人细胞核诱导凋亡因子1在大肠杆菌中的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:构建人核凋亡诱导因子1(NAIF1)原核表达质粒,在大肠杆菌中表达及纯化NAIF1融合蛋白,制备兔抗NAIF1多克隆抗体,并对其特性进行初步鉴定。方法:PCR法获得人NAIF1序列并将其克隆到原核表达载体pET-32a中,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达蛋白,经变性、Ni+柱亲和纯化、复性后得到纯化的重组人NAIF1蛋白,免疫大耳白兔,制备兔抗人NAIF1多抗血清,以ELISA和Westernblot方法检测其效价和特异性。结果:成功获得了高纯度的人NAIF1重组蛋白和高效价的兔抗人NAIF1多抗血清,ELISA检测多抗效价达到1∶500000,Westernblot检测证明多抗特异性良好。结论:获得了高纯度的人NAIF1重组蛋白和兔抗人NAIF1多抗血清,为后续针对NAIF1基因功能的研究提供了重要实验材料。     

人肠道病毒71型VPO蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VPO蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性.方法:PCR方法扩增VPO基因,构建原核表达质粒pET-VPO并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VPO重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VPO多克隆抗体,ELISA方法检测抗VPO抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性.结果:VPO重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VPO抗体效价为1:106.细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VPO多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VPO蛋白.结论:原核表达了EV71的VPO蛋白并制备出抗VPO多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段.     

小鼠SKA1蛋白的多克隆抗体制备、鉴定与初步应用

目的:制备兔抗鼠SKA1(Spindle and Kinetochore Associated 1)多克隆抗体.方法:利用PCR的方法得到小鼠SKA1基因并克隆至pGEX-2T 原核表达载体中,转化入大肠杆菌BL21表达,经IPTG 诱导表达GST-SKA1融合蛋白,经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,通过ELISA测定抗鼠SKA1多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性.结果:构建了pGEX-2T-SKA1原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-SKA1融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体.ELISA测定表明SKA1多克隆抗体效价为1:25 600,Western blot分析表明SKA1多克隆抗体具有良好的特异性.通过免疫组织化学方法发现,SKA1表达于高分化前列腺癌细胞中.结论:成功地制备了效价及特异性良好的兔抗鼠SKA1多克隆抗体,为SKA1基因功能的研究奠定基础.     

果蝇硒蛋白D-SelK原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码果蝇硒蛋白D-SelK结构基因并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗D-SelK的抗体。方法:利用PCR从pGM-T-D-SelK质粒中扩增D-SelK基因,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-D-SelK,以重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,通过变性、电泳纯化D-SelK蛋白,SDS-PAGE和Westem blot方法鉴定目的蛋白的表达;以表达的D-SelK蛋白免疫家兔,制备抗D-SelK的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了D-SelK基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出目的蛋白,纯化后免疫家兔,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶51 200以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建D-SelK基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗D-SelK抗体,效价及特异性均良好,这为进一步研究功能特异性的D-SelK提供了有效的手段。     

Autotaxin多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Autotaxin(58-157位氨基酸)融合蛋白,制备抗Autotaxin的多克隆抗体。方法:构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备抗Autotax-in的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性,并用于免疫组化实验。结果:在大肠杆菌中高表达Autotaxin(58-157)-His6融合蛋白,经亲和纯化后免疫家兔,获得了特异性的抗Autotaxin抗血清。结论:成功构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)表达质粒,原核表达获得高纯度的目的蛋白,制备出高效价的特异性抗Autotaxin多克隆抗体。     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

人精子肌动蛋白样蛋白7a蛋白在大肠杆菌系统的表达纯化及多克隆抗体制备

目的 在大肠杆菌系统表达并纯化人精子肌动蛋白样蛋白7a(ACTL7a)的N段(1-70),制备兔抗ACTL7a多克隆抗体.方法 构建重组表达质粒pGEX-6p-1-ACTL7a(1-70),以重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌,IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍离子金属螯合树脂和谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B树脂两次亲和纯化和分子筛分离目的蛋白;以表达的ACTL7a(1-70)蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ACTL7a的多克隆抗体.ELISA检测抗体效价,Western blot法鉴定抗体特异性,免疫荧光组织化学技术检测ACTL7a在曲精小管细胞的表达.结果 经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达出目的蛋白ACTL7a(1-70),纯化后免疫新西兰大白兔,成功获得抗血清.血清效价达到1∶160000以上,且具有良好的特异性.结论 成功构建了ACTL7a基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达,经纯化获得高纯度的目的蛋白;制备出兔抗ACTL7a抗体,效价及特异性均良好.     

人GITR_(aa27-165)蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的: 表达和纯化人GITR胞外段(hGITRaa27-165)融合蛋白, 制备hGITRaa27-165融合蛋白的兔源性多克隆抗体(pAb).方法: 利用PCR从pGEM T-hGITR获得hGITRaa27-165编码序列, 将其亚克隆至原核表达载体pQE30, 构建重组表达质粒pQE30-hGITRaa27-165; 将阳性重组质粒转化大肠杆菌, IPTG诱导表达融合蛋白, 通过Profinity IMAC Ni-Charged Resin亲和层析柱进行纯化; 纯化蛋白免疫新西兰大白兔, 获取多克隆抗血清并利用Protein A Sepharose柱进行纯化, ELISA法检测抗体效价, Western blot法检测抗体特异性.结果: 构建了pQE30-hGITRaa27-165原核表达载体, 原核蛋白hGITRaa27-165蛋白以包涵体形式在大肠杆菌得到高水平表达, 通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的hGITRaa27-165蛋白, 蛋白浓度为400 mg/L, 制备的抗hGITRaa27-165多抗效价高达1:1.6×105, Western blot鉴定其具有良好的特异性.结论: 获得高纯度hGITRaa27-165蛋白, 并制备特异性pAb, 将为进一步研究hGITR的生物学功能提供实验基础.     

人肠道病毒71型VP0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VP0蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性。方法:PCR方法扩增VP0基因,构建原核表达质粒pET-VP0并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VP0重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VP0多克隆抗体,ELISA方法检测抗VP0抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性。结果:VP0重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VP0抗体效价为1∶106。细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VP0多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VP0蛋白。结论:原核表达了EV71的VP0蛋白并制备出抗VP0多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段。     

Ficolin-A的克隆、蛋白表达和抗体的制备与鉴定

目的: 克隆小鼠ficolin-A(mouse ficolin-A)基因, 构建在真核及原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达和鉴定其蛋白, 并制备其抗体, 以进一步用于研究小鼠ficolin-A的功能.方法: 用RT-PCR的方法从新生7 d的C57BL/6小鼠肝脏中运用GeneRacer kit扩增ficolin-A cDNA片段, 并将该片段分别插入pVAX-1真核表达载体及pGEX-KG 原核表达载体中, 实现插入基因的融合, 在IPTG的诱导下在大肠杆菌中表达.用GST-Sepharose 4B的柱子对表达的融合蛋白进行纯化, 用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定.制备ficolin-A的多克隆抗体并对其效价进行测定.结果: 成功地构建了pVAX-1-ficolin-A真核表达载体及pGEX-KG-ficolin-A原核表达载体, 并在大肠杆菌中获得高效的表达, 表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致.并且成功制备了多克隆抗体.结论: 成功地构建了重组表达载体pVAX-1-ficolin-A及pGEX-KG-ficolin-A, 并在E.coli BL21中表达了ficolin-A蛋白, 为下一步研究小鼠ficolin-A的功能奠定了基础.     

兔抗人CD1d分子α3结构域抗体的制备与鉴定

目的: 制备兔抗人CD1d分子α3结构域(hCD1d-α3)多克隆抗体.方法: PCR法扩增出人hCD1d-α3编码区基因, 将其克隆入原核表达载体pET28中, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 用IPTG诱导重组蛋白的表达, 用Ni2 -NTA Agarose亲和层析法纯化重组蛋白, 以之为免疫原免疫家兔, 制备多克隆抗体, 并用ELISA、 Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果: 成功构建了hCD1d-α3原核表达载体pET28/hCD1d-α3, 高效表达并纯化hCD1d-α3蛋白, 间接ELISA检测所制备抗体的效价为1∶6 400, Western blot显示该抗体能与hCD1d特异结合, 免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人小肠组织中的天然hCD1d.结论: 通过制备重组hCD1d-α3蛋白为免疫原, 免疫家兔, 成功地制备了效价高、特异性好的抗hCD1d-α3多克隆抗体.     

人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制备其多克隆抗体.方法:用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体,并以ELISA、Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果:在原核细胞中高效表达和纯化了人CD1d分子胞外区蛋白,用其免疫小鼠,获得了效价高、特异性较好的多克隆抗体,免疫组织化学检测显示该抗体可识别人小肠组织中的天然CD1d分子.结论:成功制备了人CD1d分子胞外区重组蛋白及鼠抗人CD1d分子胞外区抗体,为进一步建立人CD1d分子的免疫学检测方法及其生物学功能的深入研究奠定了基础.     

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：表达F10蛋白，并制备兔抗F10多克隆抗体。方法：利用PCR方法扩增F10基因片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后连接人pET-GST原核表达载体，构建的pET-GST／F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌B121，经IPTG诱导表达蛋白，并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS—PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗F10的多克隆抗体，并以ELISA法检测抗体效价。结果：经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS—PAGE电泳分析显示pET—GST／F10诱导后表达一相对分子质量（Mr）约为61000的融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90％以上，Western blot证实该蛋白是GST／F10的融合蛋白。将纯化的GST／F10融合蛋白免疫家兔，得到的兔抗F10抗体效价达1：20000。结论：成功构建了人F10基因原核表达载体，并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体，为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。     

Nanog基因的原核表达及抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达Nanog融合蛋白,制备兔抗小鼠Nanog融合蛋白抗体。方法:从含小鼠Nanog基因的pNA992质粒中扩增出小鼠Nanog基因并插入pET-32a中构建pET-32a-Nanog重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,得到了Nanog融合蛋白,并经Histrap亲和层析柱纯化后,将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫细胞化学染色检测抗体特异性。结果:成功地构建了重组表达载体pET-32a-Nanog,经诱导获得了大量Nanog融合蛋白,其主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达到97%,经免疫的兔抗血清效价可达1∶32 000,并表现出较好的特异性。结论:成功地制备出高滴度、高特异性的兔抗Nanog融合蛋白抗体。     

人CD154-GST融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:为制备重组人CD154-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(hCD154-GST),用于人CD154单克隆抗体研制。方法:根据人CD154基因序列设计合成特异性引物,RT-PCR扩增人CD154基因,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154;用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD154蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果:从人外周血淋巴细胞扩增出820bp的hCD154cDNA;将其克隆至pGEX-4T-1质粒中,经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因;IPTG诱导后的大肠杆菌经SDS-PAGE电泳鉴定出现明显的55kD蛋白带。结论:成功构建了人CD154-GST原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出人CD154-GST融合蛋白,为人CD154单克隆抗体的研制及进一步抗排斥反应的研究打下了基础。     

人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础。方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4。构建好的质粒在E.coli BL21(DE3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定。结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95%以上。ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Westernblot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白。结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体。     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建人β防御素4(human β defensin 4,HBD4)基因的原核融合表达载体PGEX-4T-2/mHBD4,诱导GST-HBD4融合蛋白在大肠杆菌中表达,并制备其多克隆抗体.方法:从重组克隆载体PMD18-T/HBD4中扩增HBD4成熟肽编码基因,并克隆入PGEX-4T-2中,在IPTG诱导下,表达GST-HBD4融合蛋白.以表达的融合蛋白GST-HBD4作为免疫原免疫家兔制备抗GST-HBD4的抗血清,抗体效价及特异性分别用ELISA和Western blot法鉴定.结果:在大肠杆菌中成功表达Mr约为32 000的融合蛋白GST-HBD4.ELISA法检测抗血清的效价可达到1:128 000,Western blot分析抗血清可与原核表达的融合蛋白GST-HBD4特异结合.结论:在大肠杆菌中成功表达了GST-HBD4融合蛋白,并制备了GST-HBD4的抗血清,为进一步研究HBD4蛋白的结构和功能奠定了基础.     

人ureb1在大肠杆菌中高效表达及其抗体的制备

目的：构建人的ureb1(hureb1）原核高效表达重组质粒,以此表达的外源蛋白为抗原制备抗urb1的抗体。方法：用XhoI/NotI从pGU-2质粒酶切得到hureb1的ORF与pGEX-4T-2的XhoI/NotI大片段连接,构建表达GST-hureb1融合蛋白的重组载体。转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,以粗制的GST-hureb1融合蛋白免疫大白兔和小鼠,制备抗hureb1的多克隆抗体和单克隆抗体,采用WesternBlot进行特异性鉴定。结果：构建了高效表达GST-hureb1融合蛋白的原核表达载体。融合蛋白的表达量占菌体蛋白质总量的33.45%。以大肠杆菌表达的GST-hureb1融合蛋白免疫动物制备了高滴度、高特异性的抗hureb1的抗体。结论：利用重组GST-hueb1融合蛋白免疫动物可获得高滴度的抗hureb1抗体。重组GST-hureb1融合蛋白和抗hureb1的抗体可用于hureb1的生物学功能研究。