化学诱导小鼠肝癌模型中CD133的动态变化

目的:检测肝癌干细胞标志CD133在化学诱导C57BL/6J小鼠肝癌过程中各时期的动态变化.方法:通过化学法[二乙基亚硝胺(diethylnirtosamine,DEN)/四氯化碳(carbon tetrachloride,CC14)/乙醇]诱发50只C57BL/6J雄性小鼠肝癌,对照组为45只正常C57BL/6J雄性小鼠.观察小鼠成瘤情况和生长状态,对每2周定期处死小鼠获得的组织标本分别进行病理学切片观察,并采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学法、蛋白质印迹法和FCM法分别检测CD133 mRNA和蛋白的表达情况.结果:化学诱导20周后,成功诱发出小鼠肝癌.实时荧光定量PCR和FCM检测结果显示,第8周后诱癌组小鼠肝组织中CD133的表达高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜ 0.05或P＜0.001);随着诱癌时间的增加,CD133的表达量呈上升趋势,第16周时诱癌组CD133的表达明显高于前期诱癌组(P＜0.001).蛋白质印迹法检测结果显示,诱癌组CD133蛋白从第4周起出现弱表达,随着诱癌时间的递增,CD133蛋白表达量逐渐增多.免疫组织化学检测结果显示,诱癌组第8周CD133出现弱阳性,第16周出现中等阳性,第20周出现强阳性;而正常对照组无表达.结论:肝癌干细胞标志CD133参与了肝癌的发生、发展全过程,随着诱癌进展其表达量逐渐增加.     

塞来昔布对Lewis肺癌组织COX-2、VEGF、MVD、MMP-2表达的影响

目的探讨选择性环氧化酶(COX)-2抑制剂塞来昔布对Lewis肺癌移植瘤的抑制作用及其对肿瘤组织V.EGF、MVD、MMP-2表达的影响.方法将C57BL/6小鼠随机分为药物组和对照组,药物组于接种Lewis肺癌细胞后第二天开始给予含1/1 000塞来昔布的食物,连续24 d,计算抑瘤率.采用免疫组化的方法研究COX-2、VEGF、MVD、MMP-2的表达.并采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术研究VEGF、MMP-2 mRNA的表达.结果含1/1 000塞来昔布食物饲养对Lewis肺癌移植瘤有明显抑制作用,抑瘤率为60.1%.免疫组化结果显示药物组肿瘤组织的COX-2积分平均值低于对照组,但无统计学差异(P＞0.05).药物组与对照组的VEGF积分为2.00±0.82和2.90±0.88(P＜0.05),MVD平均值为16.70±7.77和23.15±4.58(P＜0.05).但药物组与对照组比较,MMP-2的表达无显著性差异.RT-PCR结果表明药物组VEGF mRNA表达较对照组明显下调,而MMP-2 mRNA表达无明显改变.结论塞来昔布对Lewis肺癌移植瘤有明显抑制作用.其作用途径可能是通过抑制COX-2的活性,进而抑制VEGF的表达,减少新生血管形成,抑制肿瘤的生长.抑制肿瘤血管生长可能是塞来昔布肿瘤生长的又一机制.     

瘤内局部注射重组人血管内皮抑制素对小鼠Lewis肺癌抑瘤作用的研究

目的探讨瘤内直接注射重组人血管内皮抑制素（恩度）联合腹腔注射顺铂对Lewis肺癌的抑制效果。方法成功建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型。按体质量将小鼠随机分为生理盐水组、顺铂组、瘤内注射恩度组、顺铂联合腹腔注射恩度组、顺铂联合瘤内注射恩度组5组。治疗后处死小鼠,计算肿瘤体积抑瘤率,用免疫组织化学法测定各组小鼠肿瘤组织血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平及微血管密度（microvessel density,MVD）。结果顺铂组、瘤内注射恩度组、顺铂联合腹腔注射恩度组、顺铂联合瘤内注射恩度组的抑瘤率分别为61.8%、24.9%、70.3%、74.3%。免疫组织化学结果显示,顺铂联合瘤内注射恩度组的VEGF表达及MVD计数在各实验组中均最低,与顺铂联合腹腔注射恩度组比较两者差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论经皮穿刺瘤内注射恩度联合顺铂有协同抗肿瘤作用,能有效抑制肺癌的生长及转移,并且相同剂量的恩度,肿瘤内局部注射效果优于腹腔注射。     

小鼠红白血病细胞FBL-3的生物学特性

Objective To investigate the biological characteristics of mouse erythrolenkemia cell FBL-3.Methods The morphological feature, growth characters, clone formation and immunochemistry of mouse erythroleukemia cell FBL-3 were examined by light microscope. The cell cycle distribution and expression of MHC were detected by flow cytometry. Drug sensitivity was measured by MTT assay. Tumorigenicity was evaluated after intravenous injection FBL-3 cells into C57BL/6 mice. Results FBL-3 cells were smaller,fusiform or polygon, adherence. Doubling time was 24.12 h. The clone formation rates were (35.23±1.44) %and (60.27±5.56) % at 14 th and 21 th day, respectively. The reactions for PAS and chloracetic acid were positive, while the POX, NAP and butanoic acid reactions were negative. The cell cycle distribution was as follow: G0/G1 phase (50.9±2.5) %, S phase (36.3±1.4) %, G2/M phase (13.8±0.8) %. The IC50 of FBL-3 cells to Ara-C, VDS, DDP, MMC and MTX were (0.49±0.04), (0.87±0. 09), (3.77±0.32), (1.66±0.16) μmol/L and (2.77±0.24) nmol/L, respectively. Chromosome number was at 34 to 41. MHC of FBL-3 cell was H-2b. Sexual gene Sry was positive. All C57BL/6 mice were morbidity with erythroblastic leukemia when FBL-3 cells had been intravenously inoculated. There was a linear relationship between the survival time and the number cell injected. The main targets for the leukemic FBL-3 cells were liver, spleen, kindey and lung. Conclusion FBL-3 cell has typical features of mouse leukemia cell, was easily cultured in vitro and tumorigenesised in C57BL/6 mice. FBL-3 cell could be as a satisfactory tool for the research of leukemia.     

表达sFlt-1的小鼠骨髓间充质干细胞介导的抗肿瘤作用研究

目的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是存在于骨髓中的一种具有多向分化潜能和很强增殖能力的细胞.经静脉输注的MSCs能特异性地聚集于新生组织,如伤口和肿瘤等,本实验将MSCs作为基因治疗靶向载体,研究其在肿瘤组织内的抗血管作用.方法从雄性小鼠股骨骨髓中分离和培养MSCs,用流式细胞仪检测CD34、CD29、CD44的表达.再用sFlt-1(VEGF-R1)重组腺病毒感染后,给荷瘤小鼠静脉注射.结果间充质干细胞聚集在肿瘤内表达sFlt-1,使得肿瘤血管生成受抑制、肿瘤细胞凋亡增加、肺转移灶减小、生存时间延长.结论本研究表明,MSCs作为基因的运载工具在抗肿瘤领域可能有一定的应用价值.     

血管能抑素基因在淋巴细胞中的表达及其抗肺癌作用的实验研究

背景与目的近年来,肺癌分子靶向治疗取得了明显进展,其中抗血管生成分子靶向治疗已引起人们广泛关注。本研究的目的是探讨经人血管能抑素(canstatin)基因重组表达载体转染的人淋巴细胞培养上清对动物肿瘤生长和转移的抑制作用。方法将canstatin重组表达载体及空载体通过电穿孔的方法转染人淋巴细胞,行G418筛选获得转基因细胞克隆;用SDS-PAGE电泳检测canstatin蛋白在转基因细胞培养上清中的表达。将Lewis肺癌细胞接种于C57BL小鼠皮下,成瘤后将30只小鼠随机分成3组,分别给予重组载体转染的淋巴细胞培养上清、空载体转染的淋巴细胞培养上清和生理盐水(NS)各0.2mL在腹股沟皮下注射,每天1次,连续14日,观察3组小鼠原位肿瘤生长情况及肺部转移情况。结果canstatin在转染重组载体的人淋巴细胞中表达并分泌至培养上清中。重组载体组小鼠肿瘤体积1.49cm3±0.18cm3明显小于空载体组(2.44cm3±0.19cm3)和NS组(2.53cm3±0.18cm3)(P=0.000)。重组载体组、空载体组和NS组的肺转移结节数分别为3.40±1.14、7.60±2.61和7.60±2.41,重组载体组明显少于后两组(P=0.013)。结论canstatin基因重组载体能在人淋巴细胞中表达并分泌至细胞外。canstatin可明显抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长与转移。     

东亚钳蝎毒素ITX对C57BL/6小鼠Lewis肺癌组织生长的影响

目的 观察东亚钳蝎毒素ITX对C57BL/6小鼠Lewis肺癌(LLC)组织生长的影响.方法 32只C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照rIL-2组和ITX组.将LLC细胞接种至模型组、阳性对照rIL-2组和ITX组C57BL/6小鼠的有前腋下.各组按不同的处理因素连续干预16 d.实验期间观察各组小鼠的一般状态,监测瘤重和瘤体积的变化.末次给药24 h后处死小鼠,剥取肿瘤,摘取双肺叶,在光学显微镜下观察肿瘤和肺脏的炎性细胞浸润情况.结果 与模型组相比,ITX组和rIL-2组小鼠的生存质量有一定程度的下降,但差异无统计学意义(P>0.05);各组肿瘤体积比较差异无统计学意义(P>0.05);肿瘤问质和肺泡间隔的炎细胞数增多(P<0.05).随着时间延长,模型组、ITX组和rIL-2组肿瘤体积均有明显增长(P<0.05).结论 ITX能够通过加强肿瘤微环境中以炎症为代表的非特异免疫促进C57BL/6小鼠LLC的生长.     

小鼠Lewis肺癌原位模型的构建

背景与目的肺癌原位模型包括小鼠自发性肺肿瘤模型和气道内接种模型等,但自发性肺肿瘤模型耗时较长且成瘤率不能保证,而气道内接种模型成瘤部位及大小不稳定。本研究以3LL细胞系细胞接种于C57BL/6小鼠肺原位,与皮下接种模型比较,探讨其稳定性、转移特性,并建立小鼠肺原位癌模型的优化方法。方法将不同数量级的3LL细胞分别直接接种于C57BL/6小鼠左侧腋下制备皮下接种模型和以Matrigel悬浮后接种于其左肺制备原位接种模型,观察两种模型的生存期,并对小鼠进行解剖后行病理切片检查、免疫组化染色检测微血管密度、流式细胞仪检测CD44v。结果皮下组成瘤率分别为100%、66.7%、16.7%,未见明显转移。原位组成瘤率分别为100%、100%、83.3%,并可转移至对侧胸廓及肺脏。原位组中位生存期(38d、35d、23d)明显少于皮下接种组(82d、72d、50d)。原位接种组微血管密度(120.2±9.73)高于皮下组(92.6±7.12)。原位接种组肿瘤细胞悬液CD44v表达(26.46±1.56)%高于皮下接种组(23.13±1.02)%。结论以3LL细胞接种于小鼠肺部所建立的肺癌原位模型简单可靠,重复性高,具有较...     

异种EGFR胞外区重组DNA疫苗与蛋白质疫苗抗小鼠Lewis肺癌的作用研究

目的:构建异种表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)胞外区重组DNA和蛋白质疫苗,观察其对小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤作用.方法:克隆鸡源性EGFR胞外Ⅱ-Ⅲ区与IgG-Fc融合基因,构建重组DNA疫苗质粒pVAX1-cEGFR-Fc和原核表达质粒pET28a(+)-S-cEGFR-Fc,后者转化大肠杆菌,将诱导表达的重组蛋白作为蛋白质疫苗.免疫小鼠4次后接种Lewis肺癌细胞,19 d后处死小鼠,剥离肿瘤称重并计算抑瘤率,检测小鼠血清中抗EGFR抗体效价,并检测特异性细胞毒性T淋巴细胞( cytotoxicity T lymphocyte,CTL)活性.结果:成功构建异种EGFR胞外区重组DNA和蛋白质疫苗.DNA疫苗组、蛋白质疫苗组和联合免疫组的抑瘤率分别为37%、49%和63%.3组小鼠均检测出抗EGFR抗体和CTL反应.结论:重组疫苗能打破机体对自身EGFR分子的免疫耐受,诱导特异性免疫反应,对小鼠Lewis肺癌有明显的抑制作用.2种疫苗的联合应用可进一步加强抑瘤作用.     

C57BL/6小鼠的血循环DNA的定量研究

目的探讨循环DNA的定量检测在荷瘤C57BL/6小鼠中的应用价值.方法以异位接种法在C57BL/6小鼠中建立B16黑色素瘤肝转移模型,以"微量基因组抽提试剂盒"抽提血清DNA,用SYBR Green I斑点荧光染色法对DNA进行定量.结果在正常小鼠中,血循环DNA为(62.4±25.52)ng/mL、荷瘤伴有肝转移小鼠为(241±73.7)ng/mL(P＜0.01);小鼠的血循环DNA水平与小鼠肝转移的分期相关,Ⅰ期、Ⅱ期肝转移小鼠分别为(131.11±54.32)ng/mL和(170±10.96)ng/mL,Ⅲ期、Ⅳ期小鼠为(235±85.54)ng/mL和(271±65.76)ng/mL.用健脾理气中药抑制肿瘤生长和转移的同时,荷瘤小鼠血循环DNA也同步下降.结论循环DNA定量检测能客观反应小鼠荷瘤程度,并能动态反应药物的疗效,是一具有应用前景的肿瘤标志物.     

色素上皮衍生因子通过诱导肺癌血管正常化增强照射作用实验研究

目的 观察色素上皮衍生因子(PEDF)对肺癌血管正常化的作用及PEDF与X射线照射不同联合模式对肺癌的抑制作用。方法 采用免疫荧光的方法观测PEDF对肺癌血管正常化的作用并确定其正常化时间窗。建立Lewis肺癌C₅₇BL/6小鼠移植瘤模型,采用区组法随机分成4组,分别给予对照﹑PEDF﹑照射和照射联合PEDF处理,观察不同处理对小鼠移植瘤生长的作用。     

3-(5'羟甲基-2'呋喃基)-1苯甲基吲唑联合放疗治疗Lewis移植瘤小鼠的实验研究

目的 观察3-(5'羟甲基-2'呋喃基)-1苯甲基吲唑(YC-1)联合不同放射治疗方式对Lewis肺癌移植瘤的疗效,并对其机制进行初步探讨.方法 对Lewis肺癌荷瘤C57BL/6小鼠进行随机分组后,Yc-1按照每天10 μg/g连续7 d腹腔注射,放疗采用6 MeV(3.0 Gy/min)电子线连续3 d照射,单次剂量5 Gy,照射总剂量为15 Gy.分别测量各组肿瘤长短径绘制抑瘤曲线,记录各组小鼠的体重变化;免疫组织化学法对低氧诱导因子1 α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达进行半定量分析,TUNEL凋亡试剂盒检测各组的细胞凋亡情况;Kaplan-Meier法比较各远期组的生存时间.结果 YC-1+放疗(R)组和R+YC-1组的肿瘤生长较YC-1组、R组及空白组(NS组和DMSO组)明显延缓.YC-1+R组抑瘤效果较R+YC-1组强,其差异有统计学意义.YC-1和放疗联合后能增强对HIF-1α、VEGF表达的抑制,提高凋亡率,延长荷瘤小鼠的生存时间.结论 YC-1与放疗联合应用能明显增强放疗的抑瘤作用,且先放疗再给予YC-1抑瘤效果更为明显,而单独应用YC-1效果不明显.     

卡托普利对小鼠在肺部照射后TGF-β1、TNF-α水平的影响

目的：探讨卡托普利在小鼠放射性肺损伤中对血清转化生长因子-β1（TGF-β1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的干预影响。方法：雄性C57／BL小鼠，设对照组、右肺单次照射10Gy组、右肺单次照射10Gy＋卡托普利组，于照射后36h、7d、15d、30d采集血液标本，ELISA法测血清中TGF-β1及TNF-α；同期取右肺组织以HE染色制成病理学标本。结果：10Gy照射组在照射后不同时段血清中TGF-β1水平及TNF-α水平均较对照组升高；而单次照射10Gy＋卡托普利组则表现为在不同时段均较对照组水平降低。析因分析结果为时间因素间、处理因素间、交互作用间均有统计学差异（P〈0．05）。病理结果显示10Gy照射组出现进行性加重的炎症改变，而单次照射10Gy＋卡托普利组则与对照组比较无明显区别。结论：卡托普利可以减低小鼠肺照射时TGF-β1、TNF-α等细胞因子浓度，并抑制放射性肺损伤的发生。     

小鼠红白血病细胞FBL-3的生物学特性

 目的　探讨小鼠红白血病细胞FBL-3的生物学特性。方法　观察小鼠红白血病FBL-3细胞光镜下的形态、生长曲线、体外克隆形成率及细胞免疫组织化学染色情况;流式细胞术分析细胞周期分布以及MHC分子的表达情况;常规细胞遗传学方法分析染色体核型,PCR检测性别基因Sry;MTT法分析化疗药物敏感性;经尾静脉接种后观察C57BL／6小鼠肝、脾、肺、肾的病理变化。结果　FBL-3细胞呈梭形或多角形贴壁生长;细胞群体倍增时间为24.12 h。14 d和21 d克隆形成率分别为（35.23±1.44）%和（60.27±5.56）%。糖原染色阳性、氯醋酸染色部分阳性,过氧化物酶、碱性磷酸酶、丁酸染色均阴性。细胞周期：G0／G1细胞占（50.9±2.5）%,S期细胞占（36.3±1.4）％、G2／M期细胞占（13.8±0.8）％。对化疗药物阿糖胞苷、长春地辛、顺铂、丝裂霉素、甲氨蝶呤的半数抑制浓度分别为（0.49±0.04）、（0.87±0.09）、（3.77±0.32）、（1.66±0.16）μmol／L和（2.77±0.24）nmol／L。FBL-3细胞染色体数目在34～41条之间,表达H-2b分子,Sry基因阳性。静脉接种小鼠100 %发病;接种的细胞数量与存活时间呈线性关系;白血病细胞可以浸润肝、肺、脾和肾。结论　FBL-3细胞具有白血病细胞的特性,体外易于培养,容易建立小鼠模型,可作为研究白血病的理想动物模型。     

紫杉醇对Lewis肺癌抑制作用及机理的研究

目的　探讨紫杉醇对Lewis肺癌生长和转移的抑制作用。方法　将Lewis肺癌细胞接种于C5 7BL/6小鼠皮下 ,腹腔注射紫杉醇 1 0mg/kg ,连续 1 0d。处理动物后测量治疗组及对照组皮下瘤重、肺转移灶计数 ,应用流式细胞术测定肿瘤细胞凋亡率 ,并进行光镜和电镜观察。结果　对照组和治疗组皮下瘤重分别为 (2 .833± 0 .0 74)g和 (0 .5 88± 0 .0 40 )g(P <0 .0 1 ) ,肺转移灶计数分别为 (5 .5 0 0± 0 .92 6 )个和(1 .1 6 7± 0 .75 3)个 (P <0 .0 1 ) ,肿瘤细胞凋亡率分别为 9.0 0 2 %和 2 5 .772 % (P <0 .0 1 )。电镜观察紫杉醇组可见典型的凋亡细胞和凋亡小体。结论　紫杉醇可明显抑制小鼠Lewis肺癌的生长和转移 ,并可诱导肿瘤细胞凋亡     

Identification of a cancer stem-like population in the Lewis lung cancer cell line

Objective: Although various human cancer stem cells (CSCs) have been defined, their applications are restricted to immunocompromised models. Developing a novel CSC model which could be used in immunocompetent or transgenic mice is essential for further understanding of the biomolecular characteristics of tumor stem cells. Therefore, in this study, we analyzed murine lung cancer cells for the presence of CSCs. Methods: Side population (SP) cells were isolated by fluorescence activated cell sorting, followed by serum-free medium (SFM) culture, using Lewis lung carcinoma cell (LLC) line. The self-renewal, differentiated progeny, chemosensitivity, and tumorigenic properties in SP and non-SP cells were investigated through in vitro culture and in vivo serial transplantation. Differential expression profiles of stem cell markers were examined by RT-PCR. Results: The SP cell fraction comprised 1.1% of the total LLC population. SP cells were available to grow in SFM, and had significantly enhanced capacity for cell proliferation and colony formation. They were also more resistant to cisplatin in comparison to non-SP cells, and displayed increased tumorigenic ability. Moreover, SP cells showed higher mRNA expression of Oct-4, ABCG2, and CD44. Conclusion: We identified SP cells from a murine lung carcinoma, which possess well-known characteristics of CSCs. Our study established a useful model that should allow investigation of the biological features and pharmacosensitivity of lung CSCs, both in vitro and in syngeneic immunocompetent or transgenic/knockout mice.     

基于三种CT图像勾画的非小细胞肺癌靶体积比较研究

目的 比较基于三维CT (3DCT)、四维CT (4DCT)和锥形束CT (CBCT)图像勾画所得非小细胞肺癌(NSCLC)靶区位置和体积差异。方法 31例周围型NSCLC患者,序贯完成胸部3DCT和4DCT扫描,基于3DCT制定放疗计划,放疗首次拍摄CBCT,并基于骨性标志配准校正。在3DCT、4DCT的50%时相、最大密度投影(MIP)、CBCT图像上勾画得到GTV_3D、GTV_4D50%、IGTV_MIP和IGTV_CBCT。对组间位移比较行Wilcoxon秩和检验,靶区位置及包含度比较行配对t检验,肿瘤三维运动相关性行Pearson法分析。结果 肺上叶组GTV_3D、GTV_4D50%、IGTV_MIP 与IGTV_CBCT比值分别为0.77、0.84和1.10(P=0.004、0.005、0.07);中下叶组比值分别为0.67、0.65和1.17(P=0.001、0.001、0.020)。全组患者GTV_4D50%与IGTV_CBCT比值与肿瘤三维运动呈负相关(P=0.012)。全组患者IGTV_CBCT对GTV_3D、GTV_4D50%、IGTV_MIP包含度分别为0.65、0.65和0.62,IGTV_CBCT对GTV_MIP包含度与IGTV_CBCT对GTV_3D或GTV_4D50%包含度差异无统计学意义(P=0.375、0.167),而GTV_3D、GTV_4D50%、IGTV_MIP对IGTV_CBCT包含度分别为0.47、0.49和0.67,IGTV_MIP对IGTV_CBCT包含度大于GTV_3D或GTV_4D50%对IGTV_CBCT包含度(P=0.000、0.000)。结论 CBCT图像包含的肿瘤运动信息量明显大于3DCT图像,但略小于4DCT的MIP图像。即使3DCT、4DCT与CBCT配准校正后也有可能导致较严重的脱靶,这是基于CBCT进行循证靶区和计划修正所需注意的。