3D打印β-磷酸三钙负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物抗结核药物缓释微球细胞毒性及对BMSCs成骨分化影响的研究

目的研究3D打印技术制备的β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)支架负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide),PLGA]抗结核药物缓释微球的细胞毒性及对BMSCs成骨分化的影响。方法通过复乳溶剂挥发法制备异烟肼、利福平/PLGA缓释微球,3D打印技术制备β-TCP支架,用离心震荡法将微球负载于支架上制备复合材料。采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,取第3代细胞分别与成骨诱导培养液(A组)、PLGA抗结核药物缓释微球浸提液(B组)、3D打印β-TCP支架浸提液(C组)、3D打印β-TCP负载PLGA抗结核药物缓释微球复合材料浸提液(D组)共培养。采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞毒性;茜素红染色观察钙沉积情况;实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,RTq PCR)检测成骨相关基因ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)和骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)的表达。结果 CCK-8法检测示,随培养时间延长A、B、C、D组吸光度(A)值逐渐增加;培养24、48、72 h时,A值按A、C、B、D组顺序递减,除B、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)外,其余各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。细胞毒性评价为0～2级,毒性实验合格。成骨诱导21 d茜素红染色示,各组均有红色矿化结节形成,但矿化结节数量C组D组A组B组。RT-q PCR检测示,随培养时间延长,A、B、C、D组OCN和BSP基因相对表达量均呈逐渐增加趋势;ALP基因相对表达量于7、14 d时呈增高趋势,21 d时有所降低。培养7、14、21 d时ALP、OCN和BSP基因相对表达量均为C组D组A组B组,各时间点各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 3D打印β-TCP负载PLGA抗结核药物缓释微球复合材料对BMSCs无明显细胞毒性,同时在一定程度上促进其向成骨细胞分化。     

插头框旋转录因子C2转染BMSCs后成骨作用的研究

[目的]观察过表达Foxc2基因对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨分化的影响。[方法]构建携带Foxc2和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组慢病毒表达载体,分离、培养兔BMSCs,分别以Lenti-GFP(GFP组)、Lenti-Foxc2(Foxc2组)转染BMSCs,另设未转染BMSCs对照组。MTT法检测过表达Foxc2对细胞增殖能力;Western blot、Real time PCR检测转染后7d各组细胞Foxc2蛋白、m RNA表达;以及转染后1、2、4周各组细胞骨钙蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、一型胶原(COLⅠ)蛋白及m RNA表达;转染后2周,各组行碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性检测。[结果]Foxc2组Foxc2 m RNA和蛋白高效表达;对照组、GFP组无Foxc2 m RNA及蛋白表达;MTT法检测示过表达Foxc2对BMSCs的增殖未产生显著影响;Foxc2组OCN、OPN、COLⅠm RNA和蛋白表达显著高于其他组(P<0.01),余组比较差异无统计学意义(P>0.05);Foxc2组ALP染色阳性区域大于其余两组;ALP活性显著高于其他各组(P<0.01)。[结论]过表达Foxc2不影响细胞增殖,可持续表达基因产物,并可促进BMSCs向成骨细胞分化。     

环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究北大核心CSCD

目的研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。方法从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0~14 d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF11(Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0~14 d,采用Western blot检测RNF11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组(C1组),14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。结果流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P<0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P<0.05)。随成骨分化时间延长,RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P<0.05)。下调RNF11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P>0.05)。B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P<0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P<0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05)。结论RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。     

新型活性修饰聚乳酸组织工程骨的体外成骨研究

[目的]探讨氨等离子体改性、酰胺键接枝甘氨酸-精氰酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(GRGDS)短肽的活性修饰方法对消旋聚乳酸(PDLLA)组织工程骨体外成骨能力的影响.[方法]制备圆片状直径8 mm、厚1 mm的PDLLA三维多孔支架,分为三组:表面氨基化PDLLA(aminated PDLLA,A/PDLLA,A组),接枝肽A/PDLLA(peptides conjugated A/PDLLA,PA/PDLLA,PA组),以未经处理的PDLLA(P组)作为对照组.实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测符组材料上骨髓间允质干细胞(BMSCs)、骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白-2(Bmp-2)和骨桥蚩白(OPN)mRNA的表达变化并进行ALP活性测定和钙黄绿素矿化荧光染色.[结果]qPCR结果示:第3 d,PA组各基因表达倍数均较P组高;除OCN外的各基因表达也均较A组高.第7 d,A组OCN(13.13±1.28)、Col-Ⅰ(23.71±6.51)和OPN(27.4±7.17)mRNA表达倍数为最高,PA组次之.第14 d,多数基因表达上调,A组和PA组表达倍数较对照组明显增高.PA组OCN(49.21±7.03)、ALP(24.26±3.41)和BMP-2(11.82±2.38)mRNA的表达较A组高,差异有统计学意义(P＜0.05).ALP活性检测结果示:A组和PA组ALP活性持续升高,P组活性第21 d较第14 d时略有下降.第7 d,A组和PA组之间ALP活性比较无统计学意义(P＞0.05),但均高于P组(P＜0.01);第14 d和第21 d,三组间ALP活性两两比较均有统计学意义,ALP活性PA组＞A组＞P组.钙黄绿素矿化荧光染色观察示,骨支架上钙盐沉积与ALP的活性变化趋势相平行.[结论]氨等离子体改性能够促进聚乳酸组织工程骨支架上BMSCs早期向成骨细胞分化,改性后接枝GRGDS肽的新型活性修饰PDLLA具有更好的促BMSCs体外成骨能力.     

三七总皂甙对骨髓基质细胞成骨分化及成骨作用的调节

目的 探讨三七总皂甙对骨髓基质细胞体外成骨分化及成骨作用的影响.方法 分离、纯化大鼠骨髓基质细胞(bone marrow strowal cells,BMSCs),采用常规培养液、成骨诱导液及含100 mg/L PNS的成骨诱导液培养,对各组细胞进行形态学观察,采用MTT法、对硝基苯磷酸盐法、茜素红染色方法及ELISA法观察各组细胞增殖、ALP活性、矿化结节的形成及RANKL的表达.结果 骨诱导组、PNS组较培养液组细胞增殖明显(P<0.05),而PNS组高于骨诱导组(P<0.05);骨诱导组、PNS组ALP活性、钙结节形成高于培养液组 (P<0.01),PNS组高于骨诱导组(P<0.05);骨诱导组、PNS组RANKL表达低于培养液组(P<0.05),PNS组低于骨诱导组(P<0.05).结论 BMSCs成骨诱导过程中,PNS可促进其成骨分化、下调其RANKL表达从而具有抑制破骨细胞生成的潜能.     

绝经后骨质疏松症病人骨髓间充质干细胞STIM1与成骨分化关键因子的表达变化

目的探讨绝经后骨质疏松症病人骨髓间充质干细胞(BMSCs)基质交感分子1(STIM1)与成骨分化关键因子碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OCN)、骨钙素(OPN)的表达变化情况。方法通过临床取材获得并培养绝经后骨质疏松症病人BMSCs,加入成骨诱导液孵育14天,采用RT-PCR检测ALP、OPN、OCN的转录水平及ALP的活性,并检测STIM1的表达情况。采用ALP染色法检测ALP活性;采用Alizarin Red染色法检测钙结节形成数量;采用Fluo荧光法检测钙离子内流变化。结果通过无菌培养,获得高纯度绝经后骨质疏松症(观察组)病人的BMSCs,经成骨诱导14天后,观察组病人BMSCs中成骨分化关键因子ALP、OPN、OCN的转录水平以及ALP的活性均低于对照组(P0.05),同时STIM1 mRNA的表达水平也相应下降,钙离子内流较对照组减少(P0.05)。另外,观察组病人BMSCs钙结节形成数量少于对照组。结论绝经后骨质疏松的发病机制可能与由STIM1参与调控的钙释放激活钙离子通道开放情况密切相关,可作为绝经后骨质疏松病人预防和治疗的潜在靶点。     

载基因仿生基质材料调控骨髓基质干细胞成骨定向分化

目的 探讨载基因仿生基质材料能否调控骨髓基质于细胞（BMSCs）向成骨细胞定向分化。方法 将非病毒载体K16GRGDSPC共价接枝于新型骨基质材料聚丙交酯／乙交酯／天冬氨酸／聚乙二醇（PICA-[ASP-PEG]）构建非病毒基因转染体系。该体系与转化生长因子（TGF）-β1基因复合制备成载基因仿生基质材料pcDNA3-TGF-β1／K16GRGDSPc／PLGA-[ASP-PEG]，并将兔BMSCs与其复合培养，以pcDNA3／K16GRGDSPC／PLGA-[ASP-PEG]作为对照。通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测TGF-β1基因的表达；应用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测BMSCs的ALP活性，并通过RT-FCR检测细胞ALP、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（GPN）和Ⅰ型胶原的表达，通过免疫荧光染色检测核心结合因子a1（Cbfal）表达，观察BMSCs向成骨细胞方向分化的情况。结果 XFS图谱证实K16GRGDSPC被成功地接枝到PLGA-[ASP—PEG]表面。载基因仿生基质材料复合BMSCs培养结果表明，TGF-β1基因被成功地导入细胞内并表达，而且其成骨标志物（ALP、OCN、CPN、Ⅰ型胶原和Cfbal）的表达均显著高于对照组（P〈0．05）。结论 这种载基因基质材料既可以作为骨组织工程支架材料，又可介导外源TGF—β1基因转染BMSCs并定向调控BMSCs成骨分化。     

骨髓基质细胞与可降解明胶-聚羟基丁酸酯膜复合培养的生物合成功能分析

目的:从生物合成功能角度,探讨骨髓基质细胞(BMSCs)与可降解明胶-聚羟基丁酸酯(G-PHB)膜复合培养的生物相容性。方法:以BMSCs分别与G-PHB、聚羟基丁酸酯(PHB)、明胶(G)膜材料复合培养,并设立空白对照组,各组通过3H-TdR法检测DNA合成;考马斯亮蓝法检测蛋白质合成;对硝基苯磷酸盐法(PNP)测定碱性磷酸酶(ALP)水平;放免法测定骨钙素(OCN)表达;流式细胞术测定纤维连接蛋白(FN)表达。结果:G-PHB组DNA合成优于PHB组和空白对照组(P<0.05)。总蛋白合成与各对照组无显著性差异(P>0.05),但成骨特异性标志ALP、OCN以及细胞黏附指标FN均明显优于其他各组(P<0.05)。结论:G-PHB材料对于种子细胞BMSCs黏附、增殖与成骨定向分化有明显的促进作用,是一种有效上调细胞生物合成功能的新型可降解材料。     

纳米羟基磷灰石/甲基丙烯酸2-羟基乙酯人工骨支架的制备及其功能评价

[目的]体外研究评价纳米羟基磷灰石/甲基丙烯酸2-羟基乙酯(nHA/pHEMA)生物支架的生物特性及其对转染骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein 7,BMP-7)的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal-stem cells,BMSCs)成骨分化的影响。[方法]将nHA与pHEMA复合构建nHA/pHEMA复合物支架。将BMP-7体外转染BMSCs并作为种子细胞接种至n HA/p HEMA支架。采用MTT、荧光显微镜及电镜扫描评价nHA/pHEMA支架的生物相容性和细胞毒性。ALP活性和RT-PCR检测分析BMP-7对复合nHA/pHEMA支架BMSCs成骨分化的影响。最后进行无侧限抗压试验评价nHA/pHEMA支架的生物力学特性。[结果]MTT荧光显微镜及电镜检测结果表明接种于nHA/pHEMA支架的BMSCs生长及增殖情况良好。BMP-7转染组与BMSCs组的细胞增殖水平差异无统计学意义(P0.05)。ALP活性检测发现BMP-7-BMSC组的ALP水平在培养第7 d和14 d明显高于BMSCs组(P0.05),RTPCR发现BMP-7-BMSCs组的RUNX2、COLI、OPN和OCN表达水平在培养第7 d和第14 d显著高于BMSCs组(P0.05)。生物力学检测发现nHA/pHEMA支架在高压力负荷及形变条件下未出现脆性骨折。[结论]nHA/pHEMA支架具有良好的生物相容性及生物力学特性,BMP-7能够显著促进复合nHA/pHEMA支架的BMSCs成骨分化,BMP-7-BMSCs与nHA/pHEMA支架复合可以作为理想的骨修复材料促进骨形成。     

Effect of metoclopramide on pain on injection of propofol

We undertook a randomized, double-blind, placebo-controlled study to examine the efficacy of metoclopramide at three different doses (2.5 mg, 5 mg, 10 mg) for reducing pain on injection of propofol in 100 patients scheduled for elective surgery. Patients received intravenously the study drug, with venous occlusion for one minute, followed by propofol 2 mg/kg into a dorsal hand vein. The incidence of pain was significantly less in patients receiving metoclopramide 5 mg (32%) or 10 mg (28%) than in patients receiving placebo (80%) (P<0.01). No difference between metoclopramide 2.5 mg and the placebo groups was found. We conclude that pretreatment of a dorsal hand vein with metoclopramide in a dose of 5 or 10 mg, with venous occlusion for one minute, effectively decreases the incidence of pain caused by propofol injection.     

肾康宁对肾小球肾炎治疗作用的实验及临床研究

目的:观察中药肾康宁对家兔实验性肾炎黏附分子及细胞因子表达的影响,以及临床肾小球肾炎治疗前后尿蛋白的变化.方法:检测牛血清白蛋白所致急性实验性肾炎动物肾组织ICAM-1表达、血清IL-6水平的变化,以及临床肾小球肾炎肾康宁治疗前后血清IL-6水平、尿蛋白的变化.结果:肾康宁能明显降低实验动物血清IL-6含量,降低急性实验性肾炎模型中ICAM-1阳性细胞表达率,同时减轻肾小球基底膜(GBM)增厚及炎症细胞浸润,阻止毛细血管内微血栓的形成;在临床肾小球肾炎中,肾康宁能减少肾小球肾炎患者血清IL-6水平及24 h尿蛋白含量.结论:肾康宁通过降低细胞因子IL-6水平和黏附分子ICAM-1的表达,从而抑制免疫细胞的趋化、浸润、活化和增殖、减少免疫复合物的沉积,使肾小球炎症反应减轻,有效缓解家兔急性实验性和临床肾小球肾炎,使肾功能得以改善.     

离心对脂肪颗粒活性影响的研究

目的:明确离心对脂肪颗粒活性的影响,为脂肪移植术中纯化脂肪颗粒时是否采用离心以及选择最佳离心速率提供参考。方法:将脂肪颗粒经不同高速率(1　000、2　000、3　000、4　000rpm)及不同低速率(600、800、1　000rpm)离心后,即刻进行葡萄糖转移实验——即将每组脂肪颗粒样本分为 12 个标本,每个标本 5ml,置入 10ml 含糖 DMEM 中孵育,1h 后检测其葡萄糖转移量,此值代表各标本的活性,方差分析检验比较各组样本葡萄糖转移量即活性大小。将经不同速率 (600、1　000、2　000、3　000rpm)离心的脂肪颗粒放置 4.5h 后再进行葡萄糖转移实验(方法同上),方差分析检验比较各组脂肪颗粒葡萄糖转移量即活性变化。经静置、3　000rpm 离心的两组脂肪颗粒分别植入 6 只裸鼠背部皮下,每只注射 4 点,每点 0.2ml。15 周后取出移植物,测量残留体积、重量并比较之。每组取两个移植物送病理学检查。结果:脂肪颗粒经不同高、低离心速率处理后的即刻活性随离心速率的增大而显著降低(P<0.05),而经不同高、低离心速率处理再放置 4.5h 后,各离心组样本活性变得差异不显著(P>0.05),但仍较对照组(静置组)明显降低(P<0.05)。静置悬浮和 3　000rpm 离心的两组样本植入裸鼠背部皮下 15 周后,残留体积、重量差异不显著(P>0.05),　组织病理     

丙泊酚制剂引起注射部位疼痛的机制研究进展

背景 丙泊酚是目前临床常用的静脉麻醉药,其具有起效快、作用时间短及安全性高的特点.但是30%～70%患者会出现注射疼痛的副作用,对患者机体和精神造成了严重影响.目的 为减轻丙泊酚临床给药疼痛提供有效的解决策略,为新制剂研发提供思路.内容 对近年来国内外学者关于丙泊酚注射疼痛机理的研究进展进行分析评述,概括导致丙泊酚注射...     

二氢青蒿素对胰腺癌生长的抑制作用

目的 探讨二氢青蒿素在体外、体内对胰腺癌的生长抑制作用.方法 通过MTT法检测二氢青蒿素对胰腺癌细胞株生长的抑制作用,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测BxPC-3细胞中增殖、凋亡相关蛋白的表达.监测给药后胰腺癌裸鼠移植瘤体积的变化,并通过对肿瘤组织标本Ki-67染色和TUNEL染色检测肿瘤细胞增殖和凋亡情况.结果 MTT结果显示,二氢青蒿素可抑制体外培养的胰腺癌细胞BxPC-3和AsPC-1的增殖,诱导细胞凋亡,且呈剂量依赖性.二氢青蒿素亦可通过抑制增殖和诱导凋亡而抑制胰腺癌的体内生长.Western blot检测BxPC-3细胞中蛋白的表达水平,结果显示二氢青蒿素上调增殖相关蛋白p21WAF1、下调PCNA的表达;上调凋亡相关蛋白Bax、下调Bcl-2的表达,且可增加caspase-9的活化水平.结论 二氢青蒿素在体内外对胰腺癌均有抗肿瘤作用,是胰腺癌治疗的潜在药物.     

谷氨酰胺对肠道损伤药理作用研究

肠粘膜上皮细胞、粘膜下免疫细胞和肠腔微生物群之间微妙而复杂的相互作用决定了黏膜的内环境平衡。肠道受到不良刺激情况下可能导致肠损伤,或者肠屏障的破坏,如腹部肿瘤的化疗和放疗、炎性肠病以及肠应激状态下反应,后者如创伤、休克、炎症。受损的上皮屏障和伴随的对肠道微生物群的过度免疫反应导致腹痛、腹泻和炎性肠病,同时肠屏障破坏所致的肠通透性增加可能是引发肠外组织与脏器损伤的因素。谷氨酰胺在营养中是一种真正的具有功能性的氨基酸。膳食或补充的谷氨酰胺通过调节参与细胞增殖、分化和凋亡、蛋白质周转、抗氧化性和免疫反应的基因和蛋白表达,对维持肠黏膜屏障具有重要作用。但谷氨酰胺作用的潜在机制在很大程度上仍然是未知的,因此,谷氨酰胺的重要作用不断激励研究人员在实验动物、基础和临床研究。本文回顾了肠屏障受损的机制及谷氨酰胺对肠道损伤药理作用,对于更好地理解谷氨酰胺的作用以及改善生物体内谷氨酰胺的营养利用是必要的。