β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ在树突状细胞中的表达及作用

目的：观察β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ（β-1,4-galactosyltransferase-Ⅰ,β-1,4-GalT-Ⅰ）在人外周血来源的树突状细胞（Dendritic cells,DCs）中的表达与定位,研究其对DCs免疫功能的影响。方法：人外周血单核细胞经GM-CSF＋IL-4＋TNF-α诱导培养分化为DCs,采用RT-PCR、流式细胞术和激光共聚焦技术观察DCs中β-1,4-GalT-Ⅰ的表达与定位;通过细胞粘附试验分析β-1,4-GalT-Ⅰ表达与细胞粘附能力的关系。用α-乳清蛋白（α-lactalbumin,LA）作为细胞表面β-1,4-GalT-Ⅰ抑制剂,研究β-1,4-GalT-Ⅰ在DCs细胞粘附以及与CD4＋Th细胞形成免疫突触过程中的作用。结果：在人外周血来源DCs细胞表面和细胞浆内可表达长型和短型β-1,4-GalT-Ⅰ;长型β-1,4-GalT-Ⅰ或细胞表面β-1,4-GalT-Ⅰ的表达水平与细胞粘附能力呈正相关;α-LA既可抑制DCs对层粘连蛋白的粘附,又可抑制DCs与CD4＋Th形成免疫突触。结论：β-1,4-GalT-Ⅰ在DCs中表达,他们作为粘附分子参与细胞粘附和免疫突触形成。     

CD4+ CD25+调节性T细胞对树突状细胞的杀伤作用

目的 探讨CD4^＋CD25^＋调节性T细胞是否对树突状细胞发挥免疫调节作用及其可能的机制。方法 用MACS（magnetic cell sorting）从BALB／c小鼠静息T细胞分离纯化CD4^＋CD25^＋T细胞，体外细胞增殖实验观察其对CD4^＋CD25^＋T细胞的免疫抑制作用；GM-CSF／IL-4培养自体小鼠骨髓来源DC，FACS（fluorescence-activated cell sorting）鉴定其表面分子特性；以CD3／CD28单克隆抗体活化CD4^＋CD25^＋调节性T细胞，FACS体外杀伤实验研究其对自体DC的调节作用，并观察穿孔素抑制剂EGTA对上述作用的影响。结果 用MACS法成功分离出CD4^＋CD25^＋T细胞，纯度可达98％，特异性表达而Faxp3基因，能明显抑制CD4^＋CD25^＋T细胞的体外增殖；骨髓来源的DC表达CDllc、MHCⅡ及少量协同刺激分子CD80、CD86；FACS体外杀伤实验证实以CD3／CD28抗体体外活化的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞对自体DC有显著杀伤作用（P〈0．05），穿孔素抑制剂EGTA能部分抑制该杀伤效应（P〈0．05）。结论 CD4^＋CD25^＋调节性T细胞可通过杀伤作用对自体DC发挥免疫调节作用，穿孔素／颗粒酶杀伤途径可能参与其中。     

CD4+ CD25+调节性T细胞AICD机制的研究

目的探讨CD4^＋CD25^＋调节性T细胞活化诱导的细胞死亡（AICD）发生的机制。方法CD4^＋CD25^＋T细胞以磁性细胞分离器（MACS）从BALB／c小鼠或DO11．10小鼠的静息T细胞分离纯化。体外细胞增殖抑制实验证实其免疫调节作用。CD4^＋CD25^＋T细胞的AICD以CD3／CD28单克隆抗体活化或以特异性OVA323-339肽、抗原提呈细胞活化等两种方法获得。CD4^＋CD25^＋T细胞凋亡相关基因的表达通过实时定量PCR检测。流式细胞仪检测细胞的凋亡率。进一步观察FasL中和抗体、TRAIL中和抗体及caspase抑制剂zVAD-fmk对CD4^＋CD25^＋T细胞凋亡的影响。结果MACS成功分离CD4^＋CD25^＋T细胞，纯度可达98％，该细胞可特异性表达Foxp3基因，能明显抑制效应性T细胞的体外增殖。CD3／CD28抗体以及OVA特异性抗原活化8d的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞AICD达39％～45％。活化前后的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞死亡受体家族表达发生明显变化；FasL、TRAIL中和抗体及zVAD-fmk可明显抑制CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的凋亡。结论FasL／Fas及其他凋亡相关分子可能参与了CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的凋亡。     

细胞表面β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ在免疫突触形成中的作用

目的:研究细胞表面β-1,4-半乳糖基转移酶-I(β-1,4-galactosyltransferase I,β-1,4-GalT-I)在免疫突触形成中的作用。方法:以抗CD3、CD28单克隆抗体活化Jurkat细胞,应用实时荧光定量PCR及流式细胞术检测分析β-1,4-GalT-I的表达变化,激光共聚焦显微镜观察β-1,4-GalT-I在Jurkat细胞活化前后的表达与定位;将Jurkat细胞与SEB负载的Raji细胞共培养以构建Jurkat-Raji细胞免疫突触,观察β-1,4-GalT-I在免疫突触中的定位。结果:β-1,4-GalT-I mRNA表达水平随着Jurkat细胞的活化逐渐增高,在细胞活化后36小时达到高峰;活化后细胞表面β-1,4-GalT-I分子的表达较静止状态高;共聚焦显微镜显示在活化的Jurkat细胞表面及Jurkat-Raji细胞免疫突触部位β-1,4-GalT-I表达信号增强且其分布发生重排和簇集,且与CD3分子共定位,与CD28分子部分共定位。结论:Jurkat细胞表面的β-1,4-GalT-I分子参与了免疫突触的形成。     

CD4+T细胞的分裂与表面标志和细胞因子产生相关性的探讨

目的：阐明抗原特异性CD4^ T细胞的分裂、细胞表面分子的表达和细胞因子产生之间的关系。方法：从T细胞受体转基因小鼠(DO11、10)的脾和淋巴结中分离CD4^ T细胞。在抗原提呈细胞存在的情况下，经OVA多肽抗原刺激后，检测细胞的分裂、表型和细胞因子的产生。结果：经抗原刺激3天后，CD4^ T细胞分裂1-5次，细胞膜表面抗原CD25、CD44的表达随着细胞的分裂而增加，相反，CD62L和CD69随着细胞分裂次数的增加而递减。细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10随着细胞分裂次数的增加而递增。IL-12促进细胞的分裂，增加IFN-γ的产生，抑制IL-4和IL-10的产生。结论：当CD4^ T细胞活化后，随着细胞的分裂，其细胞膜表面分子的表达和细胞因子的产生均发生质和量的变化。     

活动性肺结核患者外周血单个核细胞表达TH1/TH2类细胞因子的特点

结核病患者免疫细胞产生TH1类细胞因子的能力低下，而TH2类细胞因子表达各家报道不一。CD4^ T和CD8^ T细胞是结核病免疫中主要的效应细胞，也是细胞因子的主要来源。我们采用流式细胞仪检测CD4^ T和CD8^ T分泌IFN-γ和IL-4的能力，从单细胞水平探讨结核菌感染患者TH1／TH2型免疫反应的特点。     

CD4+CD25-T细胞凋亡机制的研究

目的：探讨CD4^＋CD25^-T细胞AICD发生的机制.方法：磁性细胞分离器（MACS）分离CD4^＋CD25^- T细胞.以CD3/CD28单克隆抗体活化BALB/c小鼠CD4^＋CD25^-T细胞或以OVA323-339肽、抗原递呈细胞活化DO11.10小鼠CD4^＋CD25^-T细胞两种方式建立AICD模型.基因芯片检测CD4^＋CD25^-T细胞和CD4＋CD25＋T细胞凋亡相关基因的表达.流式细胞仪检测细胞的凋亡率.并观察FasL中和抗体、TRAIL中和抗体及zVAD-fmk对CD4^＋CD25^-T细胞凋亡的影响.结果：MACS成功分离CD4^＋CD25^-T细胞,纯度可达98%.建立了CD3/CD28抗体以及OVA特异性抗原活化的CD4^＋CD25^-T细胞AICD模型,CD4^＋CD25^-T细胞凋亡率达35%～40%.基因芯片分析发现CD4^＋CD25^-T细胞相对高表达TRAIL、FAS,而CD4^＋CD25^-T细胞相对高表达DR5、FasL.FasL、TRAIL中和抗体及zVAD-fmk可明显抑制CD4＋CD25＋T细胞的凋亡.结论：FasL、TRAIL及其它凋亡相关分子可能参与了CD4^＋CD25^-T细胞的凋亡.     

4-1BBL介导的逆向信号对人外周血T细胞体外活化的调节作用

目的探讨表达于活化T细胞上的4-1BBL分子对T细胞的调节作用及可能机制。方法鼠抗人4-1BBL单克隆抗体1F1加入CD3单抗联合CD28单抗激发的T细胞培养体系。细胞计数分析T细胞的增殖；PI／Annexin V双染法分析T细胞的凋亡；ELISA法测定培养上清中细胞因子的分泌水平；流式细胞仪分析T细胞的表型。结果单抗1F1能够有效地抑制活化T细胞的体外增殖并诱导其凋亡，同时单抗1F1还可抑制活化T细胞分泌IL-2和INN-7及上调T细胞表面CD95和PD-1分子的表达。结论在T细胞活化过程中，活化T细胞表达的4-1BBL分子通过逆向信号抑制其细胞因子的分泌和上调负性调控分子，进而抑制T细胞的过度活化和下调T细胞介导的免疫应答。     

卵巢癌细胞培养上清诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+调节性T细胞

目的研究卵巢癌细胞培养上清液是否能诱导外周血CD4^＋CD25^- T细胞转变为CD4^＋CD25^＋调节性T细胞。方法将外周血CD4^＋CD25^- T细胞分离后，对照组用CD3和CD28单抗活化，实验组在对照基础上加用卵巢癌细胞株SKOV3培养上清，72h后分离各组的CD25^＋和CD25^-T细胞，溴化脱氧尿嘧啶掺入标记法测定增殖能力及对静息的自体同源CD4^＋CD25^- T细胞的增殖抑制能力，流式细胞仪测定细胞糖皮质激素诱发型TNF受体（glucocorticoid-induced TNFR,GITR）与CTLA-4分子的表达，RT-PCR检测细胞卿mRNA的表达。结果与对照组相反，实验组的CD4^＋CD25^＋T细胞具有免疫抑制功能，自身增殖能力下降，GITR和CTLA-4分子的表达和CD4^＋CD25^＋调节性T细胞相似，并被诱导表达转录因子Foxp3 mRNA。结论卵巢癌细胞分泌的可溶性物质能诱导外周血CD4^＋CD25^-T细胞转化为CD4^＋CD25^＋调节性T细胞。     

抗原特异性调节性T细胞的诱导及其对动脉粥样硬化的影响

目的探讨热休克蛋白（HSP）60抗原特异性CD4^＋CD25^＋T细胞的体外诱导及其对动脉粥样硬化斑块形成的影响。方法分离apoE^-/-小鼠骨髓单个核细胞，经阿司匹林处理培养出未成熟树突状细胞；体外诱导HSP60特异性调节性T细胞分化，检测其百分比和分泌功能；通过混合淋巴细胞反应研究CD4^＋CD25^＋T细胞的特异性抑制效应；过继转移CD4^＋CD25^＋T细胞后，观察其对小鼠动脉粥样斑块形成的影响。结果阿司匹林处理的树突状细胞共刺激分子CD80和CD86表达减少，形态学表现为未成熟树突状细胞；未成熟树突状细胞比成熟树突状细胞能诱导更多的特异性CD4^＋CD25^＋T细胞，培养体系中IL-10和TGF-β1水平明显升高。CD4^＋CD25^＋T细胞体外明显抑制效应性T细胞的增殖以及IFN-γ的分泌。体内，过继转移HSP60特异性CD4^＋CD25^＋T细胞组小鼠动脉粥样斑块面积显著小于对照组。结论未成熟树突状细胞可诱导出HSP60抗原特异性CD4^＋CD25^＋T细胞，后者在体内能明显抑制动脉粥样斑块的形成。     

脱氢表雄酮对鼠成骨细胞及CD4+T细胞协同刺激分子表达的影响

目的探讨脱氢表雄酮（DHEA）对成骨细胞（osteoblasts，OB）及CD4^＋T细胞表达协同刺激分子的调控作用。方法颅骨酶解法培养鼠OB，体外模拟雌激素撤退；免疫磁珠细胞分选（rnagnetic cell soaing，MACS）法分离CD4^＋T细胞；将OB或CD4^＋T细胞分为对照组、E2及DHEA处理组，并以LPS刺激；以流式细胞术分析OB表面CD80、CD86以及CD4^＋T细胞表面CD28、CTLA-4的表达。结果经E2及DHEA处理后，OB表达CD80、CD86显著增加（P〈0．05，P〈0．01）；CSA可降低对照组及DHEA处理组OBCDS0、CD86的表达（P〈0．01）。除DHEA组CD28^＋T细胞百分比增加外（P〈0．05），其余各组CD4^＋T细胞CD28和CTLA-4的表达无显著改变（P〉0．05）。结论DHEA可上调鼠OB协同刺激分子CD80、CD86表达，该作用可被CsA阻滞；DHEA还上调CD4^＋T细胞CD28的表达，提示可改善骨．免疫调节网络。     

一种基于TIL的肿瘤相关抗原特异性T细胞的筛选方法

Wolfl 等[1]的研究建立了一种以 CD137为表面标记，从人 CD8＋T 细胞中快速鉴定和分离抗原特异性 T 细胞的方法。由于 CD137分子表达于活化的 CD4^＋和 CD8^＋T 细胞表面[2]，其表达上调依赖于 T 细胞经抗原刺激后活化，并可在抗原刺激后12 h ~5 d 内持续表达[3]。因此可以CD137为标记，从 T 细胞中检测和分离比例较低的抗原特异性 T 细胞。     

CD4+CD25+T细胞在系统性红斑狼疮中的表达及意义

目的：探讨CD4^＋ CD25^＋ T细胞、IL-10在系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血的表达及临床意义。方法：入组30例SLE患者和20例正常对照者，其中活动性SLE患者17人，非活动性SLE患者13人。用流式细胞仪检测SLE患者和正常对照者的外周血CD4^＋ CD25^＋ T细胞阳性率，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中IL-10浓度。结果：活动性和非活动性SLE患者CD4^＋ T细胞总数均低于正常对照者；活动性和非活动性SLE患者CD4^＋ CD25^＋ T细胞阳性率高于正常对照者；活动性SLE患者IL-10浓度显著高于非活动性SLE患者和正常对照者。SLE患者CD4^＋ CD25^＋ T细胞阳性率和血清IL-10浓度与补体C3、抗DNA抗体水平及SLEDAI积分均无相关性。结论：SLE患者外周血CD4^＋ CD25^＋ T细胞是活化T细胞的标志，IL-10分泌异常与SLE的发病有关。     

补肾宁心方对鼠成骨细胞协同刺激分子表达的升调节作用

目的：探讨补肾宁心方药物血清对成骨细胞（OB）及CD4^＋T细胞协同刺激分子表达的调控作用。方法：颅骨酶解法培养OB，体外模拟雌激素撤退；MACS法分离CD4^＋T；将OB或CD4^＋T分别予以20％对照鼠血清、E2及20％中药血清培养并以LPS刺激，流式细胞术分析OB表面CD80、CD86以及CD4^＋T细胞表面CD28、CTLA-4的表达。结果：E2及中药血清组OB表面CD80、CD86的表达显著增加（P〈0．01）；CsA可降低对照鼠血清组及中药血清组OB表面CD80、CD86的表达（P〈0．01）；各组CD4^＋T细胞CD28和CTLA4的表达无显著改变（P〉0．05）。结论：补肾宁心方可上调OB协同刺激分子CD80、CD86表达；该作用可被CsA阻滞；而对T细胞CD28／CTLA-4表达无显著影响，其免疫学意义有待进一步研究：     

甲基-β-环糊精对T细胞膜分子CD69和GM1表达的影响

目的：探讨甲基-β-环糊精（Methyl-β-eyclodextfin，MβCD）去除细胞膜胆固醇诱导人外周血T细胞CD69和单唾液酸四己糖神经节苷脂（GangliosideGMl，GMl）的表达及机理。方法：用高浓度MβCD（10mmol／L）处理PBMC，或预先加阻断剂PD98059或／和LY294002，用流式细胞术检测T细胞GMl及CD69的表达；免疫印迹法检测MβCD诱导的CD3^＋T细胞中ZAP-70的磷酸化。结果：MβCD（10mmol／L）处理PBMC30分钟，GMl在T细胞上即有高水平表达（〉90％），CD69于处理后2小时高水平表达（〉80％）；预先加入PD98059或LY294002均能够大部分阻断MβCD诱导的T细胞CIM9表达，部分阻断GMl表达，联合应用两种抑制剂也不能完全阻断GMl的表达；MβCD能够促进CD3^＋T细胞中ZAP-70分子的酪氨酸磷酸化。结论：MβCD能够促进T细胞GMl及CD69的表达；且这两种分子的表达可能与信号分子ZAP-70、MEK／ERK及PBK有关。     

4-1BB在人外周血γδT细胞活化中的协同刺激作用

采用结核杆菌(Mtb)低分子多肽刺激人外周血单个核细胞,流式细胞术(FCM)检测不同活化时相γδT细胞膜表面4-1BB分子的表达;用阻断型4-1BB配体(4-1BBL)单抗阻断4-1BB/4-1BBL信号,FCM检测γδT细胞的增殖比率和细胞内产生IFN-γ的情况,同时与阻断CD28/B7-1信号相比较。结果显示,静止的γδT细胞膜表面不表达4-1BB分子,Mtb抗原刺激后6 h,4-1BB即有明显表达(29.71%),48 h达到高峰(49.79%);与未阻断组相比,阻断4-1BB/4-1BBL信号,γδT细胞的增殖效应和细胞内IFN-γ的产生均明显下降(P<0.01),与CD28/B7-1信号阻断组相比,差异无显著性(P>0.05)。提示4-1BB/4-1BBL信号同CD28/B7-1信号一样,可为γδT细胞活化提供协同刺激作用。     

CD3^—CD4^—CD8^＋小鼠胸腺细胞表型的研究

目的 分析CD3^－CD4^－CD8^＋胸腺细胞的表型特征,阐明其在胸腺发育中所处地位。方法 分离纯化小鼠CD4^－CD8^＋单阳性胸腺细胞,进行CD3与其他表面标志的染色,然后进行FACS分析。结果 CD3^－CD4^－CD8^＋细胞体积较大,对可的松敏感,TGRαβ阴笥,高度表达不成熟标志6C10和HSA,不表达活化标志CD69和成熟标志Qa-2。结论 CD4^－CD8^＋单阳性胸腺细胞可明显分为CD3^＋和CD3^－两个亚群,后者代表了胸腺发育过程中由CD4^－CD8^－双阴性细胞向CD4^＋CD8^＋双阳性细胞转变的过渡状态。     

多发性硬化患者外周血CD4+CD25high T细胞上4-1BB和GITR的表达

目的：以往研究表明4-1BB和GITR均可表达于CD4^＋CD25^＋调节T细胞（regulatory T cell,Tr）,在由该细胞群维持的自身耐受中起着重要作用。另有研究报道人外周血CD4^＋CD25^highT细胞与该Tr的功能活性更为接近,且在多发性硬化（multiple sclerosis,MS）患者中的效应功能明显降低,但目前对其是否与上述两类分子的表达有关尚不清楚,因此我们检测了MS患者外周血CD4^＋CD25^highT细胞上4-1BB、GITR的表达,旨在发现该调节T细胞群是否有上述分子的异常表达。方法：用流式细胞仪检测了未治疗MS、其他神经系统疾病患者、正常对照组外周血CD4^＋CD25^highT细胞表面4-1BB、GITR的表达。结果：与正常对照比较,MS患者CD4^＋CD25^highT细胞4-1BB的表达明显减少（P〈0.05）,而在CD4^＋CD25^-T细胞的表达则与正常对照无明显差别（P〉0.05）。三组间CD4^＋CD25^highT细胞及其GITR的表达亦无显著差别（P〉0.05）。结论：本研究发现MS患者CD4^＋CD25^highT细胞上4-1BB的表达减少,而GITR的表达则较正常对照组则无显著差别,我们的结果提示该细胞群免疫活性的降低可能与其4-1BB的表达下调有关,而GITR则在CD4^＋CD25^highT细胞的免疫调节过程中可能发挥着次要或精细调节的作用。     

自身免疫调节因子(Aire)对CD4+ CD25+调节性T细胞产生的影响

目的：探讨自身免疫调节因子（Aire）基因是否影响调节性T细胞的产生。方法：应用流式细胞术和real-time PCR的方法分别分析了Aire^-/-鼠的胸腺细胞和脾脏外周T细胞的CD4^＋CD25^＋T细胞分布及Foxp3的表达。结果：与对照鼠相比，Aire^-/-鼠的胸腺细胞、脾脏淋巴细胞以及脾脏T细胞总数未发生显著变化；CD4^＋CD25^＋调节性T细胞数目以及脾脏T细胞Foxp3 mRNA表达无显著差异；成年鼠、3日龄和7日龄鼠的CD4^＋CD25^＋T细胞占总的CD4^＋T细胞的百分比在Aire^-/-鼠和相应对照鼠间并无显著差异。结论：结果表明Aire基因不影响CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的产生。     

小鼠脾脏来源的调节性表型γδT细胞的存在和体外诱导

目的：研究初始γδT细胞是否存在具有调节细胞表型的亚群,同时是否能够像CD4^＋CD25^-T细胞一样可以在体外诱导产生具有调节表型的γδT细胞。方法：采用流式分选或磁珠分选的方法分离纯化脾淋巴细胞中γδT细胞,通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、实时定量PCR（Real-time PCR）和免疫荧光染色分析初始的γδT细胞以及TGFβ-（5ng/ml）诱导后的γδT细胞中Foxp3及部分调节性T细胞表面分子和细胞因子的表达情况。结果：与CD4^＋CD25^＋T细胞相比,初始的γδT细胞Foxp3表达量很低;活化的γδT细胞经过TGFβ-诱导后Foxp3表达量明显增加,同时与免疫调节相关的表面分子如GITR、CTLA-4和细胞因子TGFβ-、IL-10的表达量也相应增加,IFNγ-的表达有所降低。结论：初始的γδT细胞低表达Foxp3,在体外可经TGFβ-诱导产生具有调节性T细胞表型的亚群。