电穿孔技术的研究及应用进展

脉冲电场的电穿孔效应在医学上的应用是一门多学科的生物医学工程学技术，已证实其主要的生物学效应是使靶细胞膜发生可逆及不可逆性电击穿。近年电穿孔效应所介导的电化学治疗应用广泛。对电脉冲的量—效关系、电场分布、膜穿标记物及生物电阻成像等基础研究及临床应用中的进展及尚存问题作一综述。     

脉冲电场诱致皮肢电穿孔的荧光显微观察

从组织形态学角度观察脉冲电场和直流电场作用后皮肤结构的变化,以阐明这两种技术的差别。将人皮和蛇皮置于Valia-Chien双室扩散池,用电穿孔脉冲电场（脉幅380V,脉率4ppm,脉宽5.5ms,脉冲数100个,电容量22μF）和离子导入直流电流（0.5mA/cm^2）作用于这些皮肤,用荧光显微镜观察被动扩散（对照）、离子导入和电穿孔三组皮肤的结构变化,荧光素为FITC。结果表明,对于人皮被动扩散见有少量15－30μm边缘粗糙的高亮荧光斑点;离子导入见高亮荧光斑点边缘变得光滑,疋度不变;电穿孔的高亮荧光斑点扩大至80－90μm,边缘光滑,对于蛇皮被动扩散和离子导入都未观察到高亮荧光斑点,但在电穿孔观察到25－30μm的高亮荧光班点,提示脉冲电场可以诱致皮肤电穿孔,产生药物经皮渗透的新途径。     

电穿孔过程中细胞膜电导率变化条件下的跨膜电压研究

基于经典球形单细胞五层介电模型,并考虑电穿孔过程中细胞膜电导率的变化,对微秒脉冲电场作用下的细胞内外膜跨膜电压进行了仿真分析,以及脉冲电场诱导人宫颈癌细胞系Hela凋亡的实验研究。仿真分析发现,随着细胞穿孔程度的加剧,细胞膜电导率增加,内、外膜跨膜电压的比值不断增加,表明外加脉冲电场对内膜的影响不断增强,其作用靶点逐渐透过细胞膜进入胞内细胞器。同时,实验结果也表明随着脉冲电场场强不断增加,微秒脉冲电场所诱导的Hela细胞的凋亡率随之增加,从而间接证实了仿真分析的结果。现有研究普遍认为微秒脉冲电场的作用靶点为细胞外膜,本研究关于微秒脉冲电场对细胞内膜作用的研究结果是对已有研究的重要补充和发展。     

用于电穿孔效应实验的亚微秒脉冲电源

针对肿瘤细胞电穿孔效应的实验需求,用幅值可调的高压直流电源为电容充电,具有一定时间延时的两路TTL信号分别控制串联的两个IGBT模块的通与断状态,以便从电容放电曲线中截取适当脉宽电脉冲的方法,研制了一台输出脉冲电压0.5～3.5kV连续可调,脉宽300～800ns准连续可调,重频1～400Hz连续可调的亚微秒脉冲电源。实验测试结果表明,这种脉冲电源性能稳定可靠,可用于恶性肿瘤电穿孔实验。     

经皮给药电穿孔技术的研究

本项目研制了方波和指数两种类型的电穿孔仪。分别研究了盐酸丁卡因、萘普生和甲硝唑三种药物离体人皮和大鼠腹皮对电穿孔、被动扩散和离子导入的促渗对比实验。结果表明：电穿孔比被动扩散和离子导入有更高的药物经皮促渗作用;药物经皮渗透速率与脉冲数不成正比关系;指数波优于方波;共溶剂没有明显增加电穿孔促渗作用;促渗剂与电穿孔合用可以较大提高电穿孔单用促渗作用;经皮能量是控制药物经皮促渗的重要因素;电穿孔与离子导     

脉冲电场消融在房颤治疗中的应用进展

房颤是临床中最常见的心律失常之一，对左心房行肺静脉隔离是治疗房颤的有效手段。脉冲电场消融(PFA)是一种采用高电压短持续时间的脉冲电场，以不可逆电穿孔机制对组织造成损伤的新消融技术。针对PFA在房颤治疗领域的应用，首先介绍了PFA的原理，然后根据临床实验的结果，阐述了PFA的优势，如：非热效应；在实现心肌组织有效损伤的同时，降低对心肌邻近组织(如肺静脉、食道、膈神经、血管等)的损伤风险；消融速度快；低接触依赖性等。介绍目前主流的PFA系统及临床应用，以及这些系统对应的消融导管的特点。最后，针对目前PFA应用于房颤治疗尚待解决的问题提出建议，并展望该领域的未来发展方向。     

电穿孔疗法在头颈癌治疗中的应用

头颈癌严重地威胁着人类生命 ,而传统的化学治疗方法由于受癌细胞对药物吸收率的限制 ,其疗效也受到限制。电穿孔由于能使细胞膜出现暂时微孔 ,从而能大大提高癌细胞对药物的吸收率。在此基础上 ,结合传统的化疗方法形成的电穿孔疗法成为一种新型的头颈癌治疗法。博来梅素由于其自身的优良特性成为电穿孔疗法的首先药物。离体实验和临床研究表明 ,与传统方法相比 ,电穿孔疗法对于治疗头颈癌能取得更好的疗效     

经皮给药电穿孔技术的新进展

经皮给药是药物三大给药方式之一，经皮给药的电穿孔技术是一种新的经皮给药技术。这种技术可以增强大分子药物的经皮渗透速率，具有许多潜在的优点，近年来倍受人们的重视。皮肤角质层是阻止的经皮渗透的主要屏障，在皮肤上施加高压脉冲，使角质层结构瞬间紊乱产生可的亲水性“电孔道”，以增加药物的经皮渗透速率。     

高功率脉冲微波和电磁脉冲辐照对心肌细胞膜电穿孔效应及机理的研究

电磁辐射可造成人体多器官系统的损伤。对其损伤的病理机制至今尚未完全阐明。心脏是电磁辐射损伤的敏感器官之一。本实验拟通过研究HPPM和EMP对心肌细胞的影响,探讨电磁辐射致伤的关键机制,解释脉冲电磁场致心肌细胞损伤的发展规律。本实验采用HPPM和EMP辐照原代培养心肌细胞的方法,用原子力显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、流式细胞仪和全自动生化检测仪等多种实验手段,检测辐照对细胞膜形态、结构和功能的影响。结果发现HPPM和EMP辐照后,心肌细胞搏动减慢,形态异常,活力下降,凋亡和坏死率明显增加。细胞膜出现数量不等、大小不一的电穿孔,细胞膜通透性丧失,结构破坏,细胞培养液中Na 、K 、Ca2 、Cl-、Mg2 、Ca2 和无机磷离子浓度显著升高(P<0.01),细胞内Ca2 浓度显著降低(P<0.01)。结果提示心肌细胞是电磁辐射损伤的敏感细胞,脉冲电磁场可致心肌细胞膜电穿孔,细胞形态、结构和功能均受到严重损伤。电穿孔效应是解释电磁辐射非热效应的关键机制之一。电穿孔导致的细胞膜通透性和膜结构改变存在一定发展规律。     

低强度瞬态电磁脉冲对细胞膜的电穿孔效应及机理研究

采用低强度的瞬态电磁脉冲在超宽频带横电磁波传输室（ＢＴＥＭ Ｃｅｌｌ）中对生物样品进行辐射,结果表明,在弱电场的情况下,细胞膜也会发生电穿孔,初步分析了形成电穿孔的机理。     

电穿孔增强核酸疫苗免疫反应的研究进展

核酸疫苗自诞生以来在肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病等方面显示出其独特的优越性。目前,研究如何增强核酸疫苗的免疫原性是一大热点,在众多方法中,电穿孔通过增加细胞对DNA的摄取,使表达的目的抗原增多,从而明显地增强了核酸疫苗诱导的免疫反应。就电穿孔技术在核酸疫苗研究领域的应用作一综述。     

Electrophoresis-assisted single-cell electroporation for efficient intracellular delivery

Single-cell electroporation, in which a focused electric field is applied to permeabilize an individual target cell using relatively low applied voltages, has demonstrated improved cell viability and transfection rates over conventional bulk electroporation set-ups. Here, we introduce a new strategy, in conjunction with single-cell electroporation, to enhance exogenous transport efficiency: electrophoresis delivery of compounds subsequent to electroporation. Electrophoresis is used to assist loading of otherwise impermeable exogenous anionic fluorescent molecules Calcein (Invitrogen, MW = 622) and Oregon Green Dextran (OGD, Invitrogen, MW = 70,000). For the larger dextran molecules, we demonstrate a protocol of first pre-concentrating at the cell-microfluidic channel interface. Then, the electric field is used to drive these molecules into the cell post-electroporation using 50–200 mV. We demonstrate delivery rate enhancements of more than an order of magnitude using electrophoresis compared to diffusion alone subsequent to electroporation.     

Focal electroporation in ovo

Gene expression fields in embryogenesis are spatially precise and often small, so experimental gene expression often requires similar spatial definition. For in ovo electroporation, typically a gene construct is injected into a natural body cavity in the embryo prior to electroporation. Limited control of the size and location of the electroporated field can be obtained by varying electrode placement and geometry, and by altering the miscibility and viscosity of the construct vehicle but it is difficult to tightly constrain electroporation to small regions. Electroporation of different constructs in close proximity has not been possible. We show that loading the construct into an agarose bead, which is then microsurgically implanted, allows for focal electroporation. Different constructs can be electroporated in close proximity by emplacing several agarose beads. This technique is simple, cheap, rapid, and requires no more specialised equipment than that required for conventional in ovo electroporation. Developmental Dynamics 238:3152–3155, 2009. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.     

小鼠子宫内胚胎电转技术方法的改良

目的 优化小鼠子宫内胚胎电转技术,用于检测胎鼠大脑新生神经元的迁移和分化特征。 方法 通过选择异氟烷气体麻醉方式,改进毛细玻璃针的制备方法,减少手术中胚胎的暴露时间,优化电转参数等,对小鼠子宫内胚胎电转技术进行一系列优化。采用优化的子宫内胚胎电转技术给6只怀孕16.5 d的孕鼠进行了手术,共电转胚胎42只。 结果 电转后孕鼠和胚胎的存活率达到100%,其中大脑表达外源基因的胎鼠占85%±3%。 结论 优化的小鼠子宫内胚胎电转技术可以获得令人满意的胎鼠存活率和基因电转效率。     

The effect of electroporation pulses on functioning of the heart

Electrochemotherapy is an effective antitumor treatment currently applied to cutaneous and subcutaneous tumors. Electrochemotherapy of tumors located close to the heart could lead to adverse effects, especially if electroporation pulses were delivered within the vulnerable period of the heart or if they coincided with arrhythmias of some types. We examined the influence of electroporation pulses on functioning of the heart of human patients by analyzing the electrocardiogram. We found no pathological morphological changes in the electrocardiogram; however, we demonstrated a transient RR interval decrease after application of electroporation pulses. Although no adverse effects due to electroporation have been reported so far, the probability for complications could increase in treatment of internal tumors, in tumor ablation by irreversible electroporation, and when using pulses of longer durations. We evaluated the performance of our algorithm for synchronization of electroporation pulse delivery with electrocardiogram. The application of this algorithm in clinical electroporation would increase the level of safety for the patient and suitability of electroporation for use in anatomical locations presently not accessible to existing electroporation devices and electrodes.     

体内电穿孔对报告基因表达和HIV GagDNA疫苗诱导的免疫反应的影响

目的 研究体内电穿孔递送途径在小鼠模型中对于报告基因表达水平及HIV Gag DNA疫苗所诱导的免疫反应的影响。方法 构建荧光素酶（1uciferase）表达质粒p1．0-1ue，将其通过直接肌肉注射、肌注后以双针电极进行电穿孔、肌注后以钳式电极进行电穿孔等3种不同方法注射小鼠，72h后取注射部位的肌肉测定luciferase的表达情况。同时构建携带密码子优化的HIV-1 B′／C重组亚型CN54株gag基因的DNA疫苗质粒p1．0-gag，在10μg、100μg两个剂量水平上通过以上3种不同的方法免疫BALB／c雌性小鼠，ELISA方法检测Gag特异的抗体反应，ELISPOF方法和细胞内因子染色（intracellular cytokine staining，ICS）技术检测细胞免疫应答。结果 通过体内电穿孔可以使luciferase在小鼠肌肉中的表达水平显著提高，最大提高幅度达到66倍。Gag DNA疫苗免疫结果显示，电穿孔可以显著提高Gag特异的体液免疫应答，其中使用双针电极的效果要显著好于钳式电极，前者所诱导的抗体滴度比不使用电穿孔组提高可达28倍。但体内电穿孔对于Gag特异的细胞免疫应答并没有显著影响。结论 体内电穿孔（尤其是使用双针电极）可以大幅度提高报告基因在体内的表达水平和DNA疫苗诱导的抗原特异性体液免疫应答。     

温度开环和闭环反馈在高压脉冲电场消融中的对照研究

目的:对比温度开环和闭环反馈在高压脉冲电场消融中的区别。方法:温度开环组应用高压方波脉冲发生器以场强1.5 kV/cm、频率1 Hz、脉宽100 μs、脉冲数20个的条件对细胞悬液、3D细胞模型和离体猪肝组织3种不同负载施加高压脉冲电场。闭环组在相同脉冲条件下增加温度闭环算法对微控制器及温度传感器编程控制脉冲发放。分别从电场消融后的电极温度、细胞悬液电导率和细胞死亡率,3D细胞模型消融截面积以及猪肝组织消融区病理特点进行定量比较和定性分析。结果:消融后开环组电极温度、细胞悬液电导率、细胞死亡率和3D细胞模型消融截面积分别为（53.2±5.5）℃、（1.43±0.03） S/m、（86.8±5.5）%和（0.46±0.15） cm2,均高于闭环组对应的（38.5±1.6） ℃、（1.21±0.02） S/m、（73.6±10.2）%和（0.37±0.08） cm2,差异均有统计学意义（P<0.05）;开环组消融区猪肝组织H-E染色可见热损伤导致的凝固性坏死区,闭环组表现为肝血窦增宽、细胞质脱水丢失和核聚集。结论:该实验条件下,温度开环和闭环反馈高压脉冲电场消融存在差异。传统温度开环高压脉冲电场消融效果略强于温度闭环,这可能与电导率增加和热效应介导的电场杀伤效应增强有关。温度闭环反馈能避免热损伤效应,实现真正意义上的非热性消融。     

骨不连治疗的研究与技术应用进展

背景：骨不连是骨折晚期常见的临床问题,数十年来,在各种新式内外固定材料、普及的显微外科技术、创新的植骨材料,尤其是分子生物学技术的全面帮助下,骨不连的治疗取得了突破性进展。 目的：总结骨不连治疗的研究进展,为以后更好地治疗骨不连提供技术理论和方法选择。 方法：由第一作者运用计算机检索系统检索1990年1月至2013年5月发表的有关骨不连原因及治疗方法的文献,以“fracture nonunion,treatment,progress”或“骨不连,治疗方法,进展”为检索词。同一领域则选择近期发表或者发表在权威杂志的文章。 结果与结论：排除重复性研究及时间跨度大的文献,从检索结果中共选择了48篇文章进一步分析。骨不连治疗手段主要有两种：非手术方式和手术方式,目前临床上以手术方式为主且高效。骨折愈合是多环节参与的复杂过程,一旦骨不连发生,应具体问题具体分析,根据患者的实际情况采取个体化治疗原则,重视软组织的保护,必要时联合运用多种手术及非手术方法,才能取得满意的疗效。