疫和固有免疫在对肿瘤的防御中起着重要作用。γδ型T细胞大量的分布于粘膜相关淋巴组织,其作用介于固有免疫和适应性免疫之间并且是MHC非限制性的。因此其在抗肿瘤免疫中的作用也是不可忽视的。以下将对其两个主要的功能亚群VγVδ2 T细胞和Vδ1 T细胞向肿瘤组织内浸润、对肿瘤细胞的识别及杀伤机制进行简要综述。     

唑来膦酸对骨肉瘤患者PBMCs来源γδT细胞抗骨肉瘤作用的影响

目的 探讨唑来膦酸对骨肉瘤患者外周血单个核细胞(PBMCs)来源γδ T细胞杀伤骨肉瘤作用的影响.方法 使用唑来膦酸联合IL-2体外扩增原发性、复发性和转移性骨肉瘤患者PBMCs来源γδ T细胞,LDH法检测γδ T细胞的杀伤活性,ELISA法检测γδ T细胞分泌IFN-γ情况,并应用不同的抗体确定γδ T细胞识别、杀伤骨肉瘤细胞的途径.建立裸鼠HOS骨肉瘤移植瘤模型,尾静脉分别注射生理盐水、唑来膦酸、γδ T细胞及唑来膦酸联合γδ T细胞,观察并比较不同方法对裸鼠肿瘤生长的抑制作用.结果 骨肉瘤患者PBMCs体外经过唑来膦酸联合IL-2刺激可高度选择性扩增γδ T细胞,并且扩增后的γδ T细胞具有杀伤骨肉瘤细胞的能力.唑来膦酸预处理骨肉瘤细胞后可显著增强γδ T细胞的杀伤活性,γδ T细胞识别、杀伤唑来膦酸预处理骨肉瘤细胞主要通过TCR途径和穿孔素-纤溶酶途径,NKG2D途径和TRAIL途径发挥作用较小.体内实验表明,唑来膦酸联合γδ T细胞治疗对肿瘤生长的抑制作用强烈而持久,显著优于单独唑来膦酸治疗组和单独γδ T细胞治疗组.结论 唑来膦酸能够促进骨肉瘤患者PBMCs来源γδ T细胞的增殖,并能够增强γδ T细胞的抗骨肉瘤作用.     

γδT细胞、NK细胞及LAK的部分抗肿瘤生物特性比较

目的：通过体外分离、增殖培养获取γδＴ细胞、ＮＫ细胞和ＬＡＫ细胞,并比较了３种细胞的抗肿瘤的生物学特性。方法：收集用不同单抗分别馐被粘附的细胞,然后通过ＭＡＣＳ细胞分选仪的分选,获取的细胞进行细胞增殖动力学、细胞表型、细胞杀伤活性的测定以单抗阻断效应的分析。结果：经ＭＡＣＳ分离得到的γδＴ细胞,培养２ｗ后细胞数扩散６００～８００倍,ＣＤ３、ＣＤ８和γδ细胞表达阳性率分别是７２．２９％、５８．０２％和６５．９８％。γδＴ细胞对ＮＫ敏感细胞Ｋ５６２以及ＮＫ不敏感细胞Ｒａｊｉ和ＸＧ－７这３种不同靶细胞均有较高的杀伤率,分别为３５．９８％、４２．２７％和６９．０８％;ＮＫ细胞对此３种细胞杀伤率分别是４５．１２％、１２．３４％和２９．２７;ＬＡＫ细胞的杀伤率分别为４４．０１％、２９．２７％和２５．６８％。γδＴ细胞对经Ｍ     

乳腺癌组织来源的γδ1 T细胞通过产生IL-17D诱导初始CD4+T细胞免疫衰老

目的 探讨乳腺癌组织分离的γδ1 T细胞诱导免疫衰老发挥免疫抑制作用及其逆转的机制.方法 乳腺癌组织分离出的γδ1 T细胞与健康人外周血分离的初始CD4+T细胞共培养后,采用CCK-8法检测初始CD4+T细胞的增殖能力,衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测初始CD4+T细胞的衰老;诱导获得的衰老CD4+T细...     

PKC在结核杆菌抗原诱导人γδT细胞凋亡中的作用

采用Annexin-V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡的方法,分别观察Mtb-Ag(10.0μg/ml)刺激特异性激活的人γδT细胞不同时间凋亡情况,并研究Rottlerin(PKC抑制剂)预处理对Mtb-Ag诱导γδT细胞凋亡的影响。结果显示Mtb-Ag刺激3h、6h、12h、24h均可显著诱导γδT细胞凋亡(P<0.01),凋亡细胞比例在44.21%～51.76%之间;Mtb-Ag诱导γδT细胞凋亡可被Rottlerin(40.0μmol/L)抑制,凋亡抑制率为98.6%。提示PKC途径参与Mtb-Ag激发活化的γδT细胞凋亡过程。     

人外周血致敏型γδ+T细胞在体外的扩增

建立一种人外周血γδ＾＋Ｔ细胞体外选择性扩增的模式：即在ＩＬ－２的作用下,不需要γδ＾＋ＴＣＲ特异性配体的刺激,可使一类个体体外培养的外周血单个核细胞中的γδ＾＋Ｔ细胞发生优先增殖,逐渐成为培养细胞的主要群体。方法将１０个γδ＾＋ＴＣＲ的个体ＰＢＭＣ分别在含３＊１０＾５Ｕ／ＬＩＬ－２培养液中培养１－２ｗｋ后,其中的γδ＾＋Ｔ细胞的比率可达３８％－７８％。结果对３个宋的个体的坟增帮ＲＴ－ＰＣＲ分析表     

HIV/AIDS感染者体外诱导的γδT细胞亚群的特点

目的:了解HIV/AIDS感染者外周血中γδT细胞亚群的特点以及体外诱导后γδT细胞的增殖情况和Vδ1、Vδ2亚群的变化,为γδT细胞体外扩增方法的建立打下基础。方法:流式细胞术(FCM)检测25例HIV/AIDS感染者(HIV组)和31例健康对照者(HC组)外周血中的γδT细胞、Vδ1亚群、Vδ2亚群的频率和绝对值;选择两组中各10例外周血单个核细胞(PBMC),用anti-γδTCR单克隆抗体(mAb)和IL-2在体外诱导培养14 d,在0 d、7 d、14 d分别进行细胞计数和FCM检测,分析比较γδT细胞亚群的比例和培养情况。结果:HIV组外周血中γδT细胞、Vδ2亚群百分比和绝对值都显著低于HC组,而Vδ1亚群百分比和绝对值显著高于HC组;体外诱导培养14 d时,HC组总细胞数量增加3倍,HIV组总细胞数量稍有增加;HC组的γδT细胞比例可达到80%以上,其中Vδ2亚群可以增加到65%左右,而HIV组的γδT细胞比例达35%左右,Vδ2亚群比例仅增加到17%左右。结论:HIV/AIDS感染者外周血中γδT细胞比例显著降低,Vδ1/Vδ2比值倒置;用anti-γδTCR mAb和IL-2在体外诱导HIV/AIDS感染者的Vδ2亚群扩增效果不佳,不能逆转Vδ1/Vδ2倒置现象。应进一步寻找更加有效的诱导培养方法。     

Ⅰ型IFN体外增强人γδT细胞对骨肉瘤的杀伤作用

目的:探讨Ⅰ型干扰素(IFN)对人来源γδT细胞杀伤骨肉瘤作用的影响。方法:取健康人和骨肉瘤患者外周血来源的单个核细胞,分别使用唑来膦酸(Zol)、Zol和Ⅰ型IFN体外刺激扩增,流式细胞技术检测γδT细胞的纯度,计算扩增倍数。以Zol刺激体外扩增的γδT细胞为对照组,Zol联合Ⅰ型IFN刺激体外扩增的γδT细胞为实验组,LDH法检测不同方法扩增的γδT细胞的细胞毒活性,ELISA法检测γδT细胞分泌的IFN-γ。结果:Zol、Zol联合Ⅰ型IFN均可高度选择性扩增健康人和骨肉瘤患者外周血单核细胞中的γδT细胞,扩增后γδT细胞具有杀伤骨肉瘤细胞的能力。Ⅰ型IFN预处理γδT细胞后可显著增强γδT细胞的杀伤活性。结论:Ⅰ型IFN能够促进人γδT细胞的抗骨肉瘤作用。     

抗IL-2单抗诱导SLE患者外周血活化T淋巴细胞凋亡的研究

采用流式细胞仪定量研究了抗白介素２单抗（ＩＬ ２ＭｃＡｂ）诱导７０例系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）患者外周血活化Ｔ淋巴细胞凋亡的百分率,并与正常人对照组相比较。结果表明：ＩＬ ２ＭｃＡｂ能诱导ＳＬＥ患者及正常人外周血活化Ｔ淋巴细胞凋亡,且ＳＬＥ患者明显高于正常人（Ｐ＜００１）,活动期高于非活动期（Ｐ＜００１）;ＩＬ ２ＭｃＡｂ对ＳＬＥ患者外周血活化Ｔ淋巴细胞凋亡的调控呈剂量效应和时间效应。提示：从抗ＩＬ ２ＭｃＡｂ能诱导ＳＬＥ患者外周血活化Ｔ淋巴细胞凋亡,可间接地证明ＩＬ ２在ＳＬＥ疾病过程通过抑制外周血活化Ｔ淋巴细胞凋亡的作用而参与ＳＬＥ免疫病理损伤。     

PKM2是TCRγδ的配体吗?

目的检验M2型丙酮酸激酶(PKM2)是否是肿瘤细胞表面TCRγδ识别的配体。方法用Western blot的方法验证OT3肽(合成的TCRγδ中δ链的CDR3区肽)与PKM2结合,用Western blot及免疫组化法观察PKM2在肿瘤细胞及组织中的表达,用流式细胞术及激光扫描共聚焦显微镜术验证PKM2在肿瘤细胞的定位,用固相化PKM2体外扩增γδT细胞和PKM2刺激γδT细胞分泌IFN-γ的实验检验PKM2的功能。结果 (1)PKM2可与OT3肽结合,肿瘤细胞总蛋白提取物中含有大量PKM2,提示以OT3为探针,从肿瘤细胞总蛋白提取物中钓取到PKM2是合理的,用此方法筛选OT3结合蛋白的方法是可行的;(2)PKM2普遍表达于肿瘤细胞及组织,但不表达于肿瘤细胞膜;(3)PKM2在体外不能扩增γδT细胞,无刺激γδT细胞产生IFN-γ的功能。结论 PKM2不表达于肿瘤细胞表面,对γδT细胞不具有刺激活化的功能,PKM2不具备TCRγδ的配体特性。     

磷酸脂配体体外激活人外周血γδT细胞的研究

人γδT细胞可识别非肽类的磷酸脂分子。本研究用非肽类磷酸脂配体MEP在体外选择性扩增人外周血γδT细胞。MEP激活的PBMC中主要为CD3+ CD45RO+ γδTCR+ 细胞群。激活的γδT细胞可分泌IFN γ ,但不分泌IL 4,因此激活的γδT细胞可能分泌Thl型细胞因子。MEP激活γδT细胞需要有辅佐细胞的存在 ,但不需要抗原的处理和递呈 ,并且激活的γδT细胞对多种肿瘤细胞具有非MHC限制性的细胞毒作用。以上结果提示MEP可有效激活γδT细胞 ,使其表现出独特的免疫学特征和生物学功能。