食管癌相关基因NGAL四种融合表达载体的构建及其蛋白表达产物的比较分析

目的 :筛选出能高效表达且可溶性好的NGAL(neutrophilgelatinase associatedlipocalin)融合表达载体。方法 :将NGALcDNA全长片段分别定向克隆到表达载体的BamHI +EcoRI位点 ,构建NGAL基因的 4种融合表达载体 ,然后分别转化大肠杆菌并进行IPTG诱导小样表达 ,监测各NGAL融合蛋白在不同诱导时间内的表达量及其可溶性等。选择pHis NGAL和pDsbA2 0 NGAL进行IPTG诱导大样表达 ,通过SDS PAGE比较表达产物的量与可溶性。结果 :成功构建出 4种NGAL融合表达载体。经IPTG诱导小样表达后 ,4种载体的表达水平及其可溶性明显不同 ,DsbA2 0 NGAL、His NGAL和Trx NGAL融合蛋白表达量分别占菌体总蛋白的 33 3%、32 3%、2 8 7% ,而它们的可溶性部分分别占各自总NGAL融合蛋白的96 8%、95 3%和 6 3 0 %。对pDsbA2 0 NGAL和pHis NGAL进行IPTG诱导大样表达后发现 ,DsbA2 0 NGAL融合蛋白的表达量与可溶性较好。结论 :pDsbA2 0 NGAL表达载体是能高效表达且可溶性好的NGAL融合蛋白表达载体。     

NGAL蛋白Ni2+-金属鏊合层析纯化及其鉴定

背景与目的:通过对新癌基因NGAL的原核融合表达产物进行Ni2 -金属鏊合层析纯化及其MALDI-TOF-MS鉴定,最后获得一定丰度与纯度的NGAL蛋白.材料与方法:将pDsbA2.0-NGAL融合表达载体转化大肠杆菌,进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物的产量与可溶性,然后将表达产物进行Ni2 -金属鏊合层析纯化及其MALDI-TOF-MS鉴定.结果:将pDs-bA2.0-NGAL融合表达载体进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示表达的NGAL融合蛋白产量高、可溶性好;对表达的NGAL蛋白进行Ni2 -金属鏊合层析纯化后其纯度＞95%,MALDI-TOF-MS鉴定结果提示纯化后NGAL蛋白分子量与其理论分子量的误差仅为0.91‰.结论:通过对新癌基因NGAL的原核融合表达产物进行Ni2 -金属鏊合层析纯化及其MALDI-TOF-MS鉴定,最后确切获得了一定丰度电泳纯的NGAL蛋白,这为下一步制备其抗体奠定了良好的实验材料.     

截短的食管癌相关基因ECRG4在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

目的本实验旨在构建ECRG4的原核表达载体，在大肠杆菌中表达并纯化ECRG4所编码的蛋白，为进一步研究奠定基础。方法将ECRG4基因序列前端编码疏水性跨膜区28个氨基酸的cDNA序列截去，再将截短的cDNA序列克隆到原核表达载体Pet30（＋）上，重组表达载体转化感受态表达菌株BL21（DE3），低浓度IPTG低温诱导融合蛋白的表达。采用Western blot鉴定目的蛋白的表达，使用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果构建了截短的ECRG4．pET30a（＋）基因的原核表达载体，IPTG低温诱导得到大量可溶性蛋白，并且通过亲和层析纯化了重组融合蛋白。结论成功获得了高效表达的、具有一定的生物学活性的ECRG4原核表达产物，并为进一步研究ECRG4的结构和功能打下基础。     

人源化抗肝癌scFv融合RC—RNase在大肠埃希菌中的表达及对人肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤作用

目的：在大肠埃希茼中可溶性表达新型重组人源化抗肝癌单链抗体融合RC-RNase(scFv-RC-RNase)，观察其对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用。方法：将原核表达质粒Tih-scF-RC-RNase以大肠埃希茼E．codiBL21(DE3)为宿主菌，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达．工程菌经超声碎菌、离心后，上清液用Ni-NTA Agarose亲合层析法进行纯化。四甲基噻唑蓝(MTT)法检测纯化蛋白对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤作用。结果：IPTG诱导5h后，SDS-PAGE显示抗肝癌scFv-RC-RNase在大肠埃希茵E.coliBL21(DE3)中主要以可溶性的形式表达，表达量占茵体总蛋白量的lO．5％。MTT法提示，纯化后的表达产物对体外培养的人肝癌细胞SMMC一7721具有一定的杀伤作用，其半数致死量(LDs50)为0．007g／L。结论：抗肝癌scFv-RC-RNase融合蛋白有望成为一种具有一定临床应用潜力的抗肝癌导向治疗药物。     

基因工程技术获取重组人血小板因子4

目的：用基因工程方法获取重组人血小板因子4（rhPF4）,为下一步基础理论研究和临床应用奠定基础。方法：PCR方法获得人PF4编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET—PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,SDS—PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白。结果：成功构建了表达载体pRSET—PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致。IPTG诱导表达的rh—PF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11％。亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84％。结论：获得原核基因工程表达的rhPF4蛋白。     

人睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因的克隆测序及在原核系统中的表达

目的：扩增及克隆人的MAGE-E1基因并利用大肠杆菌进行表达。方法：从人胶质瘤细胞系BT-325中提取总RNA，用RT-PCR从中扩增出MAGE-E1基因片段。将MAGE-E1基因片段插入载体pGEM-T easy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX-4T-2中，构建重组表达载体pGEX-4T-2-MAGE-E1，并转化大肠杆菌进行表达。结果：1mmol／L．异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，MAGE-E1蛋白表达即达高峰，SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析表明，表达出Mr约41000大小的蛋白，占菌体总蛋白的35％。结论：成功扩增、克隆MAGE-E1基因，并在大肠杆菌中得到稳定高效表达。     

NGAL基因cDNA的克隆及其表达载体的构建

目的：克隆NGAL基因的cDNA,并构建其表达载体。方法：应用RT－PCR技术,从食管癌细胞系SHEEC中扩增出NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因的cDNA,并重组到中间载体pT-Adv中,经测序和与NCBI数据库比较证实是NGAL基因的全编序列。然后把它分别插入到真核表达载体pcDNA3和原核表达载体pGEX-4T-3中。结果：获得了NGAL基因的cDNA全序列,构建了NGAL的正、反向真核表达载体pcDNA-NGAL( /-)和原核表达载体pGEX－NGAL,并在大肠埃希菌TOP10F′中成功地表达出NGAL融合蛋白。结论：为研究NGAL基因的新功能和制备其抗体,进而阐明NGAL在食管癌等肿瘤中的生物学作用提供了有利工具。     

hTERT原核重组质粒的表达

目的本课题拟观察原核重组质粒pGEX-4T-1-hTERT在BL21细菌中的表达，为进一步探讨以hTERT为靶点的肿瘤基因免疫治疗提供实验依据。方法IPTG诱导带有pGEX-4T-1-hTERT质粒的BL21细菌融合蛋白的表达，取不同时间的培养物进行SDS—PAGE分析，并进行薄层凝胶光密度扫描测定目的蛋白表达量，同时对表达产物进行Western—blot检测。结果对SDS-PAGE结果分析发现，含pGEX-4T-1-hTERT质粒的BL21细菌能够表达出63kD的融合蛋白。薄层凝胶光密度扫描测定其表达水平最高为28．4％，以IPTG诱导4h表达量最高。Western—blot检测表明该融合蛋白可被hTERT多抗识别。结论诱导pGEX-4T-1—hTERT重组质粒，获得分子量为63kD的GST-hTERT融合蛋白。用抗hTERT目的基因片段表达的相应抗原蛋白。     

COPS3基因cDNA的克隆及表达

目的：克隆COPS3基因cDNA,构建其原核融合蛋白表达载体并表达和鉴定。方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得COPS3基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定。将COPS3基因插入pET28a融合蛋白表达载体中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析。免疫印迹法鉴定COPS3蛋白的表达。结果：cDNA测序证明,获得了COPS3基因cDNA,其序列与Genebank中报道序列完全一致。酶切分析表明,成功构建了含COPS3基因的pET28a融合蛋白表达载体。SDS-PAGE以及免疫印迹法鉴定分析表明,COPS3蛋白获得高效表达,分子质量为51Ku,表达量约占菌体总蛋白的30%。结论：成功克隆和表达了COPS3 cDNA。     

HIF干扰表达载体psilencer3.0-HIF-α siRNA的构建和鉴定

背景与目的：肾透明细胞癌是最常见的肾实质恶性肿瘤．生物学行为极为复杂，对放疗和化疗均不敏感。研究发现缺氧诱导因子HIF-α（和HIF-2α与肾透明细胞癌发生发展过程存在相关性．．本研究拟通过RNA干扰的方法构建psiletwer3．0-H1F-αsiRNA重组质粒，从而为进一步探讨HIF在肾细胞癌发生发展中的功能提供有效的工具。方法：设计并化学合成编码HIF-1α和HIF-2αsiRNA的DNA片段，通过基因重组的方法将其构建进siRNA的表达载体。采用实时定量PCR和Western blot检测构建成功的siRNA表达载体在mRNA及蛋白水平对目标基因表达的抑制。结果：786-0细胞转染psilem、er3．0-HIF-1αsiRNA和psilencer3．0-HIF-2α后，HIF-1α和HIF-2α的mRNA表达的抑制率分别达到r82．1％和87．4％；OS—RC-2细胞转染psilelwer3．0-HIF-1αsiRNA和psilencer3．0-HIF-2α后．抑制率分别达到了91．2％和81．2％。在786-0细胞和OS—RC-2细胞中转染HIF-1α干扰质粒和HIF-2α干扰质粒的实验组蛋白表达量较空白对照均有不同程度的减低、结论：构建成功的siRNA表达载体可以有效抑制目标基因HIF-1和HIF乏在mRNA硬蛋白水平的表达.     

3TAT-DRBD融合蛋白的原核表达及其siRNA结合活性与穿膜功能的鉴定

目的： 构建3TAT-DRBD重组载体,表达和纯化融合蛋白,并对其siRNA结合活性和穿膜功能进行初步验证。 方法： 采用基因合成技术获取靶基因 3TAT-DRBD, 并克隆到原核表达载体pET-44b中;用IPTG诱导融合蛋白表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,凝血酶切除标签,Western blotting鉴定。凝胶迁移阻滞实验验证DRBD和siRNA的结合能力,激光共聚焦显微镜观察TAT的穿膜能力。 结果： 限制性酶切和基因测序表明重组质粒pET-44b-3TAT-DRBD构建成功;IPTG诱导后3TAT-DRBD融合蛋白（含Nus标签和S标签）在大肠杆菌中高效表达,可溶性蛋白占菌体总蛋白约80%;成功切除融合标签并纯化了无标签的融合蛋白,经Western blotting鉴定其相对分子质量约为17 000;凝胶迁移阻滞实验证明,融合蛋白3TAT-DRBD 能有效结合靶向survivin基因的siRNA（survivin-siRNA）;激光共聚焦显微镜下可见,在TAT的介导下survivin-siRNA穿透胞膜进入前列腺癌PC3细胞的效率明显增高。 结论： 成功表达并纯化了具有siRNA结合活性与穿膜功能的3TAT-DRBD融合蛋白,为进一步3TAT-DRBD的功能研究及临床应用奠定了基础。     

NGAL基因cDNA的克隆及其表达载体的构建

目的 :克隆NGAL基因的cDNA ,并构建其表达载体。方法 :应用RT PCR技术 ,从食管癌细胞系SHEEC中扩增出NGAL(neutrophilgelatinase associatedlipocalin)基因的cDNA ,并重组到中间载体pT Adv中 ,经测序和与NCBI数据库比较证实是NGAL基因的全编序列。然后把它分别插入到真核表达载体pcDNA 3和原核表达载体pGEX 4T 3中。结果 :获得了NGAL基因的cDNA全序列 ,构建了NGAL的正、反向真核表达载体pcDNA NGAL( - )和原核表达载体pGEX NGAL ,并在大肠埃希菌TOP10F′中成功地表达出NGAL融合蛋白。结论 :为研究NGAL基因的新功能和制备其抗体 ,进而阐明NGAL在食管癌等肿瘤中的生物学作用提供了有利工具。     

COPS3基因cDNA的克隆及表达

目的:克隆COPS3基因cDNA,构建其原核融合蛋白表达载体并表达和鉴定。方法:从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得COPS3基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定。将COPS3基因插入pET28 a融合蛋白表达载体中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析。免疫印迹法鉴定COPS3蛋白的表达。结果:cDNA测序证明,获得了COPS3基因cDNA,其序列与Genebank中报道序列完全一致。酶切分析表明,成功构建了含COPS3基因的pET28 a融合蛋白表达载体。SDS-PAGE以及免疫印迹法鉴定分析表明,COPS3蛋白获得高效表达,分子质量为51Ku,表达量约占菌体总蛋白的30%。结论:成功克隆和表达了COPS3 cDNA。     

重组人canstatin表达产物的抗肿瘤活性鉴定

 目的　正确构建人canstatin原核表达载体 ,诱导表达重组人canstatin融合蛋白 ,并对其活性鉴定。方法　将人canstatincDNA亚克隆入 pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 canstatin ;转化M 15 [pREP4] 中 ,IPTG诱导表达 ,纯化回收表达产物 ,复性后用Lewis肺癌移植瘤模型对其活性鉴定。结果　成功构建人canstatincDNA表达载体 ,纯化回收 ,获得高纯度canstatin重组蛋白。纯化产物在体内能抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移 ,抑瘤率 (% )为 6 0 .0 % ,转移抑制率 (% )为 74 .3%。结论　 (1)成功构建了原核表达载体 pQE30 canstatin。 (2 )重组人canstatin融合蛋白在原核表达系统中高水平表达 ,并获得高纯度canstatin重组蛋白。 (3)重组canstatin融合蛋白可抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移活性。     

一种新的黑色素瘤相关抗原MAGE-C2的基因克隆及表达

目的:克隆人黑色素瘤相关抗原MAGE-C2的cDNA,构建真核、原核表达载体并转入相应细胞获得表达.方法:采用RT-PCR技术,从直肠癌细胞系SW480的总RNA中克隆了MAGE-C2 cDNA序列,并将开放读框分别插入质粒pEGFP-C1和pGEX-4T-3中,获得pEGFP-MAGE-C2绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体和pGEX-MAGE-C2谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白表达载体,将pEGFP-MAGE-C2转染293T细胞,观察绿色荧光融合蛋白在细胞中的定位;将pGEX-MAGE-C2转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导表达GST融合蛋白,并用谷胱甘肽亲和层析法纯化重组蛋白.结果:获得MAGE-C2开放读框并构建表达载体,测序结果与GenBank收录的序列相一致.真核表达载体转染293T细胞后显示MAGE-C2蛋白定位于细胞核;原核重组蛋白大部分以可溶性形式表达,亲和层析后,获得了较高纯度的MAGE-C2-GST融合蛋白.分析显示原核表达GST融合蛋白的相对分子质量为70 000,使用抗GST单克隆抗体进行Western blot分析证实为目的蛋白.结论:成功的获得MAGE-C2基因,构建了其表达载体并获得表达,为进一步制备MAGE-C2特异性单抗及深入探讨MAGE-C2可能参与肿瘤发生发展的机制提供了重要条件.     

pcDNA3．0／PNP-CD和pcDNA3．0／PNP表达载体的克隆和表达

目的：构建新型PNP，Mep-dR自杀基因系统的融合和单基因表达载体。方法：利用DNA重组技术制备融合自杀基因PNP-CD．将其和PNP单基因分别插入真核表达载体pcDNA 3．0中，构建融合与单自杀基因表送载体pcDNA 3.0 PNP-CD和pcDNA 3．0 PNP;酶切、PCR及测序鉴定两重组体结果：成功构建了两个新型自杀基因载体并实现在HepG2肝癌细胞株中的表达。结论：两个新型自杀基因表达载体．尤其是I’Nt。CI)融合自杀基因载体．是肿瘤基因治疗中广谱、高效的治疗载体。     

酵母双杂交筛选NGAL相互作用蛋白

目的：中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白（neutrophil gelatinase-assiociated lipocalin，NGAL）功能不明，籍筛选与之相互作用蛋白，构筑相互作用图谱，为揭示其功能提供新途径。方法：利用蛋白质相互作用原理，应用酵母双杂交技术，构建pGBKT7-NGAL载体，以NGAL为诱饵，在人类骨髓cDNA文库中筛选与之相互作用蛋白的基因。结果：通过酵母交配筛库、一对一验证和β-gal分析筛选出40个阳性克隆；测序．利用网上数据库（http：//www．ncbi．nlm．nih．gov）对序列进行比对．初步确定了31种基因．其中11种为未知基因，20种为已知基因。已知基因中舍有编码区的有LGALS1、MT2A、COX1、RNP24、ATP1R3、IGL、IGH、VDJ、RARRES2、GYPA、NEB和NPC2。结论：筛选得到31种可能与NGAL相互作用蛋白的基因．这为研究NGAL功能及作用机制提供了新途径。     

人源化抗肝癌scFv融合RC-RNase在大肠埃希菌中的表达及对人肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤作用

目的 :在大肠埃希菌中可溶性表达新型重组人源化抗肝癌单链抗体融合RC RNase(scFv RC RNase) ,观察其对体外培养的人肝癌细胞SMMC 772 1的杀伤作用。方法 :将原核表达质粒Tih scFv RC RNase以大肠埃希菌E coliBL2 1(DE3 )为宿主菌 ,用异丙基硫代 -β -D -半乳糖苷 (IPTG )诱导表达。工程菌经超声碎菌、离心后 ,上清液用Ni NTAAgarose亲合层析法进行纯化。四甲基噻唑蓝 (MTT)法检测纯化蛋白对体外培养的人肝癌细胞SMMC 772 1的体外杀伤作用。结果 :IPTG诱导 5h后 ,SDS PAGE显示抗肝癌scFv RC RNase在大肠埃希菌E coliBL2 1(DE3 )中主要以可溶性的形式表达 ,表达量占菌体总蛋白量的 10 5 %。MTT法提示 ,纯化后的表达产物对体外培养的人肝癌细胞SMMC 772 1具有一定的杀伤作用 ,其半数致死量 (LD50 )为 0 0 0 7g/L。结论 :抗肝癌scFv RC RNase融合蛋白有望成为一种具有一定临床应用潜力的抗肝癌导向治疗药物。     

hTERT原核重组质粒的表达

目的本课题拟观察原核重组质粒pGEX4T1hTERT在BL21细菌中的表达,为进一步探讨以hTERT为靶点的肿瘤基因免疫治疗提供实验依据。方法IPTG诱导带有pGEX4T1hTERT质粒的BL21细菌融合蛋白的表达,取不同时间的培养物进行SDSPAGE分析,并进行薄层凝胶光密度扫描测定目的蛋白表达量,同时对表达产物进行Westernblot检测。结果对SDSPAGE结果分析发现,含pGEX4T1hTERT质粒的BL21细菌能够表达出63kD的融合蛋白。薄层凝胶光密度扫描测定其表达水平最高为28.4%,以IPTG诱导4h表达量最高。Westernblot检测表明该融合蛋白可被hTERT多抗识别。结论诱导pGEX4T1hTERT重组质粒,获得分子量为63kD的GSThTERT融合蛋白。用抗hTERT目的基因片段表达的相应抗原蛋白。     

新克隆的硝基还原酶基因NOR1的表达及其产物的纯化

背景与目的：NOR1是与鼻咽癌密切相关的抑瘤／易感基因候选者之一,本实验旨在构建NOR1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化NOR1基因所编码的蛋白。方法：抽提人鼻咽正常组织中总RNA,利用RT－PCR扩增NOR1基因全长,经BamH I、Xho I双酶切后插入同样经BamH I、Xho I双酶切后的pGEX-4T-2质粒,构建表达载体pGEX-4T-2/NOR1重组表达质粒;转化大肠杆菌Jm105,用异丙基－β-D硫代半乳糖苷（isopropyl-thiogalactoside,IPTG）诱导pGEX-4T-2/NOR1/Jm105表达GST融合蛋白后,采用Western blot验证,并用GST琼脂糖亲和层析柱对目的蛋白进行纯化。结果：酶切鉴定和测序验证成功地构建了NOR1基因原核表达载体,经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分析在大肠杆菌Jm105中成功诱导表达了一分子质量约为74kDa的融合蛋白;该融合蛋白存在于细菌裂解液的上清和沉淀中,Western blot证实表达获得了成功;并利用亲和层析法获得了纯化蛋白。结论：成功获得了高效表达NOR1基因的原核表达产物,通过对该融合蛋白的纯化为它的多抗制备奠定了基础。