小鼠髓源性内皮祖细胞体外培养的两种不同分离方法的比较

目的比较密度梯度离心和红细胞裂解法分离体外培养小鼠髓源性内皮祖细胞(BM-EPCs)的优缺点。方法选用4周龄的C57BL/6小鼠,密度梯度离心和红细胞裂解法分离小鼠骨髓细胞,进行细胞计数、检测细胞活率,差速贴壁纯化BM-EPCs,定期镜下观察细胞的形态。培养7 d后,流式细胞仪检测细胞表面CD_(34)、血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)、CD_(31)的表达;1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青标记的乙酰化低密度脂蛋白(Di L-ac LDL)摄取和异硫氰酸荧光素标记荆豆凝集素1(FITC-UEA-1)结合能力经双染后激光共聚焦显微镜拍照进行检测;培养14 d进行免疫荧光检测CD_(31)的表达。结果密度梯度离心和红细胞裂解法提取两种方法均能分离BM-EPCs进行体外培养,与密度梯度离心方法比较,红细胞裂解法操作更为简便,获得的细胞数量较多[(1.90±0.55)×10~7比(0.72±0.42)×10~7](P<0.05),细胞存活率较高[(95.25±1.03)%比(83.75±1.93)%](P<0.01),细胞表面CD_(34)、VEGFR-2表达、Dil-acLDL和FITC-UEA-1双染阳性的细胞比例低于密度梯度离心分离法[(30.03±2.40)%比(46.93±2.89)%,(28.70±6.51)%比(43.97±1.39)%,(78.30±4.27)%比(89.20±2.65)%],培养14 d后的CD_(31)阳性细胞比例低于密度梯度离心分离法[(84.10±3.86)%比(93.57±4.27)](P<0.05)。结论两种分离方法均能分离BM-EPCs进行体外培养,提取方法各有利弊,可结合研究方案进行选择。     

IL-6抑制LPS诱导的小鼠髓源性DCs成熟的实验研究

目的观察白细胞介素-6(IL-6)对于内毒素(LPS)诱导的小鼠髓源性树突状细胞(DC)成熟效应的抑制作用。方法分离小鼠骨髓细胞,采用黏附法结合GM-CSF和IL-4刺激法在体外培养髓源性DCs(BMDCs)。用相差倒置显微镜观察BM-DCs的形态特点。用LPS诱导DC成熟。采用FACS结合混合淋巴细胞反应,观察IL-6处理与否,LPS诱导的BMDCs在表型和刺激同种淋巴细胞增殖功能上的变化。结果形态观察和FACS分析的结果表明:体外成功培养了纯度较高的高表达CD11c的BMDCs,LPS能明显诱导BMDCs表面MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD40的表达上调;而经过IL-6处理后,LPS诱导BMDCs表面CD80、CD86、CD40表达上调的能力被显著削弱(P0.05)。混合淋巴细胞反应显示,与单独用LPS处理的BMDCs相比,经IL-6处理后的BMDCs刺激同种淋巴细胞增殖的能力明显减弱,并呈剂量依赖关系(P0.05)。结论IL-6能明显抑制LPS诱导的BMDCs成熟,可能是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一。     

小鼠肺部肿瘤集聚髓源性抑制细胞实验研究

目的 观察髓源性抑制细胞(MDSCs)在荷瘤小鼠肺部组织的表达情况.方法 取12只C57BL/6小鼠随机分为实验组和对照组,每组6只.实验组:将体外培养的3LL细胞(0.3×106个)注射入小鼠尾静脉,成瘤后3周取小鼠肺组织,酶消化肺组织,制备肺组织单细胞悬液,采用流式细胞术检测MDSCs(GR1-FITC、CD11b-PE双染阳性)的表达量.对照组:在小鼠尾静脉注射PBS,其余步骤同实验组.结果 实验组小鼠肺部组织高表达免疫抑制细胞MDSCs(GR+CD11b+双阳性),表达量为(19.92±6.08)%;对照组MDSCs表达量为(7.06±2.67)%,两组比较差异有统计学意义(P<0.001).结论 肺癌小鼠的肺组织高表达免疫抑制细胞MDSCs.     

小鼠肺部肿瘤集聚髓源性抑制细胞实验研究

目的观察髓源性抑制细胞（MDSCs）在荷瘤小鼠肺部组织的表达情况。方法取12只C57BL/6小鼠随机分为实验组和对照组,每组6只。实验组：将体外培养的3LL细胞（0.3×106个）注射入小鼠尾静脉,成瘤后3周取小鼠肺组织,酶消化肺组织,制备肺组织单细胞悬液,采用流式细胞术检测MDSCs（GR1-FITC、CD11b-PE双染阳性）的表达量。对照组：在小鼠尾静脉注射PBS,其余步骤同实验组。结果实验组小鼠肺部组织高表达免疫抑制细胞MDSCs（GR＋CD11b＋双阳性）,表达量为（19.92±6.08）%;对照组MDSCs表达量为（7.06±2.67）%,两组比较差异有统计学意义（P〈0.001）。结论肺癌小鼠的肺组织高表达免疫抑制细胞MDSCs。     

中医药调控髓源性抑制细胞的研究进展

髓源性抑制细胞(MDSC)是骨髓和脾脏中的骨髓生成途径产生的一组具有高度免疫抑制活性的不成熟异质性骨髓细胞,与机体自身免疫性疾病、细菌感染、病毒感染等疾病密切相关。MDSC的主要功能为通过抑制T细胞活化、促进Treg的增殖以及与巨噬细胞相互作用而减弱或抑制机体的免疫反应。中医认为阴阳失调是导致疾病的主要原因,因而中医药治疗疾病是以借助中药的偏性帮助机体维持阴阳平衡为目的和手段。免疫系统及其功能的阴阳平衡与免疫功能及其病理变化密切相关。近年来,研究发现多种中药及其活性成分能够调控MDSC的表达参与机体免疫调控来治疗肿瘤等多种疾病。本文就近年来中医药调控MDSC的相关研究进展做一综述。     

小鼠骨髓源性树突状细胞和DC2.4中RelB基因表达水平的比较研究

目的比较研究体外分离培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞(bonemarrow-deriveddendriticcells,BM-DC)和DC2.4中核转录因子RelB基因的表达水平。方法无菌从C57BL/6小鼠股骨和胫骨中取出骨髓细胞,利用rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导体系扩增骨髓前体细胞的方法产生未成熟的BM-DC,未成熟的BM-DC在培养结束前18h经LPS刺激获得成熟的BM-DC;DC2.4细胞系用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液于37℃,5%CO2条件孵箱中培养。用流式细胞术分析它们的表型,用RT-PCR和免疫荧光染色法检测成熟的BM-DC、未成熟的BM-DC和DC2.4,RelBmRNA和其蛋白的表达。结果流式细胞术分析显示MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD40在未成熟的BM-DC和DC2.4中均呈低水平表达,在成熟的BM-DC中则呈高水平表达;共刺激分子CD86在成熟的BM-DC和DC2.4中均呈高水平表达,而在未成熟的BM-DC中呈低水平表达。RT-PCR和免疫荧光染色法检测结果均显示,RelB基因在未成熟的BM-DC和DC2.4中均呈低水平表达;而在成熟的BM-DC中呈高水平表达,成熟的BM-DC与未成熟BM-DC及DC2.4均存在显著差异(P<0.01)。结论RelB基因的表达与小鼠BM-DC的成熟状态密切相关。RelB基因在DC2.4中呈低水平表达,提示DC2.4是一种不成熟的DC细胞系。DC2.4具有的未成熟DC的特点可能与RelB基因的低水平表达有一定关系。抑制骨髓DC中RelB基因的表达,有可能诱导产生具有耐受原性的未成熟的DC。     

IL-6通过SOCS3诱导小鼠髓源性DCs分化成熟障碍的分子机制研究

目的 观察IL-6诱导小鼠髓源性DCs分化成熟障碍过程中SOCS3的表达变化并探讨其分子机制.方法分离小鼠骨髓细胞,采用黏附法结合GM -CSF和IL-4刺激法在体外培养髓源性DCs (BMDCs).用LPS诱导iDCs成熟,采用Real-Time RT-PCR和Western blot方法,观察IL-6处理前后LPS诱导的BMDCs中SOCS3表达的变化,并用甲基化特异性PCR观察SOCS3启动子CpG岛的甲基化状态.结果 Real-Time RT-PCR和Western blot结果显示,LPS能显著诱导BMDCs SOCS3 mRNA和蛋白的表达上调;而经过IL-6处理后,LPS诱导BMDCs SOCS3 mRNA和蛋白表达上调的能力被显著抑制(P＜0.05).甲基化特异性PCR与单独用LPS处理的BMDCs相比,经IL-6处理后的BMDCs SOCS13启动子区CpG岛被甲基化.结论 IL-6通过诱导SOCS3基因启动子区CpG岛的甲基化来抑制SOCS3表达,进而阻遏iDCs分化成熟,促进胃癌等肿瘤细胞侵袭转移.     

树突状细胞免疫治疗慢性髓性白血病研究进展

树突状细胞是体内抗原提呈功能最强的细胞，在肿瘤的免疫治疗中占有重要的地位，是当今肿瘤学领域研究的热点。慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia．CML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。迄今为止治愈的措施仍然有限。近10年来，人们发现CML患者体内存在识别自身肿瘤的T淋巴细胞，但是由于抗原提呈细胞的数量及功能异常等原因，造成了肿瘤特异性T细胞无应答。     

小鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养体系的构建

建立一种体外诱导培养小鼠骨髓源性的树突状细胞(DCs)方法,在镜下可观察到培养出的未成熟树突状细胞(imDCs)比成熟树突状细胞(mDCs)细胞突起少。流式细胞术检测 CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子在 imDCs 的表达显著低于在 mDCs 上的表达。同种异基因混合淋巴细胞反应显示DCs 刺激 T 细胞增殖的能力随着 DCs 所占比例的增大而增强,在相同比例条件下对刺激 T 细胞增殖的能力,imDCs 显著低于成熟 mDCs。该诱导方法可获得大量符合科研要求的小鼠骨髓源性 DCs。     

髓源性抑制细胞在乳腺癌转移中的研究进展

乳腺癌患者好发骨、肝和肺转移,预后往往较差。根据Paget提出的“种子与土壤”学说,不同的组织微环境对癌细胞存在不同的吸引。研究表明,髓源性抑制细胞(MDSCs)可提前在乳腺癌转移部位募集,并在乳腺癌细胞多个转移环节中发挥重要作用,其在乳腺癌原发灶之外促进癌细胞转移的作用日益受到重视。本文总结了MDSCs的生物学特性、参与乳腺癌转移的多个环节,包括在外周循环、转移前微环境和转移灶中的促转移机制,以及靶向MDSCs治疗乳腺癌转移的研究进展。     

哮喘小鼠脾细胞中粒细胞型髓源性抑制细胞和Th17细胞水平的变化

目的: 探索髓源性抑制细胞（myeloid derived suppressor cells,MDSCs）、Th17及调节性T细胞（Treg）在实验性哮喘小鼠脾脏中的水平。方法: 将6～8周BALB/c雄性小鼠随机分为PBS组和模型组;用卵清蛋白建立哮喘小鼠模型,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清中卵清蛋白特异性的IgE;采用HE染色和PAS染色观察小鼠肺组织的病理变化;用流式细胞术检测脾细胞中Th17、Treg、MDSCs的比例;采用免疫组化观察小鼠肺组织骨髓分化抗原（Gr 1）、白介素17（IL 17）、叉头样转录因子3（Foxp3）的表达水平。结果： 与PBS组相比,模型组小鼠气道炎性细胞增多,黏液分泌增加,血清IgE水平明显增高,脾细胞中Th17细胞的比例增加、Treg细胞比例减少;MDSCs中的粒细胞型亚群（G-MDSCs）的比例增加;同时肺组织中IL-17、Gr-1高表达,Foxp3低表达。结论： G MDSCs、Th17细胞比例增加,Treg细胞比例减少可能参与小鼠哮喘的发病。     

肾细胞癌源性exosomes体外诱导单核细胞分化为PD-L1髓源性抑制细胞

目的研究肾细胞癌源性exosomes诱导人外周血单核细胞分化为髓源性抑制细胞及该细胞PD-L1分子表达情况的效应。方法超滤和蔗糖重水密度梯度离心相结合的方法分离纯化肾细胞癌源性exosomes。Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,贴壁法获取外周血单核细胞。倒置显微镜观察获得的单核细胞形态。流式细胞仪检测单核细胞比例及活性、经exosomes诱导的单核细胞活性情况、髓源性抑制细胞(MDSCs)及其上PD-L1分子的表达情况。结果贴壁的单核细胞形状为圆形或类圆形具少许短小伪足状突起;贴壁法获得的单核细胞比例达83.5%,活细胞比例约90.0%;髓源性抑制细胞的生成较对照组明显增加[(8.91±0.21)%vs(3.19±0.91)%,P<0.05],且该髓源性抑制细胞表达PD-L1较对照组明显增高[(88.93±8.57)%vs(44.53±5.35)%,P<0.05];体外经exosomes诱导刺激的单核细胞损伤率较对照组明显升高[(39.93±16.51)%vs(12.87±2.43)%,P<0.05]。结论肾细胞癌源性exosomes在体外能够促进单核细胞损伤,诱导单核细胞分化为髓源性抑制细胞,且该髓源性抑制细胞表达PD-L1增高,可能是其抑制T细胞免疫功能的负性调节机制之一。     

脓毒症小鼠髓源性抑制细胞氨基酸代谢特点

目的: 探讨脓毒症小鼠髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)氨基酸代谢组学特点。方法: 采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture, CLP)制备脓毒症小鼠模型,将小鼠随机分为假手术组(sham组, n = 10)和CLP组(n = 10)。术后第7天在各组存活小鼠中随机选取5只,分离小鼠骨髓MDSCs,采用安捷伦Seahorse XF技术测量MDSCs细胞的氧气消耗速率(oxygen consumption rate, OCR),采用超高效液相色谱-串联质谱联用技术靶向检测细胞内氨基酸及寡肽含量。通过单维和多维检验分析差异代谢物和潜在生物标志物,并对潜在生物标志物进行通路富集分析。结果: CLP组小鼠骨髓中MDSCs比例(75.53% ± 6.02%)显著大于sham组的MDSCs比例(43.15% ± 7.42%, t = 7.582, P < 0.001),且CLP组小鼠骨髓中MDSCs的基础呼吸速率[(50.03±1.20) pmol/min]、最大呼吸速率[(78.07±2.57) pmol/min]和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)产生[(25.30±1.21) pmol/min]均显著大于sham组的基础呼吸速率[(34.53±0.96) pmol/min, (t = 17.41, P < 0.001)]、最大呼吸速率[(42.57±1.87) pmol/min, (t = 19.33, P < 0.001)]和ATP产生[(12.63±0.96) pmol/min, (t = 14.18, P < 0.001)]。亮氨酸、苏氨酸、甘氨酸等17种氨基酸含量显著增加(均P < 0.05),是脓毒症MDSCs的潜在生物标志物。增加的氨基酸主要富集在苹果酸-天冬氨酸穿梭、氨回收、丙氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、苯丙氨酸和酪氨酸代谢、尿素循环、甘氨酸和丝氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等代谢途径。结论: CLP组小鼠MDSCs中线粒体氧化磷酸化增强,苹果酸-天冬氨酸穿梭和丙氨酸代谢增强,可能为线粒体有氧呼吸提供大量原料,从而促进MDSCs发挥免疫抑制功能,阻断上述代谢途径或将有助于调节MDSCs功能,为改善脓毒症预后提供新思路。     

不同成熟状态小鼠树突状细胞的体外诱导

目的：体外诱导小鼠骨髓来源的不同成熟状态树突状细胞(dendritic cells，DCs)。方法：rmGM—CSF体外培养小鼠骨髓细胞，5～6d后，利用磁性细胞分离器(MACS)分离CD11C^ 细胞，部分细胞加入rmTNFα继续培养1～2d，通过流式细胞仪检测分别检测细胞表面标志，同种混合淋巴细胞反应检测细胞的体外刺激能力。结果：小鼠骨髓细胞经rmGM-CSF培养5～6d，再经过MACS分离可获得大量未成熟DCs，细胞表面出现少量短而粗的突起，低水平表达MHCI／分子和共刺激分子CD80、CD86及CI40，刺激同种CD4^ T细胞的混合淋巴细胞反应能力较弱：加入rmTNFα继续培养可获得成熟DCs，细胞表面出现大量细长突起，细胞表面高水平表达MHC Ⅱ分子和共刺激分子CD80、CD86及CI40，刺激同种CI4^ T细胞的混合淋巴细胞反应能力较强。结论：通过rmGM-CSF或rmGM-CSF rmTNFα体外培养体系可以获得大量未成熟DCs或成熟DCs，为进一步研究DCs的生物学功能提供实验基础。     

小剂量地塞米松对脓毒症小鼠CD11 b+ Gr-1+髓源抑制性细胞的影响

目的：：观察小剂量地塞米松对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症小鼠CD11b+Gr-1+髓源抑制性细胞(MDSCs)的影响。方法：将145只BALB/c雄性小鼠随机分成正常对照组(NC组)35只,脓毒症组(SE组)和小剂量地塞米松干预组(SD组)各55只;SE组和SD组腹腔注射LPS 10 mg/kg制备脓毒症小鼠模型,NC组腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液。 SD组于注射LPS 2 h后经尾静脉注入地塞米松0.3 mg/kg,SE组和NC组经尾静脉注入等量0.9%氯化钠注射液。注射LPS后时刻记为0 h,于6、12、24 h检测血清干扰素-γ及白细胞介素-10水平,于12、24、48、72 h检测小鼠脾脏及骨髓中CD11b+Gr-1+ MDSCs的百分比。结果：与NC组比较,SD组及SE组在实验6 h干扰素-γ和12 h白细胞介素-10水平均增加(P<0.05~P<0.01);SD组与SE组差异亦有统计学意义(P<0.05)。与NC组比较,SE组脾脏MDSCs百分比在12~72 h均明显升高(P<0.01),SD组在12~48 h亦均升高(P<0.01);而SE组和SD组在24~72 h差异亦均有统计学意义(P<0.01)。与NC组比较,SE组和SD组骨髓MDSCs百分比在48 h和72 h均升高(P<0.05~P<0.01);而SE组和SD组在48 h和72 h差异亦均有统计学意义(P<0.05和P<0.01)。结论：小剂量地塞米松可抑制LPS诱导的脓毒症小鼠MDSCs的产生及聚集。     

树突状细胞与髓性白血病的免疫治疗

化疗方法的改进和造血干细胞移植在临床的应用使髓性白血病病人5年生存率明显提高。而治疗失败的主要原因是疾病的复发，根源是白血病微小残留病灶的存在。采用特异性免疫治疗清除白血病微小残留病灶已日益引起人们的重视。树突状细胞(DCs)是免疫系统功能最强的专职抗原提呈细胞(APCs)，惟一能够致敏初始型T细胞，在体内     

髓源性抑制细胞在肿瘤免疫中的作用

髓源性抑制细胞(MDSCs)是来源于骨髓的具有免疫抑制作用的细胞,可以抑制T细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞等细胞介导的免疫应答,促进调节性T细胞和肿瘤相关巨噬细胞的生成,促进肿瘤细胞发生免疫逃逸,进而导致肿瘤细胞的生长增殖,促进肿瘤的发生发展.本文主要从MDSCs与免疫细胞的相互作用以及MDSCs靶向治疗方面进行阐述.     

宫颈癌患者外周血髓源性抑制细胞的比例及其临床意义

目的：比较分析髓源性抑制细胞（myeloid‐derived suppressor cells ,MDSCs）在健康人、宫颈上皮内瘤变患者、宫颈癌患者及其术后外周血中的比例,初步探讨其临床意义。方法采用流式细胞术检测36例宫颈癌患者、52例宫颈上皮内瘤变患者及20例健康志愿者外周血中MDSCs、调节性T细胞（Treg）的比例。检测20例宫颈癌患者术前术后外周血中MDSCs、Treg的比例及MDSCs产生的精氨酸酶和一氧化氮（NO）的变化情况。结果宫颈癌组外周血中MD‐SCs、Treg的比例最高,分别为[（3.85±0.85）％,（7.82±1.04）％],其次是宫颈上皮内瘤变组[（1.52±0.53）％,（3.32±0.48）％],健康对照组最低[（0.61±0.17）％,（2.02±0.26）％],各组间差异均有统计学意义（均 P＜0.05）;手术后,患者外周血中MDSCs、Treg的比例明显下降,MDSCs产生的精氨酸酶和NO下降,与术前比较差异均有统计学意义（均 P＜0.05）。结论外周血MDSCs比例的升高可能与肿瘤免疫功能低下及宫颈癌的发生发展密切相关。     

髓源性抑制细胞在胃癌患者外周血中的变化及临床意义

目的: 观察胃癌患者外周血中髓源性抑制细胞（myeloid derived suppressor cells,MDSCs）的数量变化并探讨其临床意义。方法：选取24例胃癌患者和15例健康志愿者,术前收集外周血2 mL;选择术后30天、门诊复诊经检查恢复顺利的患者18例与术前配对,收集外周血, 以CD14 /CD11b+/CD33+/HLA DR 作为MDSCs的表面标志物。用流式细胞仪检测MDSCs所占的比例,分析MDSCs的数量变化情况及其临床意义。同时对MDSCs在外周血中的表达与临床病理因素相关性进行分析。结果：健康对照组外周血MDSCs占（0.226±0.044）%,胃癌患者术前和术后复诊者外周血MDSCs所占比例分别为（1.903±0.247）%,（1.120±0.240）%。胃癌患者与对照组MDSCs比例差异有统计学意义（t=2.47,P<0.05）,手术前后MDSCs差异有统计学意义（t=2.14,P<0.05）。MDSCs在胃癌患者外周血的表达与性别、年龄、肿瘤大小、浸润深度、TNM分期以及有无淋巴结转移无关,与肿瘤的分化程度相关。 结论： MDSCs在胃癌患者免疫功能障碍中起重要作用,肿瘤负荷减轻后机体抗肿瘤免疫功能有所恢复。