白藜芦醇对人舌癌细胞Tca增殖及凋亡影响的研究

目的探讨白藜芦醇对人舌癌细胞Tca的增殖及凋亡影响。方法应用MTT比色法检测白藜芦醇对Tca细胞体外生长的抑制作用;平板克隆检测白藜芦醇处理前后Tca细胞的克隆形成能力;流式细胞仪测定细胞的周期和凋亡;Hoechst33258荧光染料染色,显示凋亡细胞形态。结果MTT实验观察,白藜芦醇对Tca细胞生长有抑制作用,随浓度升高和时间延长,作用增强,呈剂量-时间效应关系;白藜芦醇作用Tca细胞48 h和72 h后,半数细胞抑制作用所需浓度约为(IC50)100μmol/L和75μmol/L。白藜芦醇(75μmol/L)处理后,细胞的克隆形成能力明显下降。白藜芦醇(100μmol/L)作用48 h后使G1期细胞的比例增加;Hoechst33258染色,可见细胞呈明显的凋亡特征。结论白藜芦醇可抑制人舌癌细胞Tca增殖,使细胞周期呈G1阻滞并可诱导细胞发生凋亡。     

维甲酸诱导Tca8113细胞凋亡及其机理探讨

目的：研究维甲酸在体外对Tca8113（人舌部细胞系）细胞系凋亡的诱导作用。方法：在细胞培养液体系中加入不同浓度的维甲酸（Retinoic Acid，RA）进行诱导，以流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期时相变化，同时应用光镜、电子显微镜技术检测细胞形态学改变。结果：RA对Tca8113细胞凋亡率为23％，细胞周期时相变化以G1期细胞为显著。光镜下观察经RA诱导后的Tca8113细胞变圆、细胞间隙变大，游离细胞增多。电子显微镜观察细胞核凝固变小、凋亡小体增加，细胞内线粒体肿胀、变性。结论：RA能够诱导Tca81173细胞发生凋亡，G1期细胞受阻，不能进入S期。     

VEGFsiRNA对人舌癌Tca8113细胞移植瘤血管生成影响的研究

目的:观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达对裸鼠皮下人舌癌Tca8113细胞移植瘤血管生成的影响.方法:构建人舌癌Tca8113细胞20只裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为4组.将两对针对VEGF的siRNA真核表达载体(Pu-VEGF-siRNA1,Pu-VEGF-siRNA2)脂质体法作瘤体内及瘤周注射;以注射空质粒组作实验对照组;未注射组作空白对照组.注射1次/3 d×10次,末次注射3d后,剥离瘤体,RT-PCR检测瘤组织VEGF-mRNA表达,免疫印迹技术检测瘤组织VEGF蛋白表达.免疫组化染色法观察VEGF阳性染色及微血管参数.结果:Pu-VEGF-siRNA2组移植瘤VEGF-mRNA表达及VEGF蛋白表达、总体微血管密度、有腔微血管密度、有腔血管平均血管周长及管腔面积均较空质粒组及空白对照组低(p＜0.05).而Pu-VEGF-siRNA1组未观察到上述差别(P＞0.05).结论:siRNA能在体内抑制舌癌VEGF表达,有效减少肿瘤血管生成.不同的干扰片段体内作用效果存在差异.     

耐长春新碱人舌癌细胞系Tca8113／V100的研究

目的 建立耐长春新碱人舌鳞癌细胞系。方法 采用间歇性加药,逐步提高培养基中ＶＣＲ的浓度,连续体外诱导,培养,建立了一株耐ＶＣＲ人舌鳞癌细胞系Ｔｃａ８１１３／Ｖ１００。对其药物敏感性、倍增时间、裸鼠成瘤性、超微结构及耐多药基因等生物学特性进行了研究。结果 Ｔｃａ８１１３／Ｖ１００在含ＶＣＲ１００μｍｏｌ／Ｌ的２基中稳定生长,其对ＶＣＲ的耐药性为Ｔｃａ８１１３细胞系的１９．２倍,对其他几各抗癌药物也有     

SIP1在人舌癌Tca8113细胞中的定位和融合蛋白表达鉴定的研究

目的检测Smad相互作用蛋白1(SIP1)在人舌癌Tca8113细胞系中的定位及融合蛋白的表达鉴定。方法 PCR扩增SIP1编码序列的全长,克隆到pCMV-Flag-MAT-Tag 1载体。利用共聚焦激光扫描显微镜观察SIP1和SIP1-Flag在人舌癌Tca8113细胞系中定位,并将构建好的Flag标签SIP1(SIP1-Flag)真核表达载体转染到人舌癌Tca8113细胞系中,提取蛋白进行Western blot检测,利用Flag标签抗体进行免疫沉淀纯化SIP1-Flag融合蛋白。结果构建了SIP1-Flag真核表达载体。SIP1和SIP1-Flag融合蛋白主要定位于人舌癌Tca8113的细胞核中,Western blot检测到SIP1-Flag融合蛋白表达,且在人舌癌Tca8113细胞中成功纯化SIP1-Flag蛋白。结论成功构建真核表达载体。SIP1和SIP1-Flag主要定位于细胞核,成功鉴定融合蛋白表达并纯化SIP1-Flag融合蛋白。     

人舌癌Tca8113细胞热休克蛋白多肽复合物(HSP70-PC)的提取和鉴定

采用ADP-Agarose亲和层析结合DEAE离子交换对Tca8113细胞的HSP70-PC进行分离纯化.结果显示在NaCl 250～350 mmol/L浓度处出现一洗脱峰,收集此峰各组分,经10% SDS-PAGE、在相对分子质量70 000处可见清晰单一蛋白条带,电泳后于第5峰发现相对分子质量为70 000的蛋白,此蛋白被洗脱的盐浓度为NaCl 250～350 mmol/L,此即为高纯度的HSP70-PC.HSP70获得率为1 g湿重的Tca8113细胞能纯化85 μg的HSP70-PC.采取低渗匀浆、超速离心、ConA-Sepharose亲和层析、ADP-Agarose亲和层析及DEAE离子交换的纯化方案,可获得高纯度的HSP70-PC.     

nm23-H1提高舌癌细胞Tca8113对顺铂化疗敏感性可能机制的研究

目的研究nm23-H1提高顺铂化疗敏感性的可能机制。方法实验分为nm23-H1转染组和未转染组,用MTT法检测顺铂对舌癌细胞的杀伤率;流式细胞仪检测细胞凋亡变化;用流式细胞仪检测线粒体结合罗丹明荧光强度,检测线粒体膜电位的变化;等离子质谱仪检测细胞内铂离子浓度变化。结果nm23-H1过表达可以明显提高顺铂对舌癌细胞的杀伤率,使细胞凋亡增强,线粒体膜电位降低,提高细胞内铂离子浓度。这种作用可以被哇巴因（Na+/K+-ATP酶的抑制剂）抑制。结论nm23-H1可提高顺铂对舌癌细胞化疗的敏感性,其可能机制是nm23-H1降低线粒体膜电位,铂离子进入细胞内增加,导致细胞凋亡或坏死。     

转化生长因子β对舌癌细胞系Tca83生长的影响

目的：观察转化生长因子β（TGF－β）对于Tca83细胞生长的作用。方法：舌癌细胞常规培养,以MTT检测细胞增殖,免疫组化,原位杂交检测TGF－β及其受体TβRⅠ的表达。结果：加入TGF－β96h后,大多数实验组细胞的生长受到抑制。这种抑制作用 与TGF－β的浓度有关,较低浓度的TGF－β（0．2、1．0、5．0和12．5μg/L）,其A值分别为0．735、0．758、0．760和0．757）能够抑制Tca83细胞的生长（与对照组A值0．911比较,P＜0．01）,而高浓度（25．0μg/L）的TGF－β反而失去了这种抑制作用。Tca83细胞系中可检出TGF－β1、TGF－β受体（TβR）Ⅰ的蛋白及mRNA的阳性表达、TβRⅡ蛋白的阳性表达。结论：TGF－β能抑制Tca细胞的生长。Tca83细胞内的TβRⅠ及TβRⅡ表达使这种抑制作用成为可能。     

表皮生长因子对人牙髓细胞DNA合成及细胞周期的影响

目的 研究表皮生长因子(EGF)对体外培养的人牙髓细胞(HDPCs)DNA合成及细胞周期的影响。方法 将培养的第5代HDPCs分成EGF(1ug/ml)实验组和对照组,分别以含5％FBS的DMEM培养48h;常规消化、固定细胞,调整细胞密度为2.O×10~6/ml,经DNA荧光染色后用流式细胞仪(FCM)测定DNA分子含量。结果与对照组相比,EGF实验组HDPCs的DNA合成前期细胞比例(G_1％)明显降低,而DNA合成期细胞比例(S％)及细胞增殖指数PrI值(S+G_2M)％均显著增高。结论 EGF具有促进HDPCs的DNA合成和分裂增殖的作用,可能主要是通过促使处于G_1期的细胞进入S期来实现的;提示EGF在牙髓组织的损伤修复过程中起着重要作用。     

舌癌及舌癌脑转移细胞的药物敏感性

为研究舌癌细胞系Ｔｃａ８１１３以及该细胞系在裸鼠体内脑转移细胞亚系（Ｔｂ）药物敏感性，采用四唑盐比色法（ＭＴＴ法）检测了１５种药物对Ｔｃａ８１１３和Ｔｂ的抑制作用。结果表明Ｔｂ对其中的１０种药物敏感性低于Ｔｃａ８１１３，提示：舌癌转移细胞可能有一定程度的耐药性。     

直流电对鳞状细胞癌Tca-83细胞系抑杀作用的体外研究

目的:探讨直流电对人舌鳞状细胞癌Tca-83细胞系的抑杀作用。方法:对体外培养的人舌鳞状细胞癌细胞系Tca-83采用不同的电处理参数进行了直流处理。观察处理后癌细胞的形态、结构、生长情况、生物学特性;检测电处理后培养液的酸碱度、电解质的改变情况。结果:直流电处理对舌鳞状细胞癌有明显的杀伤及抑制作用。在电压一定的情况下增加电量可提高抑杀效率。电处理后的培养液pH,电解质,有机成分发生较大改变,其对癌细胞的生长有一定的抑制作用。电处理后未被杀死的癌细胞增殖能力也明显减低。结论:直流电处理可通过电解、电泳、电渗作用直接杀伤舌癌细胞,亦可通过改变细胞生长的外环境抑制舌癌细胞修复、生长、增殖     

4、5、7-三羟基异黄酮对人舌癌细胞株Tca8113体外迁移侵袭能力的影响

目的观察4、5、7-三羟基异黄酮(Genistein)对舌癌细胞株Tca8113体外迁移侵袭能力及金属基质蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达的影响。方法以细胞划痕实验及Transwell侵袭实验检测Genistein对Tca8113细胞侵袭的影响;采用明胶酶谱法及凝胶图像分析系统检测Genistein对胞外分泌MMP-2蛋白的影响;采用WesternBlot及细胞免疫组织化学检测Genistein对胞内MMP-2蛋白表达的影响。结果Genistein可明显抑制Tca8113细胞的迁移侵袭,Genistein组与对照组之间有明显的差异(P<0.01);Genistein可使细胞外分泌的活性MMP-2及MMP-2表达下调,活性MMP-2下调18.75%,MMP-2下调28.31%;WesternBlot及细胞免疫组织化学均检测到Genistein组与对照组相比能降低胞内MMP-2蛋白的表达。结论Genistein可以明显抑制Tca8113舌癌细胞株的体外迁移侵袭能力,并减少Tca8113胞内和胞外分泌的MMP-2蛋白的表达。     

生存素基因沉默增强人舌鳞状细胞癌Tca8113对顺铂敏感性的实验

目的探讨靶向生存素短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株生存素基因表达、凋亡及其对顺铂、5-氟尿嘧啶（5-Fu）敏感性的影响。方法脂质体介导的生存素shRNA表达载体转染Tea8113细胞，未转染、转染脂质体及错配shRNA载体的细胞作为对照。采用RT-PCR和Western blot分别检测生存素mRNA和蛋白的表达，流式细胞仪分析细胞的凋亡率，MTT法测定抗癌药物的敏感性。结果生存素shRNA表达质粒转染后，与3个对照组相比较，生存素mRNA和蛋白表达水平明显下降，细胞凋亡率的上升呈时间依赖性，48h可达37．9％。生存素shRNA能显著增加顺铂的敏感性，与未转染组比较其IC50值下降约4／5（P〈0．01），但对5-Fu的作用不明显。结论靶向生存素的shRNA可有效抑制Tea8113细胞生存素mRNA和蛋白的表达，同时增加了顺铂的化疗敏感性。     

塞来昔布增强博来霉素对人舌鳞状细胞癌Tca8113杀伤作用的研究

目的 研究环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂塞来昔布(celecoxib)增强博来霉素(bleomycin)对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的杀伤作用.方法 用含不同浓度的塞来昔布和博来霉素培养液培养Tca8113细胞24、48、72 h后,甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞生长抑制率,并采用金正钧法判断药物合用的相互作用;流式细胞术检测Tca8113细胞周期进程和诱导细胞凋亡的作用.结果 小剂量的塞来昔布(10 μmol/L)可增强博来霉素对Tca8113细胞的生长抑制作用,增强博来霉素阻滞Tca8113细胞周期进程的作用,其阻滞G1期细胞进入S期的作用最为明显,导致G0、G1细胞的数量增加[(60.93±0.32)%],S期[(30.57±0.78)%]、G2及M期[(8.50±0.50)%]细胞减少,同时,细胞凋亡率[(1.87±0.11)%]显著提高.结论 小剂量的塞来昔布可增强博来霉素对Tca8113细胞的毒性作用,阻滞细胞周期进程并诱导细胞凋亡.     

三氧化二砷对舌癌细胞鼠移植瘤的抑瘤作用

目的 探讨三氧化二砷在Ｓｃｉｄ小鼠体内的移植瘤抑制作用及可能作用机理。方法 将体外培养的人舌鳞癌细胞系Ｔｃａ８１１３细胞接种于Ｓｃｉｄ小鼠皮下,建立移植瘤模型,观察Ａｓ２Ｏ３对Ｔｃａ８１１３细胞移植瘤的抑瘤效果。结果 Ａｓ２Ｏ３对Ｔｃａ８１１３细胞移植瘤的抑制率为４９．１６％,且存在较煌诱导细胞凋亡作用。     

姜黄素对人舌鳞癌Tca8113细胞形态学的影响

目的 探讨姜黄素对体外培养人舌鳞癌Tca8113细胞凋亡的形态学影响.方法 以30、40、50 μmol/L的姜黄素溶液处理体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞,倒置显微镜下观察细胞生长状态,吖啶橙荧光染色和透射电镜观察细胞形态学变化.结果 倒置显微镜下可观察到细胞皱缩成圆形,核染色质浓集呈球形;激光共聚焦显微镜(吖啶橙染色)可见凋亡细胞的多种形态学改变;透射电镜见核染色质浓缩并沿核膜排列,可见凋亡小体.结论 姜黄素作用于人舌鳞癌Tca8113细胞后可出现细胞凋亡的形态学改变.     

加热联合黄体酮对人舌癌耐药细胞株Tca8113/BLM耐药性的影响

目的:研究加热(hyperthermia, HT)联合黄体酮(progresterone, Prog)对人舌癌细胞Tca8113和耐药细胞Tca8113/BLM耐药性的影响.方法:采用MTT法检测加热41 ℃ 1 h后联合Prog对人舌癌亲本细胞Tca8113和耐药细胞Tca8113/BLM化疗药物的敏感性;流式细胞仪(FCM)检测细胞内阿霉素(ADM)浓度聚积以及细胞膜上P-gp和MRP的表达.结果:与黄体酮作用细胞相比,加热41 ℃ 1 h联合2 μmol/L Prog作用细胞后,Tca8113和Tca8113/BLM细胞的IC_50显著下降(P<0.01),且各组之间均有显著差异(P<0.01),ADM浓度聚积在2 种细胞中明显增加(P<0.01),细胞膜上的P-gp 和MPR荧光强度显著下降(P<0.01).结论:加热联合Prog能协同增加细胞内药物浓度的聚积,显著提高细胞对化疗药物BLM的敏感性,其二者协同作用与降低细胞膜上的P-gp和MRP的表达有关.     

PTTG和bFGF在舌癌细胞株Tca8113中表达相关性研究

目的：探讨垂体肿瘤转化基因（Pituitary Tumor Transforming Gene,PTrG）蛋白在舌癌细胞株Tca8113中的表达及其与碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor,bFGF）间的关系.方法：应用免疫细胞化学方法,检测加入bFGF抗体后孵育的癌细胞中PTTG蛋白表达的变化.结果：Tca8113中PTTG蛋白呈阳性表达,并受bFGF影响,加入bFGF抗体的培养液中的癌细胞PTTG蛋白荧光明显减弱,随着时间延长和bFGF抗体滴度增加,减弱趋势明显.结论：舌癌细胞株中PTTG蛋白的表达受bFGF制约,对二者的联合治疗可能是一种治疗舌癌的有效方法.     

乏氧对人舌鳞癌细胞系Tca8113体外黏附和侵袭能力的影响

目的:研究乏氧及人乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因表达对舌鳞癌Tca8113细胞系黏附和侵袭能力的影响.方法:将化学合成的siRNA_(HIF-1α)转染入Tca8113细胞后进行常氧或乏氧(1% O_2)培养.实验设以下对照组:空白对照组、脂质体组及非特异性siRNA(siRNA_(Irr))组.采用real time-PCR和Western blot法测定细胞中HIF-1α mRNA表达和蛋白含量,并分别检测HIF-1α基因干扰前后细胞对细胞外基质(ECM)的黏附与侵袭力.结果: 乏氧能够诱导Tca8113细胞的黏附与侵袭力增加.乏氧培养条件下,HIF-1α的表达上调主要发生在蛋白水平.siRNA_(HIF-1α)转染后常氧或乏氧培养24 h, HIF-1α mRNA表达显著下调,与各对照组相比有统计学意义(P<0.01),Tca8113细胞内HIF-1α蛋白含量亦显著降低.无论在常氧还是乏氧培养条件下,siRNA_(HIF-1α)转染的Tca8113细胞黏附力与各对照组相比均显著降低(P<0.05或P<0.01);侵袭力也显著降低(P<0.01).乏氧条件下siRNAHIF-1α转染的Tca8113细胞黏附力和侵袭力下降程度高于常氧培养[(36.4±2.7)% vs (26±2.35);(44.2±2.2)% vs (35±1.75), P<0.01)].结论: 化学合成的靶向HIF-1α的siRNA能够下调Tca8113细胞中HIF-1α基因的表达,降低细胞对ECM的黏附和侵袭力,可能成为抑制肿瘤转移的基因治疗的新途径或新靶点.