日本血吸虫线粒体DNA两个分子的遗传变异

目的　从线粒体DNA的2个分子,探讨我国日本血吸虫的遗传变异。　方法　试剂盒抽提基因组总DNA后,以特异性引物对线粒体还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶1(ND1)和细胞色素c氧化酶I(COI)进行PCR扩增,将PCR产物分别测序,并以生物信息学方法加以比较,构建系统进化树。　结果　序列系统进化树显示日本血吸虫中国大陆株与中国台湾株之间差异较大,在树状图中可归为2类;中国大陆山区型地域株,即云南洱源和四川天全在树状图中归为1类;中国大陆湖沼洲滩型地域株,即湖南岳阳、江西新建和安徽贵池3个地域株在树状图中处于并列位置;湖北省境内不同地域株在树状图中归为1类。　结论　我国各地日本血吸虫存在不同程度的遗传变异,各地域株间亲缘关系密切,存在共同的起源     

PCR-SSCP研究中国日本血吸虫线粒体DNA的遗传变异

目的 研究中国日本血吸虫线粒体DNA的遗传变异。方法 试剂盒抽提我国11个地域株日本血吸虫基因组总DNA,以特异性引物对其线粒体NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)脱氢酶1(ND1)和细胞色素C氧化酶1(CO1)片段进行PCR扩增,PCR产物纯化后作SSCP分析。结果 SSCP结果共出现15种条带类型,其中NDl片段中出现7种条带类型,分别是湖北省5地2种;中国台湾、湖南、安徽与江西各为1种;四川、云南同为1种。CO1片段中出现8种条带类型,其中湖北境内5个地域株中有2种;中国台湾株、湖南、安徽与江西各为1种,四川、云南株各为1种。结论 我国各地域株日本血吸虫存在不同程度的遗传变异。     

湖北钉螺COⅠ序列差异的扩展研究

目的 研究中国21株湖北钉螺细胞色素氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidase Ⅰ,CO Ⅰ)基因序列差异和各地域株的亚种分化.方法 收集中国4省7地湖北钉螺标本,提取基因组DNA后,PCR扩增CO Ⅰ基因部分片段并进行序列测定.加入原有14株钉螺CO Ⅰ序列,用Clustal X进行序列比对后输入MEGA软件计算...     

广西两地理株钉螺COⅠ基因分析及其与邻近四省钉螺亲缘关系的比较

目的 了解广西两地理株钉螺细胞色素氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidase Ⅰ,CO Ⅰ)基因的差异性,探讨广西钉螺与周边邻近4省钉螺的亲缘关系.方法 采集广西靖西有肋、横县光壳钉螺,提取DNA,PCR扩增CO Ⅰ基因并测序.登录GenBank检索出云南大理、四川绵竹、湖南岳阳、湖北汉阳4地钉螺的CO Ⅰ基因序列...     

湖北省庙河地区钉螺细胞色素C氧化酶1基因差异的研究

目的　比较湖北省庙河沿岸地区钉螺CO1基因序列的差异 ,探讨光壳螺与肋壳螺差异的原因。方法　在该地区选 7个点 (上游 4个点 ,下游 3个点 )采集钉螺 ,用CTAB法提取钉螺基因组DNA ,PCR方法扩增CO1基因 ,纯化后测序 ,运用ESEE软件排序并比较变异位点 ,观察各点钉螺的CO1基因单倍体型 ,运用PHYLIP软件计算遗传距离 ,绘制基因进化树。结果　获得CO1基因大小为 638bp ,上游和下游累积变异位点数分别为 2 9和 46,两者差异具有显著性 ;各采集点内钉螺按变异位点多少可分为两组 ;各采集点间存在有相同的基因单倍体型 ;上游和下游螺群之间的遗传距离为 0 0 2 2 1± 0 0 10 5 ;在FITCH绘制的基因进化树上 ,上游和下游地区钉螺交错分布在同一亚种不同的两个分支中。结论　在不同的生态环境下 ,下游地区钉螺CO1基因的变异强度比上游大 ;庙河各采集点螺群间存在一定的基因流动 ;庙河地区螺群属湖北钉螺湖北亚种 (O h hupensis) ,可能存在着两种不同进化速率的螺群。     

安徽省不同地区日本血吸虫群体线粒体基因遗传变异研究

目的 探讨安徽省不同地区日本血吸虫种群的遗传进化关系。 方法 分别从安徽省山丘型流行区(池州市石台县)和湖沼型流行区(安庆市大观区、铜陵市枞阳县)采集钉螺,逸出尾蚴后感染小鼠,每只小鼠感染(50±3)条尾蚴。 35 d 后解剖小鼠,门静脉灌注法收集成虫,提取成虫 DNA,PCR 扩增、克隆和测序成虫的线粒体 NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)脱氢酶 1(ND1)和细胞色素 C 氧化酶亚基Ⅰ( COⅠ)基因,利用生物信息学软件 Dnasp6. 0 和 Mega X 分析所得序列基本特征并构建系统进化树作遗传进化分析。 结果 安徽省三个地区日本血吸虫样本的 ND1 基因序列存在 15 个变异位点,COⅠ序列存在 74 个变异位点;ND1 基因和 COⅠ基因的核苷酸多样性(Pi)分别为 0. 004 7、0. 017 3,样本间 COⅠ基因序列差异高于 ND1 基因;来自湖沼型流行区的样本 ND1 基因和 COⅠ 基因的变异位点数、核苷酸多样性(Pi)均高于来自山丘型流行区样本。 来自山丘型流行区的样本在 ND1 系统进化树中与来自湖沼型流行区的样本聚集在一起,而在 COⅠ基因系统进化树中单独成簇。 结论 来自湖沼型流行区的日本血吸虫样本群体的基因多样性高于来自山丘型流行区的样本。 安徽省三个地区日本血吸虫群体的 COⅠ基因存在遗传分化,而 ND1 基因尚未产生较明显的遗传分化。     

湖北钉螺广西地理株基因变异及种群变迁

目的分析湖北钉螺广西地理株与云南、四川、湖南及湖北等地的钉螺的基因遗传变异特点及系统发生关系,初步探讨广西地理株种群变迁情况。方法采集广西靖西、云南洱源和湖南岳阳三地钉螺,分别提取钉螺基因组DNA,PCR扩增线粒体DNA(mtDNA)的细胞色素C氧化酶1(CO1)的基因并测序。同时从GenBank中搜索湖北汉阳、云南大理及四川绵阳钉螺相应序列,并应用邻接法(N-J)、非加权组平均法(UPGMA)方法构建系统发生树。综合分析钉螺表型、孳生地及基因的遗传变异特征并探讨其原因,分析系统发生关系。结果广西靖西与湖南岳阳、湖北汉阳的钉螺同源性较近,遗传距离较小,而与云南洱源、云南大理及四川绵阳的钉螺的同源性较远,遗传距离较大。基因变异以转换碱基数较多见,转换与颠换率为1.3,主要发生在第3碱基位点。结论广西、云南和四川虽然同属山地钉螺,湖南、湖北的钉螺为湖沼钉螺,但广西、湖南、湖北地理株亲缘性更近,而云南和四川地理株则高度同源。钉螺亲缘关系的远近及种群变迁,不能仅从外形及孳生地距离远近及地理纬度等来衡量和探讨。     

日本血吸虫中间宿主钉螺的种群遗传变异研究

以采自中国湖北、江苏、四川省三地现场钉螺和饲养在泰国玛希伦大学实验室的菲律宾钉螺为研究种群,用水平淀粉凝胶电泳方法研究各种群间的遗传变异.实验共观察7个酶中的14个等位点,并以杂合子、多态位点百分比和每位点平均等位基因数衡量遗传变异,结果表明中国大陆钉螺种群的变异程度较高.湖北省钉螺与菲律宾钉螺间的遗传距离最大,为0.44,湖北省与江苏省钉螺间遗传距离最小,为0.03.以UPGMA相似性聚类分析而构建的分校图谱显示中国大陆钉螺存在多亚种.     

湖沼型林业血防工程区钉螺细胞色素氧化酶I基因差异分析

目的 分析安徽省湖沼型血吸虫病流行区林业血防工程区钉螺细胞色素氧化酶Ⅰ （COⅠ） 基因的差异性, 探讨林业血防工程中不同生态环境对钉螺生态的影响。方法 采集长江安徽段上游安庆、 中游铜陵、 下游无为等3地林业血防工程区和草滩对照点钉螺, 提取DNA, PCR扩增COⅠ基因并测序。采用blast对COⅠ基因比较相似性。采用微小钉螺、 双脐螺COⅠ基因序列作为外群参照序列, Kimura双参数法计算遗传距离, MEGA 3.1软件非加权组平均法 （UPGMA） 和邻近法（NJ） 构建系统发生树。结果 PCR扩增获得的COⅠ基因约为700 bp （含两端引物）。各地林业工程区之间, 各林业工程区与其草滩对照点之间的COⅠ基因相似性均较高, 均≥98%; 安庆、 铜陵、 无为等3地林业工程区之间遗传距离为0.003～ 0.012, 3地林业工程区与草滩对照点的遗传距离分别为0.003、 0.019、 0.007。2种方法构建的进化树拓扑结构基本一致。进化树分2大分支, 双脐螺独立成一大支, 其他的成一大支 （在这大支中微小钉螺又成一支）, 3地的林业工程区与对照草滩钉螺基因差异比较小。 结论 长江安徽段上、 中、 下游林业血防工程区钉螺COⅠ基因在不同的生态环境下可能已存在一定程度的遗传分化, 但分化程度较低。     

中国大陆钉螺种群遗传学研究 Ⅰ.种群遗传变异

用采自34个现场螺点的钉螺进行水平淀粉凝胶电泳,并进行13种酶系统染色.结果17个等位基因中,7个为多态基因位点.种群间遗传距离的变化范围0.03—0.27.UPGMA、Fitch-Mar-golish最小方差法、最大相似性聚类分析图显示,聚类的组别与形态学或/和地理分布相一致.各分析指标提示,肋壳钉螺种群显著地不同于光亮钉螺种群,两组间的遗传距离为0.15.     

广西、湖南、云南三地钉螺Cytb基因序列变异和系统进化研究

目的分析广西钉螺与云南、湖南钉螺Cytb基因的遗传多态性和系统进化关系。方法收集广西靖西、云南洱源和湖南岳阳三地钉螺,提取其基因组DNA,PCR法扩增线粒体Cytb基因并测序。用Clustal W（1.82）软件对所测得的Cytb基因序列进行排序,用MEGA3.1计算其碱基组成、转换及颠换;用Kimura双参数法计算遗传距离,用非加权组平均法（UPGMA）和最大简约法（MP）构建系统发生树,同时结合三地钉螺分布和孳生地等资料进行分析。结果PCR扩增获得Cytb基因大小为580 bp。三地钉螺Cytb基因序列富含碱基A和T,A＋T平均含量为61.2%,表现出较强的碱基组成偏倚。三地钉螺Cytb基因578 bp的同源序列中检测到165个变异位点,约占核苷酸总数的28.5%。其中广西钉螺与湖南钉螺Cytb基因序列的变异位点为17个,约占2.94%;广西钉螺与云南钉螺Cytb基因序列的变异位点为160个,约占27.7%。广西钉螺与湖南、云南钉螺Cytb基因的遗传距离分别为0.031、0.405。采用两种方法构建的系统进化树均显示广西钉螺与湖南钉螺同属一个支系,云南钉螺单独形成另一支系。结论广西钉螺与云南钉螺存在较大基因差异,进化速率较大,保守性较小,遗传距离较大,亲缘关系较远;广西钉螺与湖南钉螺基因差异较小,相对保守,进化速率不太大,遗传距离较小,亲缘关系较近。     

不同地域株湖北钉螺CO1基因的差异研究

目的　研究中国大陆及台湾地区不同地域株湖北钉螺CO1基因的差异,为湖北钉螺种下分类提供依据。方法　收集13个地域株的湖北钉螺,高盐法抽提细胞内全部DNA ,PCR法扩增线粒体CO1基因,纯化并测序。将测序结果输入MEGA2程序,Kimura双参数法计算遗传距离,并分别用UPGMA法和最小进化法构建系统发生树。结果PCR扩增获得CO1基因大小约70 0bp(含两侧引物)。遗传距离显示:13个地域株明显被分为两组,其中四川株和云南株为一组,组内遗传距离为0 .0 35 ,其余为另一组,组内平均遗传距离为0 .0 14。而两组间的遗传距离为0 .12 9。两种方法构建的进化树拓扑结构基本一致。进化树分两大支,四川株和云南株位于一支,其它地域株位于另一支。结论13个自然隔离株湖北钉螺CO1基因总体差异不大,显示为一个种,其中四川、云南株与其它地域株差异显著,支持以往滇川亚种的结论,长江中下游各地域株CO1基因非常相近,支持指名(或湖北)亚种的分类方法。福建株、台湾株的分类地位有待进一步探讨。光壳和肋壳钉螺CO1基因无差异。     

湖北钉螺基因组5种抽提方法的比较

目的 5种方法提取湖北钉螺基因组DNA,PCR扩增线粒体基因组的COⅡ基因以比较其扩增效果,从而选择适合湖北钉螺大样本基因组抽提的最佳方法。方法将50只钉螺分为5组,每组10只,分别用OMEGA基因组DNA抽提试剂盒、天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒、简化基因组抽提方法、CTAB法和饱和酚抽提法抽提单只湖北钉螺基因组DNA,从消化、抽提时间、抽提浓度、成本等方面评价各种方法的优劣;PCR扩增线粒体基因组COⅡ基因,测定目的条带相对浓度以衡量扩增效果。结果 5种方法均能提取基因组DNA,消化时间最短的为饱和酚法,其余均为3 h;抽提时间最短的为两种试剂盒和CTAB,最长的为简化法;抽提成本最高的为OMEGA试剂盒法,最低的为CTAB法。5种方法PCR均扩增出COⅡ基因,但目的条带浓度有一定差异,其中OMEGA公司和天根公司试剂盒及实验室简化法提纯的模板PCR扩增浓度较高。结论用OMEGA公司生产的基因组DNA抽提试剂盒抽提湖北钉螺基因组DNA效果好,但成本较高,适用于对小样本的抽提;简化法从提纯效果、成本等方面评价,较适用于大样本抽提。     

湖北钉螺种群内AFLP分子标记遗传变异分析

目的 探讨湖北钉螺种群内的遗传变异及其程度。方法 采用扩增片段长度多态性(AFLP)分子标记技术对9省(云南、四川、广西、福建、湖南、湖北、江西、安徽、江苏)13种群湖北钉螺基因组DNA进行扩增,分析钉螺种群内的遗传变异。结果湖北钉螺13种群AFLP扩增片段位点数为403~472,江西星子钉螺种群内遗传多样性较高,多态位点频率、Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信息指数分别为93.2%、0.345和0.510,而广西宜州钉螺种群内遗传多样性较低,以上3指标分别为55.8%、0.191和0.287;广西宜州钉螺种群内的相似性较大,相似系数(中位数)为0.904,而江苏丹徒钉螺种群内的相似性较低,相似系数(中位数)为0.748;13种群内的遗传变异差异显著(P<0.01)。结论 我国广泛分布的湖北钉螺,种群内存在一定程度的遗传变异。不同地区湖北钉螺种群内遗传变异程度不同,有的相差较大。     

湖北钉螺交配行为及方式的观察

目的研究钉螺的交配行为及交配方式。方法将5~6旋活力较强的成熟钉螺放入培养皿中,置于奥林巴斯体视解剖镜下观察,记录全部交配过程。结果钉螺的交配行为可分为觅偶和求偶2个阶段;交配方式可分为2种基本形式4种类型。结论成功利用显微摄像系统详细观察了钉螺的交配行为及交配方式,提出了交配体位和朝向的划分模式,以资在钉螺和其他动物交配和行为模式的准确描述中提供参考和借鉴。     

湖北钉螺酚氧化酶的部分纯化及酶学特征

目的制备并纯化钉螺酚氧化酶,探讨该酶最适pH、最适温度及其底物专一性等特征。方法利用匀浆、离心等方法制备粗制酚氧化酶酶液,用盐析、凝胶层析进行酶液纯化;在不同pH、不同温度下测定该酶比活力,寻求最适pH、最适温度;根据测定不同底物(邻苯二酚、L-多巴、焦没食子酸)对该酶的酶促反应米氏常数(Km),判定其底物专一性。结果经纯化后酶活力提高了13.62倍。该酶对邻苯二酚、L-多巴和焦性没食子酸的Km值分别为5.66±0.84mmol/L、4.72±0.45mmol/L和20.64±2.36mmol/L(前两者比较P>0.05,分别与后者比较P均小于0.05)。酚氧化酶在pH6.0、40℃时活性最高。结论通过盐析、凝胶过滤层析等方法纯化可使酶活性明显提高;钉螺酚氧化酶对邻苯二酚的亲和力近似于L-多巴,两者均高于对焦性没食子酸的亲和力。     

两种方法饲养湖北钉螺的对比观察

目的 对比两种人工饲养湖北钉螺方法,建立实验室钉螺饲养的最佳方法。方法 保持实验室温度、湿度、光照等条件一致,采用泥钵饲养法和搪瓷盘草纸饲养法,对湖北钉螺进行平行饲养观察,统计各自钉螺死亡率。结果泥钵饲养法钉螺的累计死亡率为19.08%,月平均死亡率为9.75%;搪瓷盘草纸饲养法钉螺的累计死亡率为30.08%,月平均死亡率14.28%。两种饲养方法钉螺死亡率的差异有统计学意义（P<0.01）。结论 泥钵法饲养钉螺在提高钉螺存活率方面具有一定优势,但此法操作较为繁琐,大规模饲养时劳动量大,有待作进一步改进。     

安徽省不同血吸虫病流行区湖北钉螺遗传差异性研究

目的研究安徽省不同血吸虫病流行区湖北钉螺的遗传差异性。方法采集宁国市有螺无病地区和芜湖市有螺有病地区的湖北钉螺,提取其头足部基因组DNA,用7条GC含量不同的随机引物进行RAPD扩增,根据扩增产物琼脂糖凝胶电泳的DNA带型,比较两地湖北钉螺基因组DNA的遗传差异性,并计算其遗传距离。结果两地区湖北钉螺PCR产物呈多态性,扩增产物中除具有相同的DNA条带外,又具有各自独特的DNA条带,扩增片段共享度F值为0.603,DNA条带亮度也有不同。两地湖北钉螺遗传距离为0.387。结论安徽省不同血吸虫病流行区湖北钉螺基因组DNA存在较大的遗传差异。