牛眼小梁细胞体外培养技术的改进

目的 改进体外培养牛眼小梁细胞的方法。方法 分别采用常规和改进的方法对牛眼小梁细胞行体外原代及传代培养,比较两者在组织成活率、细胞贴壁率、生长曲线上的差异,并做组织学特异染色鉴定,应用光学显微镜、电子透射显微镜对原代及传代培养的细胞进行形态学及生长特性的观察。结果 牛眼小梁细胞培养成功,两种方法对培养无明显影响。结论 应用加有小牛血清的培养液可在不影响培养效果前提下明显降低实验成本,而且选择性的收集小梁组织块是培养成功及保证成活率的有效手段。     

牛眼前房小梁细胞体外培养的建立

牛眼前房小梁细胞体外培养的建立杨新光，李美玉，张东杲（唐都医院眼科西安７１００３８北京医科大学北大医院眼科）关键词细胞培养；小梁网；牛眼中图号Ｒ７７５．２前房角小梁网是房水排出的主要途径，也是目前认为原发性开角型青光眼的主要病变所在．房水流出通道的大...     

整合素β1在体外培养牛眼小梁细胞中的表达

目的 探讨体外培养小梁细胞表面整合素表达及其意义.方法 对牛眼小梁细胞进行原代及传代培养,并行鉴定.对传三代的牛眼小梁细胞施加整合素β1一抗,后分别给予荧光和多聚辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗,并将细胞置于荧光倒置显微镜下观察摄像.结果 应用免疫荧光和免疫酶技术方法 均可观察到培养小梁细胞表面整合素β1阳性染色.结论 体外培养的牛眼小梁细胞表达整合素β1,为以后研究原发性开角型青光眼病因学提供良好实验基础.     

转化生长因子-β2对牛眼小梁细胞吞噬功能的影响

观察转化生长因子β2(transforminggrowthfactor-β2,TGF-β2)对体外培养牛眼小梁细胞吞噬功能的影响.体外培养牛眼小梁细胞经0、0.32、1.00、3.20 ng/ml TGF-β2处理24 h后,加入乳胶微粒,24 h后作瑞氏染色,光镜下数取相邻20个细胞中的微粒数.结果发现0.32、1.00、3.20 ng/ml TGF-β2可促进牛眼小梁细胞吞噬乳胶微粒,与对照组比较有显著差异;同时呈现明显的量效关系.提示TGF-β2可促进牛眼小梁细胞的吞噬功能.     

转化生长因子—β2对牛眼小梁细胞吞噬功能的影响

观察转化生长因子β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2）对体外培养牛眼小梁细胞吞噬功能的影响。体外培养牛眼小梁细胞经0、0．32、1．00、3．20ng/ml TGF-β2处理24h后，加入乳胶微粒，24h后作瑞氏染色，光镜下数取相邻20个细胞中的微粒数。结果发现：0．32、1．00、3．20ng/mlTGF－β2可促进牛眼小梁细胞吞噬乳胶微粒，与对照组比较有显著差异；同时呈现明显的量效关系。提示TGF－β2可促进牛眼小梁细胞的吞噬功能。     

压力对体外培养牛眼小梁细胞的影响

目的：观察压力对体外培养牛眼小梁细胞的影响．方法：对体外培养的牛眼小梁细胞施以不同程度的压力，用倒置相差显微镜，光镜，电镜观察细胞形态结构变化，台盼蓝染色观察比较各组细胞活力的差别．结果：当作用于细胞的压力为1．33和2．67kPa(1kPa＝7．5mmHg)，作用时间为48h时，与对照组比较，形态结构无明显变化，台盼蓝计数无显性差异(P＞0．05)，而当压力为5．33kPa作用时间为24h时，细胞形态结构有轻度的损伤，随着压力和作用时间的进一步增加，细胞的损伤程度也进一步加重。结论：小梁细胞承受压力的能力是有限的，压力过高或受压时间过长都会对细胞造成损伤。     

体外培养的人眼小梁细胞的观察

自１９８６年，我们共培养９９只人眼的小梁组织，原代培养成活率为１８．２％，其中供体年龄小于２岁者成活率２２．５％；在２４ｈ内取材者为２７．３％。共传１４～１６代，细胞生长呈有限性。成活的小梁细胞在第３～７代生长最快，细胞形态与活体小梁细胞相似。研究这些细胞将有助于我们了解小梁细胞形态和功能变化的特点。     

可见光对体外培养的牛眼小梁细胞的影响

目的：探索光线对小梁细胞的生物学影响。方法：用不同波长、不同功率的可见光照射体外培养的牛眼小梁细胞,观察小梁细胞的形态结构、增殖及吞噬功能的影响。结果：小功率的可见光对细胞无明显影响,当光的功率增加到1．12mw/cm^2时,出现细胞浆粗糙、细胞增殖减慢、细胞吞噬功能降低。这种光毒性作用以白光(混合波长光)最大,紫光和黄光次之,红光最小。结论：可见光在能量较高时对小梁细胞有光毒性损伤,提示我们在手术或眼部检查时尽可能避免强光长时间照射眼睛。     

大麻素WIN55，212-2对体外培养牛眼小梁细胞cAMP表达的影响

目的通过研究大麻素WIN55,212-2对体外培养牛眼小梁细胞（BTMC）环腺苷酸（cAMP）表达的影响,探讨其增加房水排出而降低眼压的机制。方法对BTMC进行体外原代培养及传代培养,应用免疫组化的方法鉴定细胞。然后用不同浓度的WIN55,212-2作用于BTMC,放射免疫法检测细胞上清液中cAMP的水平。结果WIN55,212-2浓度在0．1-20μmol／L范围内,培养液中cAMP水平随浓度增加而显著性升高,若WIN55,212-2浓度继续增高（40-60btmol／L）,cAMP水平不再升高。结论WIN55,212-2可能通过提高BTMC内cAMP水平而起到降低眼压的作用。     

丝裂霉素C对体外培养牛眼小梁细胞毒性的研究

向第3～4代牛眼小梁细胞（bovinetrabecularmeshworkcell，BTMcell）体外培养液内加入不同浓度的丝裂霉素C（MitomycinC，MMC），通过光镜、电镜等观察该药对细胞的形态、结构及吞噬功能的影响.发现MMC可以引起细胞皱缩变形，超微结构中出现线粒体及科面内质网扩张、核固缩或核碎裂等，细胞吞噬微球的数目也有所减少。苔盼蓝染色结果显示MMC不影响小梁细胞存活的浓度为1×10(-7)g／L，半数致死量为1×10(-4)～1×10(-3)g／L。MMC的临床应用是否会对小梁细胞造成损伤值得进一步研究。     

转化生长因子β1对体外培养hRPE细胞增殖率及Ⅰ型胶原表达的影响

目的:探讨TGF-β1对体外培养人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞增殖率及I型胶原表达的影响。方法:实验组用0.1、1、10μg/L的TGF-β1对体外培养hRPE细胞进行干预,对照组只加培养液培养hRPE细胞,用RT-PCR与酶联免疫吸附法检测Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达,用MTT法检测细胞的增殖率。结果:实验组hRPE细胞Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量及细胞增殖率较对照组明显增高(P<0.05),1μg/L组进一步升高(P<0.05),10μg/L组达高峰(P<0.05),呈现明显的剂量依赖性,TGF-β1浓度与Ⅰ型胶原蛋白的表达及增殖率的相关系数r分别为0.863及0.901。结论:TGF-β1能够促进hRPE细胞Ⅰ型胶原的表达和细胞的增殖,这种现象与TGF-β1的浓度成正相关。     

人眼小梁网细胞的体外培养

目的 探讨体外培养人眼小梁网细胞的方法并观测其生物学特性。方法 采用组织块培养方法进行体外细胞培养，二甲基噻唑二苯基四唑溴盐比色法、倒置显微镜、透射电镜，免疫细胞化学等方法观察体外培养细胞的生物学特性并进行鉴定。结果 组织块培养7～15d后可见细胞从其边缘向外生长。倒置显微镜下成梭形、圆形、椭圆形、并有多个突起；电镜可见小梁网细胞表面有较多微绒毛，细胞间缝隙连接，胞质内见很多次级溶酶体。免疫细胞化学检测纤维黏连蛋白、层黏连蛋白和神经元特异性烯醇化酶染色阳性。这些特征可与角膜内皮细胞和巩膜成纤维细胞相鉴别。结论 组织培养方法能够成功体外培养人眼小梁网细胞。     

地塞米松抑制培养牛眼小梁细胞AQP1表达

目的测定地塞米松对体外培养牛眼小梁细胞水通道蛋白-1(aquaporin1,AQP1)表达的影响,探讨糖皮质激素性青光眼房水引流阻力的形成机制。方法将传3代的牛眼小梁细胞用数字表法随机分为对照和地塞米松处理组。将不同浓度的地塞米松(10-5、10-6、10-7mol/L)分别加入培养液持续培养14 d,免疫细胞化学方法检测小梁细胞AQP1表达水平,计算机图像分析软件测量细胞表面积。结果经不同浓度地塞米松处理后的小梁细胞AQP1表达量吸光度值A显著低于对照组(均P=0.000)。10-7mol/L地塞米松作用下细胞表面积显著大于对照组,而10-6mol/L和10-5mol/L地塞米松作用下细胞表面积显著低于对照组(均P=0.000)。结论地塞米松抑制牛眼小梁细胞AQP1表达,可能参与了糖皮质激素性青光眼的发生。     

转化生长因子-β1抗体对体外培养肝星状细胞内皮素和一氧化氮的影响

目的:研究转化生长因子-β1 (TGF-β1)抗体对肝星状细胞(HSC)分泌一氧化氮(NO)和内皮素-1(ET-1)的影响. 方法: HSC以1×108/L的密度接种于细胞培养皿中,37℃,50 mL/L CO2条件下培养24 h进行以下分组实验,每组重复4个培养皿:① HSC空白对照组;② HSC TGF-β1抗体. TGF-β1抗体为5～20 mg/L,继续培养24 h. 取培养上清液,用硝酸还原酶法测定NO水平,化学比色法测定一氧化氮合成酶(NOS)活性,酶联免疫吸附(ELISA)双抗体夹心法检测ET-1含量. 结果: TGF-β1抗体能明显抑制HSC分泌ET-1,且随着抗体剂量的增加ET-1含量降低,对照组、10,15 mg/L TGF-β1抗体组分别为(8.50±0.46),(5.33±0.27), (3.69±0.33)μg /L,且各剂量组之间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05);随着TGF-β1抗体剂量加大,iNOS活性和NO的合成增加,对照组,10,15 mg/L TGF-β1抗体组分别为(1.94±0.16),(3.29±0.42),(3.88±0.32) ku/L和(46.75±4.72), (80.68±5.44), (88.58±2.84) μmol/L. 结论: TGF-β1抗体能降低HSC ET-1水平,增加NO含量.     

转化生长因子β1和转化生长因子βⅡ受体蛋白在口腔鳞状细胞癌中的表达

目的 :研究口腔鳞状细胞癌组织中TGFβ1和TGFβRⅡ的表达及其临床意义。 方法 :用链霉素亲生物素 过氧化酶免疫组织化学 (SP)法检测 4 0例口腔鳞状细胞癌组织中TGFβ1和TGFβRⅡ的表达 ,分析TGFβ1和TGFβRⅡ的表达与临床病理参数的关系。结果 :TGFβ1表达阳性率为 5 5 % (2 2 / 4 0 ) ,TGFβRⅡ表达阳性率为 6 0 % (2 4 / 4 0 )。TGFβ1和TGFβRⅡ的表达与口腔鳞状细胞癌患者的年龄、性别及组织分化程度无明显关系 (P >0 .0 5 ) ,与临床分期和淋巴结转移有关。Ⅲ +Ⅳ期与Ⅰ +Ⅱ期比较 ,原发灶中TGFβ1表达率有升高趋势、TGFβRⅡ表达率有降低趋势(P <0 .0 5 )。有淋巴结转移者与无淋巴结转移者比较 ,原发灶中TGFβ1表达率有升高趋势、TGFβRⅡ表达率有降低趋势 (P <0 .0 5 )。结论 :TGFβ1和TGFβRⅡ的表达与口腔鳞状细胞癌的增殖、浸润和转移有关 ,检测口腔鳞状细胞癌中TGFβ1和TGFβRⅡ的表达有助于临床诊断和治疗。     

压力对人眼小梁细胞自分泌TGF-β2的影响

目的 采用开放式压力控制培养系统研究压力对体外培养的人眼小粱细胞自分泌转化生长因子-β2（TGF-β2）的影响，探讨TGF-β2在原发开角型青光眼发病机制中的作用。方法 体外培养人眼小梁细胞并传至第5代。对照组不施加压力（0mmHg，1mmHg=0．133kPa），实验组施加20、40、60及80mmHg压力，分别持续0、12、24、36h。采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法测定细胞上清液中TGF-β2浓度。结果 小梁细胞自分泌TGF-β2随压力增高而增加，与对照组比较，差异有显著性意义（P〈0．05）；在20～60mmHg范围内，加压时间越长，TGF-β2增高越明显；虽然80mmHg压力水平下TGF-β2增高幅度下降，但加压12和24h组TGF-β2水平仍明显高于对照组（P〈0．05）。结论随压力增高，小梁细胞自分泌TGF-β2增多，其水平与压力大小及作用时问相关，推测TGP-β2分泌异常可能是原发开角型青光眼病理进程中的重要机制之一。     

大麻素WIN55,212-2对体外培养牛眼小梁细胞MMP-3、MMP-9及TIMP-1表达的影响

目的研究大麻素WIN55,212-2对体外培养的牛眼小梁细胞MMP-3、MMP-9及TIMP-1表达的影响,从而探讨其降眼压机制。方法采用组织块培养法对牛眼小梁细胞进行原代及传代培养,应用免疫组化方法（NSE,Ⅷ因子相关抗原染色）鉴定细胞,应用透射电镜对细胞进行形态学及生长特性观察;对传3代的小梁细胞分别施加含大麻素WIN55,212-2终浓度为0（对照组）、1、10、20、40μmol/L的培养液,48h后行MMP-3和MMP-9免疫组化SP染色,结果进行计算机图像分析并进行统计学检验。提取上清液用ELASA法检测随浓度的不同TIMP-1量的变化。结果体外培养的牛眼小梁细胞表达MMP-3及MMP-9,大麻素WIN55,212-2可促进MMP-3及MMP-9的表达,并抑制TIMP-1的表达。结论一定剂量的大麻素可以促进牛眼小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达（P〈0.05）,并抑制TIMP-1的表达（P〈0.01）,从而达到降低眼压的目的。     

血管紧张素Ⅱ对体外培养牛眼小梁细胞的影响

目的 :观察血管紧张素Ⅱ (AngiotensinⅡ ,AngⅡ )对体外培养的牛眼小梁细胞 (bovinetrabecularmeshworkcell,TMcell)形态及胶原合成的影响 ,探讨AngⅡ在原发性开角型青光眼 (primaryopen angleglaucoma ,POAG)发病机制中的意义 .方法 :AngⅡ (10 ,1,0 .1μmol·L-1)孵育TM细胞12～ 2 4h ,采用倒置显微镜观察细胞形态及计算机图像分析系统计算细胞面积 .用化学方法检测培养液中羟脯氨酸含量间接推测胶原含量 .结果 :AngⅡ产生明显细胞收缩效应 ,呈浓度依赖性 ,但细胞间连接无改变 ;AngII组细胞面积减小与对照组有显著性差异 (P <0 .0 5 ) .培养液中的羟脯氨酸含量明显升高 ,呈浓度依赖性 ,与对照组有显著性差异 (P <0 .0 5 ) .结论 :AngⅡ引起TM细胞浓度依赖性收缩 ,同时使胶原合成增强 ,是影响房水排除 ,导致青光眼的因素之一