基于PI3K/AKT信号通路研究丹酚酸B对成骨细胞骨形成的调控作用

目的探讨磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路在丹酚酸B对成骨细胞骨形成的调控作用。方法 0.00、0.01、0.03、0.10、0.30、1.00 nmol/L的丹酚酸B作用MC3T3-E1细胞12、24、36 h,MTT法检测细胞活力,RT-PCR法检测碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)、Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、骨钙素(OCN)mRNA表达,Western印迹检测细胞中ALP、OPN、COLⅠ、OCN及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。结果与0.00 nmol/L比较,0.03、0.10、0.30 nmol/L丹酚酸B组细胞活力显著提高(P0.01),ALP、OPN、COLⅠ、OCN蛋白及mRNA表达量上调(P0.01),PI3K及p-AKT表达量上调(P0.01);而LY294002组ALP、OPN、COLⅠ及OCN蛋白及mRNA表达量下调(P0.01),PI3K及p-AKT表达量下调(P0.01)。与LY294002组比较,丹酚酸B+LY294002组ALP、OPN、COLⅠ、OCN蛋白及mRNA表达量上调(P0.01),PI3K及p-AKT表达量上调(P0.01)。结论丹酚酸B通过激活PI3K/AKT信号通路促进MC3T3-E1细胞骨形成。     

华蟾毒精抑制人肝癌细胞株增殖、促凋亡作用及机制探讨

目的:观察华蟾毒精对人肝癌细胞株增殖抑制及促凋亡作用,并探讨其机制。方法:选取人肝癌细胞HepG2进行培养,取对数生长期HepG2细胞分为实验组1(浓度为25μmol/L华蟾毒精处理)、实验组2(浓度为50μmol/L华蟾毒精处理)、实验组3(浓度为100μmol/L华蟾毒精处理)和对照组(加等体积的生理盐水),培养24h、48h后采用MTT法和流式细胞术检测对照组和实验组肝癌细胞HepG2增殖抑制率和凋亡率。培养48h后荧光定量PCR检测AKT、mTOR、Caspase3、Bax和Bcl-2 m RNA表达量,免疫印迹法检测Caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表达量。结果:培养24h、48h,实验组1、实验组2和实验组3细胞增殖抑制率均显著高于对照组(P0.05),且实验组间两两比较差异均有统计学意义(P0.05);培养24h、48h实验组1、实验组2和实验组3细胞凋亡率均显著高于对照组(P0.05),实验组间两两比较差异均有统计学意义(P0.05);培养48h,实验组1、实验组2和实验组3细胞AKT、mTOR、Bcl-2 m RNA表达量与对照组相比均显著降低(P0.05),Bax和Caspase-3 m RNA表达量均显著增加(P0.05),且实验组Caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表达与m RNA表达结果趋势一致。结论:华蟾毒精能够抑制肝癌细胞HepG2增殖,并促进其凋亡,作用机制可能与通过下调Bcl-2蛋白和上调Bax、Caspase-3蛋白的表达,调控AKT/mTOR信号通路有关。     

IL-8对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其机制研究

目的探讨白细胞介素-8(IL-8)在肝癌细胞中的表达及其对增殖、迁移、侵袭的影响并分析其可能作用机制。方法采用qRT-PCR与Western blot方法分别检测肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721及正常肝细胞L02中IL-8 mRNA和蛋白表达水平。将IL-8 siRNA转染至HepG2细胞,MTT检测沉默IL-8对HepG2细胞增殖能力的影响,Transwell迁移及侵袭实验检测沉默IL-8对HepG2细胞迁移及侵袭能力的影响,采用qRT-PCR与Western blot方法分别检测MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达水平。Western blot法检测沉默IL-8对磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路蛋白表达的影响。HepG2细胞中加入PI3K/Akt信号通路抑制剂(LY294002),观察其对HepG2细胞增殖、迁移及侵袭的影响。结果相较于L02相,肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721中IL-8 mRNA及蛋白表达均显著升高(P 0. 05); HepG2细胞中敲低IL-8后细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显减弱,MMP-2、MMP-9及PI3K、p-AKT表达水平均明显降低;加入LY294002可明显抑制HepG2细胞增殖、迁移及侵袭能力。结论 IL-8可能通过激活PI3K/Akt信号通路进而增强肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力。     

过表达miR-150通过PI3K/AKT信号通路调控结直肠癌细胞凋亡的机制研究

目的探讨过表达miR-150通过磷脂酰肌醇-3-羟激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxykinase/seronine kinase,PI3K/AKT)信号通路调控结直肠癌细胞凋亡的机制。方法将体外培养HT-29细胞分为空白对照组(转染空脂质体) NC组(转染mimic)和miR-150(转染miR-150 mimic);采用RT-PCR检测转染后细胞中miR-150 mRNA水平; CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡; WB法检测Cleaved caspase3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达。将对数生长期HT-29分为阴性对照组、miR-150组、LY294002组和LY294002+miR-150组,采用PI3K抑制剂验证LY294002在HT-29细胞凋亡中的作用。结果与空白对照组和NC组相比,miR-150组细胞中miR-150 mRNA水平明显升高(P 0. 05),24 h、48 h、72 h和96h的细胞抑制率明显升高(P 0. 05),细胞凋亡率明显升高(P 0. 05),Bcl-2/Bax、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白的表达明显降低(P 0. 05),cleaved Caspase-3蛋白的表达明显升高(P 0. 05);与阴性对照组相比,miR-150组和LY294002组p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax蛋白表达均明显降低(P 0. 05),cleaved Caspase-3蛋白表达明显升高(P 0. 05);与miR-150组相比,LY294002+miR-150组p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax蛋白表达均明显升高(P 0. 05),cleaved Caspase-3蛋白表达明显降低(P 0. 05)。结论 miR-150过表达可能通过负调控PI3K/AKT信号通路抑制人结直肠癌细胞的增殖,促进其凋亡。     

HIF-2α基因沉默对人肝癌细胞株HepG2增殖能力的影响

目的探讨缺氧诱导因子-2α(hypoxia-inducible factors-2α,HIF-2α)表达水平对人肝癌细胞株HepG2增殖能力的影响。方法用氯化钴(CoCl_2)诱导细胞模拟缺氧微环境,并根据CoCl_2浓度不同分为50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L组,选择CoCl_2浓度为200μmol/L模拟肿瘤内缺氧微环境。采用siRNA干扰沉默HepG2细胞中HIF-2α的表达,分别应用RT-PCR、Western blotting方法检测HIF-2αmRNA和蛋白的表达,MTT方法检测HepG2细胞增殖,绘制细胞生长曲线,流式细胞技术观察细胞周期的改变。结果建立细胞缺氧模型,作为低氧组;采用浓度为50 nmol/L的HIF-2αsiRNA转染缺氧环境下的HepG2细胞,作为低氧+HIF-2αsiRNA组,结果显示:低氧组、低氧+Control siRNA组的HIF-2αmRNA和蛋白表达显著高于常氧组和低氧+HIF-2αsiRNA组(P0.05);细胞生长曲线结果显示:低氧组、低氧+Control siRNA组的光密度值显著高于常氧组和低氧+HIF-2αsiRNA组(P0.05);细胞周期结果显示:低氧组、低氧+Control siRNA组HepG2细胞在DNA合成前期(G0/G1期)细胞比率显著低于常氧组和低氧+HIF-2αsiRNA组,合成期(S)及合成后期(G2/M)细胞比率显著高于常氧组和低氧+HIF-2αsiRNA组(P0.05)。结论缺氧微环境通过促进人肝癌细胞株HepG2细胞中HIF-2α的表达进一步促进HepG2细胞增殖,而针对HIF-2α的靶向siRNA能有效抑制肝癌HepG2细胞中HIF-2α的表达,从而抑制HepG2细胞的增殖。     

塞来昔布对幽门螺杆菌感染的胃癌细胞凋亡及炎症反应的影响

目的探讨塞来昔布对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染的胃癌细胞凋亡及炎症反应的影响及机制。方法以终浓度为50、75、100μmol/L的塞来昔布作用于H.pylori感染的人胃癌SGC-7901细胞,MTT法检测作用24、48和72 h的细胞增殖;作用48 h,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting检测PCNA、Bcl-2、Bax和p-AKT3蛋白表达,qRT-PCR检测IL-6、IL-8和miR-145表达。双荧光素酶报告基因实验检测miR-145和AKT3的靶向关系。结果不同浓度塞来昔布均可明显抑制SGC-7901细胞增殖,且呈剂量、时间依赖性(P0.05)。不同浓度塞来昔布均可明显促进细胞凋亡,下调PCNA、Bcl-2、p-AKT3、IL-6和IL-8表达,上调Bax和miR-145表达,呈剂量依赖性(P0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-145和AKT3存在靶向关系。结论塞来昔布可抑制H.pylori感染的胃癌细胞增殖,促进细胞凋亡,降低炎症因子IL-6和IL-8表达,机制可能与塞来昔布引起miR-145表达改变进而调控其靶基因AKT3表达有关。     

大黄素在体外诱导人肝癌Hep3b细胞凋亡的作用及机制

目的了解大黄素在体外诱导人肝癌Hep3b细胞凋亡的作用及机制。方法采用MTT法测定不同浓度大黄素对人肝癌Hep3b细胞的抑制作用,不加大黄素作为对照组;采用流式细胞仪检测大黄素作用后的Hep3b细胞的增殖周期,计算细胞增殖指数(PI);Western印迹法检测Hep3b细胞凋亡相关蛋白AKT、Bcl-2、p-AKT和酶切caspase-3的相对表达量。结果 1、5、25、125μmol/L大黄素作用24 h后的OD值均低于对照组(t=1.694、6.129、13.400、34.739,P均<0.05);随着大黄素浓度的升高,它对Hep3b细胞的抑制率呈上升趋势;作用24 h时,大黄素对Hep3b细胞的半抑制浓度(IC50)为21.08μmol/L。25、125μmol/L大黄素作用24、36 h后,Hep3b细胞的G_0/G_1期比例增高(P<0.05),S期比例、PI降低(P<0.05),因而表现出浓度、时间依赖性。大黄素作用时间增加后,抑制细胞凋亡的Bcl-2(24 h:t=2.610;36 h:t=5.713)、p-AKT蛋白(12 h:t=2.075,24 h:t=5.157;36 h:t=12.926)的表达量呈下降趋势(P均<0.05),促进细胞凋亡的酶切caspase-3蛋白的表达量呈上升趋势(6、12、24、36 h:t=2.487、3.327、5.276、8.137,P均<0.05)。结论大黄素在体外通过诱导细胞凋亡而抑制人肝癌Hep3b细胞的增殖,大黄素是通过AKT信号途径诱导Hep3b细胞凋亡。     

PI3K/AKT抑制剂对肺腺癌细胞株生长的影响

目的检测磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K/AKT）特异性抑制剂Ly294002对肺腺癌细胞系XWLC-05增殖和凋亡的作用。方法 MTT法检测Ly294002对肺腺癌细胞XWLC-05体外细胞培养株诱导凋亡作用,流式细胞术测定不同条件下细胞的周期分布比例和细胞凋亡情况。结果 Ly294002对XWLC-05细胞株生长有抑制作用,但Ly294002需达到50μmol.L-1才能产生明显差异。Ly294002处理XWLC-05细胞24 h、48 h后G2/M期细胞相对增加,有统计学意义（P〈0.05）,凋亡细胞增加,但无统计学意义（P〉0.05）。结论 LY294002对肺腺癌细胞有抑制生长的作用,且抑制细胞增殖与导致细胞凋亡并无直接关系。     

胡桃醌对胃癌细胞耐药性及细胞中ANXA2、ERCC1表达和AKT/mTOR信号通路的影响

目的研究胡桃醌对胃癌细胞顺铂耐药性及细胞中膜联蛋白A2(ANXA2)和切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达,及对AKT/mTOR信号通路的影响。方法将BGC-823/DDP细胞株随机分为5组:对照组、胡桃醌组、顺铂组、胡桃醌联合顺铂组、LY294002(AKT抑制剂)联合顺铂组。采用MTT法和流式细胞术检测细胞活性和凋亡率,Western blotting检测细胞中相关蛋白表达。结果与对照组比较,顺铂组细胞凋亡率及细胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平升高(P<0.05),而ANXA2、ERCC1、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平降低(P<0.05);与顺铂组比较,胡桃醌不同浓度组细胞中P-gp、MRP1蛋白表达水平降低(P<0.05),细胞增殖抑制率、细胞凋亡率及细胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平升高(P<0.05),ANXA2、ERCC1、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平降低(P<0.05);与顺铂组比较,LY294002处理后,细胞增殖抑制率和凋亡率升高(P<0.05)。结论胡桃醌增强胃癌细胞对顺铂的敏感性,抑制细胞中ANXA2和ERCC1表达,抑制AKT/mTOR信号通路。     

水飞蓟素改善棕榈酸引起的胰岛素抵抗及机制初步探讨

目的评价水飞蓟素(Sil)对棕榈酸(PA)诱导HepG2细胞IR的作用并进一步揭示其机制。方法实验分为正常对照(NC)组,棕榈酸(PA)组,Sil干预低剂量(12.5μmol/L,L-Sil)组、中剂量(25μmol/L,M-Sil)组和高剂量(50μmol/L,H-Sil)组。PA诱导HepG2细胞IR,分别给予12.5,25,50μmol/L Sil作用6 h,测定葡萄糖消耗量,使用活性氧簇(ROS)试剂盒测定ROS活性水平。采用Western blot方法检测AKT以及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的NOX2、p67phox、p47phox蛋白表达水平。结果PA组与NC组比较,葡萄糖耗氧量降低[(41.2±6.1)%vs(100±12)%,P=0.0087],磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达量降低[(0.458±0.185)vs(1.00±0.13),P=0.0184],同时PA组ROS水平[(1567±189 vs(14±34)U/ml,P=0.0094]以及NAPDH氧化酶NOX2、p67、p47亚基的表达水平升高(P0.05)。Sil各组与PA组比较可增加葡萄糖消耗量[(52.8±8.4)%vs(62.2±6.5)%vs(82.3±9.8)%],差异有统计学意义(P=0.041、0.039、0.0076);H-Sil组磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达量提高(0.793±0.249),与PA组比较,差异有统计学意义(P=0.0395);Sil可降低ROS水平[(1085±252)vs(851±184)vvs(405±35)],与PA组比较,差异有统计学意义(P=0.047、0.023、0.0015),以及降低NAPDH氧化酶NOX2、p67、p47亚基的表达水平(P0.05),且作用强度随Sil剂量的增加而增强。结论Sil可能通过降低NADPH氧化酶活性降低氧化应激,从而改善HepG2细胞的IR。     

IGF-1经AKT通路对人肺癌A549细胞增殖、侵袭与转移的影响

目的探究胰岛素生长因子(IGF)-1能否经蛋白激酶B(AKT)信号通路调节人肺癌A549细胞的增殖、侵袭与转移。方法体外培养人肺癌A549细胞融合至70%～80%,经无血清饥饿过夜,分为对照组、LY294002组、IGF-1组和IGF-1+LY294002组,继续饥饿培养48 h。噻唑蓝(MTT)法、细胞划痕实验和Transwell实验检测A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力;Western印迹法检测磷酸化(p)-AKT、AKT、基质金属蛋白酶(MMP)-9、小鼠双微体扩增基因(MDM)2和上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)蛋白表达。结果与对照组相比,IGF-1组可明显促进细胞增殖,加速细胞迁移与侵袭,并伴有p-AKT、MMP-2、MDM2蛋白表达增加及E-cadherin蛋白表达降低(P0.05);AKT通路特异性抑制剂LY294002可显著抑制上述作用。结论 IGF-1可能经AKT信号通路上调MMP-9、MDM2蛋白表达并抑制E-cadherin蛋白表达,进而促进人肺癌A549细胞的增殖、侵袭与转移。     

艾塞那肽对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的保护作用及机制研究

目的探讨艾塞那肽对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的作用及相关机制。方法将足细胞系MPC5细胞按照不同葡萄糖培养浓度和干预因素分为以下5组:正糖对照组(5.5 mmol/L葡萄糖,n=3)、甘露醇高渗对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇,n=3)、高糖组(25.0 mmol/L葡萄糖,n=3)、高糖+艾塞那肽组(25.0 mmol/L葡萄糖+100 nmol/L艾塞那肽,n=3)和高糖+艾塞那肽+LY294002组(25.0 mmol/L葡萄糖+100 nmol/L艾塞那肽+50μmol/L磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂LY294002,n=3)。采用原位缺口末端标记法荧光染色观察细胞凋亡,膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡率,Western blot检测细胞内裂孔膜肾病蛋白(nephrin)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)以及磷酸化Bcl-xL/Bcl-2相关死亡启动子(p-BAD)水平。多组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用最小显著性差异t检验。结果与正糖对照组和甘露醇高渗对照组比较,高糖组足细胞凋亡率显著增加[分别为(28.60±2.65)%、(4.50±0.75)%和(4.55±0.65)%,t=-19.19、-19.15,均P<0.01],细胞内nephrin蛋白表达降低(分别为0.22±0.03、0.72±0.06和0.73±0.08,t=11.43、11.52,均P<0.01),p-AKT和p-BAD蛋白表达下调(分别为0.14±0.03、0.83±0.06和0.86±0.04,0.16±0.03、0.66±0.06和0.68±0.04,均P<0.01)。与高糖组比较,高糖+艾塞那肽组足细胞凋亡率显著下降,细胞内nephrin表达升高,p-AKT和p-BAD蛋白表达上调(均P<0.01)。而高糖+艾塞那肽+LY294002组较高糖+艾塞那肽组足细胞凋亡率增加,细胞内nephrin蛋白表达降低,p-AKT和p-BAD蛋白表达下调(均P<0.05)。结论艾塞那肽通过上调足细胞中nephrin蛋白表达和减少足细胞凋亡从而保护高糖诱导的足细胞,其机制可能与激活AKT/BAD信号途径有关。     

表没食子儿茶素没食子酸酯通过PI3K/AKT信号通路抑制人肝癌细胞株HepG2增殖和促进凋亡

目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG),对人肝癌细胞株HepG2的作用及其机制.方法:对数生长期的HepG2细胞分别用不同浓度的EGCG处理(0、10、20、40冚g/mL).细胞培养48 h后,利用MTT检测细胞增殖;流式检测细胞凋亡和膜电位,免疫印迹法检测磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3 kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、p-AKT、BCL-2、Bax、proCaspase3、clevage-Caspase3、多聚ADP-核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polyrnerase,PARP]、Clevage-PARP和细胞色素C(cytochrome C,CytC)表达.结果:EGCG可以成浓度依赖诱导HepG2细胞增殖抑制和凋亡,上调Bax,pro-Caspase3,PARP和CytC表达,下调PI3K,p-AKT,Cleavage-PARP,Cleavage-Caspase3和Bcl-2的表达和细胞膜电位,但对AKT表达无明显影响.结论:EGCG可通过抑制PI3K/AKT信号通路而诱导HepG2细胞增殖抑制和凋亡.     

PI3K阻断剂LY294002对TNF-α诱导心肌肥大的Ca~(2+)-CaMKⅡ和CaN通路的影响

目的研究PI3K是否通过Ca2+-Ca MKⅡ和Ca N信号途径参与肿瘤坏死因子-α诱导的心肌肥大。方法应用激光共聚焦显微镜检测单个心肌细胞内Ca2+浓度变化。Lowry法测心肌细胞蛋白含量。计算机图象分析测心肌细胞体积。应用Western blot法测定心肌细胞Ca MKⅡδB和Ca N蛋白表达。结果 1PI3K阻断剂LY294002(50μmol/L)明显抑制TNF-α(100μg/L)诱导的心肌细胞内钙离子浓度增高(P0.01),对正常心肌细胞内Ca2+浓度无明显影响。其抑制程度与LY294002+2-APB(30μmol/L)组相近(P0.05),小于LY294002+ryanodine(50μmol/L)组(P0.05)。2LY294002明显抑制TNF-α诱导的心肌细胞蛋白含量的增加及细胞体积的增大;其程度与LY294002+2-APB无统计学差异,但大于单用2-APB组,小于LY294002+ryanodine组(P0.05)。PI3K阻断剂LY294002明显抑制TNF-α诱导的心肌细胞Ca MKⅡδB和Ca N表达增加(P0.01),其抑制程度与LY294002+2-APB组相近(P0.05)。结论 PI3K通过作用IP3R使心肌细胞内Ca2+浓度增加,进而调节心肌细胞内Ca MKⅡδB和Ca N的表达,从而参与TNF-α诱导的心肌肥大。     

成纤维细胞生长因子21对二乙基亚硝胺诱导的L02肝细胞癌变的抑制作用

目的探讨成纤维细胞生长因子(FGF)21对二乙基亚硝胺(DEN)诱导的L02肝细胞癌变的抑制作用。方法培养L02肝细胞,分别用不同浓度的DEN(1、10、20、50、100和150μmol/L)作用,MTT法测定DEN对L02肝细胞活力的影响,选择适当的DEN刺激浓度(20μmol/L)进行后续实验。同时,分别采用丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒检测DEN(20μmol/L)作用细胞和正常L02细胞内的MDA及SOD水平。将L02肝细胞分为模型对照组(20μmol/L DEN+PBS处理)、FGF21低剂量组(20μmol/L DEN+1μmol/L FGF21蛋白)和FGF21高剂量组(20μmol/L DEN+2μmol/L FGF21蛋白)。细胞培养12 h后,检测细胞内的MDA及SOD水平。同时采用Real-time PCR和Western Blot检测β-Klotho(KLB)的表达水平,并用Western Blot检测蛋白激酶B(PKB,又称AKT)磷酸化水平。计量资料2组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 DEN作用于L02后细胞内MDA水平明显升高,SOD水平显著下降,差异均有统计学意义(t值分别为9.336和16.281,P值分别为0.011和0.004)。与模型对照组相比,FGF-21低剂量组和FGF-21高剂量组细胞内MDA水平下降、SOD水平升高(P值均<0.05),且FGF21高剂量组细胞内MDA水平显著低于FGF21低剂量组,差异有统计学意义(P=0.030),SOD水平则高于FGF21低剂量组,差异有统计学意义(P=0.042)。FGF21高剂量组与FGF21低剂量组细胞内KLB mRNA水平明显高于模型对照组(P值均<0.001),而FGF21高剂量组KLB mRNA水平高于低剂量组,差异有统计学意义(P<0.001),KLB蛋白表达趋势与KLB mRNA相同。模型对照组中磷酸化AKT(p-AKT)水平高于另外2组,同时FGF21高剂量组p-AKT水平低于FGF21低剂量组,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论 DEN可增强L02细胞内氧化应激,FGF21通过上调KLB表达,降低AKT磷酸化水平,抑制DEN诱导L02肝细胞氧化应激,从而抑制肝细胞癌变的发生。     

西罗莫司对肝癌HepG2细胞的增殖及mTOR、HIF-1α的抑制作用

目的:观察西罗莫司对体外培养的肝癌HepG2细胞增殖及mTOR、HIF-1α基因的抑制作用,探讨以mTOR为靶点治疗肝癌可能的细胞内信号转导机制.方法:缺氧培养HepG2细胞,外源性给予不同浓度的西罗莫司(0.1-1000 nmol/L)刺激细胞24h, MTT法检测不同浓度药物对肝癌细胞增殖的影响.Western blot法检测药物刺激后HepG2细胞内mTOR和HIF-1α蛋白的表达.结果:西罗莫司可显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖,其抑制率随药物浓度的增加而上升(均P<0.05).在西罗莫司的干预下,HepG2细胞中mTOR和HIF-1α蛋白的表达水平显著下降,实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论:在缺氧条件下,西罗莫司可通过mTOR信号转导途径下调肝癌HepG2细胞内HIF-1α蛋白表达,诱导细胞凋亡,这可能是西罗莫司发挥抗肿瘤效应的机制之一.     

二甲双胍对肝癌细胞凋亡及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

目的观察二甲双胍对肝癌细胞凋亡的影响,并探讨该作用与PI3K/AKT/m TOR信号通路的关系。方法体外培养人肝癌SMMC-7721细胞,分别加入5、10、20、40、80 mmol/L二甲双胍,另设对照组,加入同体积的培养基培养24、48 h,MTT法检测各组细胞增殖情况,计算细胞存活率和半数抑制浓度(IC50),筛选出适合的药物浓度(5、10、20 mmol/L)和作用时间(48 h)进行后续实验。将SMMC-7721细胞分为二甲双胍组和对照组,二甲双胍组分别加入5、10、20 mmol/L二甲双胍处理48 h,对照组加入同体积的培养基。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白p-AKT、p-mTOR表达。结果 5、10、20、40、80 mmol/L二甲双胍组处理24 h和48 h后,细胞存活率均低于对照组(P <0.05或P <0.01);二甲双胍能够抑制细胞增殖,24 h和48 h的IC50分别为36.05、25.76 mmol/L,后续选择5、10、2...     

miR-182基因对心肌细胞增殖凋亡、ROS水平及PI3K/AKT信号通路的影响研究

目的:探索miR-182基因对心肌细胞增殖凋亡、活性氧簇(ROS)水平及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/AKT)信号通路的影响。方法:将H9C2心肌细胞分为对照组、NC组、H_2O_2组、miR-182mimics组和miR-182inhibitor组,各组细胞均培养24h,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-182的mRNA表达;CCK8法检测各组细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡及ROS含量;Western bloting检测增殖相关蛋白ki67和细胞增殖核抗原(PCNA),凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Caspase-9)及PI3K/AKT信号通路磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶(p-AKT)的蛋白表达。结果:与对照组比较,H_2O_2组细胞miR-182、ki67、PCNA、PI3K、p-AKT表达及细胞增殖均显著降低,细胞凋亡率、ROS含量及Caspase-3和Caspase-9的表达均显著升高(均P0.05);与H_2O_2组比较,miR-182mimics组miR-182、ki67、PCNA、PI3K、p-AKT表达及细胞增殖均显著升高,细胞凋亡率、ROS含量及Caspase-3和Caspase-9表达均显著降低(均P0.05),miR-182inhibitor组miR-182、ki67、PCNA、PI3K、p-AKT表达及细胞增殖显著降低,细胞凋亡率、ROS含量及Caspase-3和Caspase-9表达均显著升高(均P0.05)。结论:H_2O_2刺激可降低H9C2心肌细胞miR-182基因表达,过表达miR-182可促进细胞增殖,降低细胞凋亡,激活PI3K/AKT信号通路,其中对细胞增殖凋亡的影响方式是降低ROS含量,上调ki67和PCNA表达,下调Caspase-3和Caspase-9表达;抑制miR-182表达的结果则相反。     

ARHI基因对胃癌细胞株MKN28增殖、侵袭、凋亡的影响及其机制研究

背景 ARHI已经被证实表达缺失与肿瘤的发生与进展相关.但是,目前尚不清楚ARHI基因对胃癌(gastric cancer, GC)是否具有增殖抑制作用,此次实验以GC细胞株MKN28为例,构建高表达pc DNA3.1-ARHI质粒,通过细胞转染技术转染MKN28细胞株,进一步研究ARHI基因对GC细胞增殖、侵袭及凋亡的影响.目的以GC细胞MKN28为例,研究ARHI基因对GC细胞增殖、侵袭及凋亡的影响,并探讨其机制.方法构建pcDNA3.1-ARHI质粒,通过细胞转染技术转染MKN28细胞株,取处于对数期的空白对照组、阴性对照Mock组及ARHI高表达克隆株clone4细胞进行实验,以MTT比色法检测细胞增殖;细胞划痕检测细胞迁移能力; Transwell法检测细胞侵袭能力;流式细胞术检测细胞凋亡率; Western blot检测相关蛋白表达.结果与正常MKN28细胞48 h增殖率1.257%±0.006%相比,Mock组与ARHI高表达克隆株48h细胞增殖率分别为1.163%±0.003%(P0.05),0.826%±0.005%(P 0.05);与正常MKN28细胞48 h迁移率(19.918%±0.233%)相比, Mock组与ARHI高表达克隆株48 h细胞迁移率分别为18.295%±0.534%(P0.05), 4.299%±1.572%(P0.05);与正常MKN28细胞48 h侵袭率(234±3.61)相比, Mock组与ARHI高表达克隆株48h细胞侵袭率分别为235±4.51(P0.05),93.3±2.08(P 0.05);与正常MKN28细胞48 h总凋亡率(3.513%±0.015%)相比, Mock组与ARHI高表达克隆株48h细胞总凋亡率分别为3.597%±0.25%(P0.05),14.133%±0.032%(P 0.05);Western blot检测各组细胞内蛋白结果显示:与MKN28细胞相比, Mock组中ARHI蛋白为1.037±0.003(P0.05),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)蛋白为1.026±0.008(P0.05),B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白为1.014±0.010(P0.05),蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)蛋白为1.001±0.005(P0.05),磷酸化AKT(p-AKT)蛋白为0.977±0.003(P0.05);高表达克隆株clone4中ARHI蛋白为2.088±0.007(P0.05), VEGF蛋白为0.456±0.004(P 0.05), Bcl-2蛋白为0.468±0.005(P 0.05),AKT蛋白为0.969±0.005(P0.05),p-AKT蛋白为0.502±0.001(P 0.05).结论 ARHI基因过表达可抑制GC细胞MKN28的增殖,促进细胞凋亡,这可能与ARHI基因高表达后导致磷脂酰肌醇3-激酶/AKT通路中的VEGF、p-AKT蛋白表达降低有关.     

活性氧不参与二氯化钴诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖

目的 探讨活性氧是否参与二氯化钴诱导的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)过度增殖.方法 用化学性缺氧模拟剂二氯化钴处理HPASMC,建立缺氧性肺动脉高压血管重塑的细胞模型 用外源性活性氧供体过氧化氢处理HPASMC,观察活性氧对细胞增殖的影响;活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理HPASMC,观察其对二氯化钴或过氧化氢诱导的细胞增殖的改善作用;应用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖,Western blot检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白的表达,双氯荧光素染色和荧光照相术检测细胞内活性氧的含量.结果 在25 ～ 50μmol/L浓度范围内,二氯化钴处理24 h可诱导HPASMC增殖,50 μmol/L二氯化钴处理24 h可使细胞内HIF-1α的水平明显增加;与二氯化钴的作用类似,过氧化氢在12 ～ 25μmol/L浓度范围内处理24 h也可引起细胞增殖,但不改变HIF-1α的水平;在二氯化钴或过氧化氢处理前,用不同浓度的NAC预处理,在1 500 μmol/L浓度时,NAC预处理可明显抑制过氧化氢诱导的HPASMC过度增殖(P＜0.05),而对二氯化钴诱导的细胞增殖则无明显影响(P＞0.05);另外,50 μmol/L二氯化钴处理6～24 h对细胞内活性氧的含量无明显影响(P＞0.05).结论 化学性缺氧可诱导HPASMC过度增殖,其机制可能不依赖于活性氧.