基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备及初步鉴定

目的通过杆状病毒表达系统表达制备基孔肯雅病毒(CHIKV)病毒样颗粒并进行初步鉴定。方法首先将基孔肯雅病毒的结构蛋白基因C-E3-E2-6K-E1克隆入p Fast-Bac~(TM) Dual转移载体中并鉴定;然后将构建正确的重组转移载体转化DH10Bac感受态细胞后提取重组杆粒并鉴定;再将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒,并利用免疫荧光法(IFA)鉴定其感染Sf9细胞后E2蛋白的表达;最后通过透射电镜(TEM)和Western-Blot鉴定CHIKV病毒样颗粒。结果成功获得了含有CHIKV结构蛋白基因的重组杆状病毒,该重组病毒经过IFA及WB验证在昆虫细胞中能够表达CHIKV的E蛋白,并在电镜下观察到了直径约60~80 nm的CHIKV病毒样颗粒。结论通过杆状病毒表达系统成功表达并获得CHIKV的病毒样颗粒,为CHIKV早期快速检测法的建立奠定基础。     

致婴幼儿腹泻星状病毒非结构蛋白诱导宿主细胞凋亡的分子机制

星状病毒(human astrovirus,HAstV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体,发病率高,易造成群体感染,威胁公共卫生安全。目前HAstV导致腹泻的致病机制尚不明确。本研究前期工作基础表明HAstV非结构蛋白nsP1a能够诱导细胞凋亡,是病毒诱发腹泻的主要原因。基于前期研究结果,本研究以nsP1a蛋白为研究对象,深入探讨nsP1a诱导细胞凋亡的能力及信号通路,并筛选鉴定nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的关键结构域。【立论依据】 文献表明,病毒诱导的腹泻大多与小肠上皮细胞凋亡密切相关。前期研究表明HAstV野毒株能诱导Caco-2细胞凋亡,非结构蛋白nsP1a起到主要作用。基于前期实验结果,本研究深入开展nsP1a诱导Caco-2凋亡的分子机制研究。 【设计思路】 以nsP1a蛋白为研究对象,探讨nsP1a蛋白诱导细胞凋亡的分子机制,明确nsP1a蛋白诱导的凋亡是通过何种途径发挥作用;筛选鉴定nsP1a蛋白促凋亡作用的关键结构域。 【实验内容】 构建nsP1a蛋白真核表达载体转染宿主细胞,建立稳定表达细胞株。采用流式细胞技术检测蛋白诱导细胞凋亡的能力。实时定量及蛋白质印迹法检测细胞caspase3、caspase8、caspase9、FADD蛋白、Bcl-2、Bax的表达变化。综合分析受体途径和线粒体途径参与诱导细胞凋亡的机制。构建nsP1a蛋白不同位点的删除突变体,流式细胞仪分析筛选nsP1a蛋白中诱导细胞凋亡的主要结构域。 【材料】 载体pEGFP-N3,Caco-2细胞, Lipofectamine 2000, caspase3、6、8、9,细胞色素C、FADD、PARP、LaminA/C,EGFP抗体等。 【可行性】 本研究由国家自然基金青年基金项目(81201285)及辽宁省大学生创新创业训练计划项目(201210160005)支持。 【创新性】 本研究内容国内外未见报道。本研究为探明nsP1a蛋白参与的星状病毒致腹泻机制提供理论依据,同时也为星状病毒抗腹泻药物的筛选提供有效靶点。     

深圳市首例基孔肯雅病毒的形态学及分子遗传特征分析

目的 对深圳市首发基孔肯雅病毒(CHIKV)进行分离、增殖培养、浓缩、形态学观察及构建系统发生树分析,为后续基因组信息解析、蛋白组分析、单克隆抗体制备及疫苗研发等应用性研究提供实验基础.方法 利用C6/36细胞从病人血清中分离CHIKV,采用BHK-21细胞对CHIKV进行大量的增殖培养,经7％PEG8000浓缩,超薄切片和负染观察CHIKV显微结构;对分离得到的CHIKV株进行全基因组测序和构建系统发生树,结合流行病学资料对其分子遗传特征进行分析.结果 CHIKV被成功分离并浓缩;在透射电镜下观察CHIKV的直径约为70 nm,圆形有包膜,表面有纤突;CHIKV(SZ-20101028)基因组长为12 377bp,属于E1-A226突变株;该病毒是最近10年来在印度洋岛屿爆发流行的新亚型,与流行病学调查资料相吻合.结论 以现有的条件建立了一种稳定、快速培养浓缩CHIKV的方法,并初步对CHIKV进行了形态观察和溯源性分析.     

HIV-1P24蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

目的制备HIV-1P24蛋白及单克隆抗体,建立酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测HIV感染。方法聚合酶链反应(PCR)扩增p24基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,经E.coli表达并纯化HIV-1P24蛋白。以纯化P24蛋白抗原免疫Balb/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,制备能产生P24单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用Wes ternblot、ELISA技术对制备的单克隆抗体进行初步鉴定,建立检测P24蛋白含量的ELISA竞争法。结果原核表达重组质粒在E.coli中能高效表达P24蛋白,从杂交瘤细胞中选取能稳定分泌P24单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用ELISA竞争法检测HIV-1阳性的血清中P24蛋白含量与病毒载量显著相关。结论 P24蛋白及特异性单克隆抗体成功制备,并建立了检测P24蛋白含量的ELISA竞争法。     

人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的 通过构建人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶(ALT1)的原核表达载体,并用纯化的ALT1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备有生物活性的单克隆抗体.方法 用GST-ALT1融合蛋白作为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗ALT1的单克隆抗体,用间接ELISA、Dot-Elisa、Western blot等方法对抗体的抗原结合特性进行鉴定.结果 获得1株能稳定分泌抗ALT1单克隆抗体的细胞株8A9,亚类鉴定这种单抗为IgG2.间接ELISA法测定细胞株腹水抗体的效价为10×10~5.Dot-ELISA、Western blot显示ALT1单克隆抗体能特异性地识别免疫原.结论 成功制备ALT1单克隆抗体.     

黄热病毒单克隆抗体的制备及免疫反应特性鉴定

目的 制备黄热病毒单克隆抗体并对其生物特性进行鉴定.方法 通过动物免疫、细胞融合、阳性克隆筛选等方法制备黄热病毒单克隆抗体,免疫Balb/c小鼠收集腹水,得到扩大制备的单抗,辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水.IFA法检测单抗与黄热病毒(YFV)、乙脑病毒(JEV)、登革病毒1-4型(DENV1-4)、西尼罗病毒(WNV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)的特异性反应,并对纯化前后的腹水进行效价分析;ELISA方法进行单抗的亚型分类.结果 获得8株黄热病毒的单克隆抗体,均与YFV有特异性反应,1株与JEV有交叉反应,余7株与其它4种虫媒病毒无交叉反应.抗体分型大部分为IgG;纯化后单抗蛋白含量大多在30 mg/ml以上.纯化后的4株单抗效价在1∶25600,3株在1∶12800,仅1株效价较低.结论 本研究目前获得了几株特异性好、效价高的黄热病毒单克隆抗体,为建立黄热病毒快速检测系统奠定了基础.     

重组人纤维连接蛋白羧基端细胞结合域单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备人纤维连接蛋白(fibronectin,FN)羧基端细胞结合域的单克隆抗体,并以该抗体检测心脏瓣膜基质蛋白中FN蛋白的表达情况.方法:用RT-PCR方法获取人FN羧基端细胞结合域基因序列,通过pET32质粒表达获得TRX融合蛋白.并以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠后,按常规方法制备成单克隆抗体,获得分泌抗FN单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结果:蛋白电泳结果显示,所获TRX融合蛋白条带与理论计算值相符,免疫动物后获得2株分泌抗FN羧基端细胞结合域不同位点单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚型为IgG2a,免疫组化显示该抗体能特异性地结合人心脏瓣膜基质中的FN.结论:成功制备了分泌抗FN单克隆抗体,为FN结构、功能和机制的研究提供了有效工具.     

多囊蛋白1胞内区单克隆抗体的制备及初步应用

目的：制备多囊蛋白1胞内区单克隆抗体，并用以观察多囊蛋白1在肾组织中的分布与表达。方法：以重组多囊蛋白1胞内段融合蛋白为抗原，采用杂交瘤技术，制备产生针对多囊蛋白1胞内区的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并利用所产生的单克隆抗体，采用标准EnVision免疫组织化学方法，对多囊肾组织、正常成人肾组织和胎肾组织进行染色。结果：获得4株稳定分泌抗体且效价为1：10^6左右的杂交瘤细胞株，传代至第50代仍能稳定分泌抗体，效价不变；多囊蛋白1在正常成人肾组织的近端小管、远端小管和集合管的上皮细胞呈弱阳性表达，在胎儿肾脏的肾小管上皮细胞呈强阳性，在多囊肾组织的囊肿衬里上皮细胞表达明显增强。结论：成功制备了多囊蛋白1胞内区单克隆抗体，为深入了解多囊蛋白1的结构和功能提供了一个有用的工具。     

PDGFR单克隆抗体的制备和鉴定

目的 通过谷胱甘肽转硫酶偶联的血小板衍生因子受体氮端的融合蛋白(GST-PDGFR-N)制备有生物活性的单克隆抗体.方法 用GST-PDGFR-N融合蛋白作为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗PDGFR的单克隆抗体,用间接ELISA、Western blot、免疫组化等方法对抗体的抗原结合特性进行鉴定.结果 获得两株能稳定分泌抗PDGFR单克隆抗体的细胞3B12F5和3C6H7C11,亚类鉴定两种单抗均为IgG1.间接ELISA法测定两株细胞腹水抗体的效价分别为1:102400为和1:25600.Western blot法显示PDGFR单克隆抗体特异性地识别免疫原和胶质瘤细胞株U251中的抗原成分.细胞免疫组化显示此单抗可以特异的识别胶质瘤细胞株U251和膀胱癌细胞株BIU87中表达的PDGFR抗原.结论 成功制备PDGFR单克隆抗体,为研究PDGFR的表达情况和临床检测提供了一个有用的工具.     

人睾丸特异表达基因TDRG1 单克隆抗体的制备及鉴定

目的：构建原核质粒表达TDRG1重组蛋白,制备其单克隆抗体（mAb）并鉴定其生物学特性。方法：用逆转录聚合酶链反应法从成人睾丸组织中扩增TDRG1编码序列,将其克隆到pET21原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）内进行诱导表达TDRG1重组蛋白。以纯化后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体（mAb）。ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的效价和类型,Western 印迹和免疫组织化学染色鉴定mAb的特异性。 结果：成功构建了pET21/TDRG1原核表达质粒并获得纯度较高的重组蛋白。筛选出2株能稳定分泌抗TDRG1的单克隆抗体杂交瘤细胞系,其效价比高达1∶1.6×106,免疫球蛋白类型均为IgG1类。Western 印迹和免疫组织化学染色显示该mAb能特异结合成人睾丸组织中的TDRG1蛋白。结论：所获得的重组TDRG1蛋白纯度高,免疫抗原性强,并成功制备了抗TDRG1的单克隆抗体。     

人类肿瘤相关蛋白hyrdC的原核表达、抗体制备及其在胃癌中的初步检测

目的:制备原核表达的hyrdC纯化蛋白及相应单克隆抗体,并以该抗体初步检测胃癌中hyrdC蛋白的表达.方法:用RT-PCR方法获取人hyrdC基因序列,插入原核表达载体pET32a构建重组质粒,纯化得到TRX-hyrdC融合蛋白,将其作为抗原免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备抗hyrdC单克隆抗体,以ELISA、Western印迹法筛选及鉴定;采用免疫组织化学法(SP法)比较胃癌组织及瘤旁正常组织中hyrdC抗体水平的差异.结果:测序结果显示克隆的hyrdC ORF与GenBank中登录的序列一致.所获TRX-hyrdC融合蛋白相对分子质量与理论计算值相符,获得2株分泌抗hyrdC单克隆抗体的细胞株;Western印迹法显示该抗体能特异性地结合人hyrdC蛋白;SP法测定显示,hyrdC蛋白在胃癌组织中表达明显高于正常胃组织(P＜0.001).结论:成功制备了抗hyrdC单克隆抗体;SP法测定胃癌组织与瘤旁正常组织中hyrdC抗体水平有显著差异.     

抗HSPC238单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的 制备抗HSPC238的单克隆抗体,为HSPC238的功能研究奠定基础.方法 以纯化的重组蛋白HSPC238为抗原,免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备HSPC238单克隆抗体,并用问接ELISA法和Westem-blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定.结果 成功建立两株稳定分泌抗HSPC238的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为E001和E002.ELISA检测抗HSPC238单克隆抗体的腹水效价为1:12800和1:25600.两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为Ig异G1.通过Western-blot实验证实,两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性HSPC238蛋白.结论 成功制备了两株效价高、特异性好的抗HSPC238单克隆抗体,制备的抗HSPC238单克隆抗体可用于HSPC238蛋白的鉴定,为HSPC238蛋白的生物学功能研究奠定了基础.     

特异性SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位初步分析

目的：用分段表达纯化的SARS冠状病毒（SARS-CoV）的核衣壳蛋白（nucleocapsid N蛋白）制备针对该蛋白不同区域抗原表位的高特异性单克隆抗体（McAb）,初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。方法：用分段表达纯化的SARS～CoV的N蛋白（分别记为N1蛋白、N2蛋白）分别免疫Balb／c小鼠制备McAb,通过检测其亚类、效价及相对亲和力鉴定McAb的生物学特性,以Western blot鉴定单克隆抗体特异性,并对McAb结合表位进行初步分析。结果：筛选出7株抗SARS-CoV N1蛋白及2株抗SARS-CovN2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定6株为IgG1,2株为IgG2b,1株为IgG3,腹水效价10^5以上;亲和常数达10^8以上。Western blot证实所获的单克隆抗体可与SARS-CoVN蛋白发生特异性反应。ELISA相加实验结果显示2株N1 McAb识别相同的抗原表位,其余均识别不同的抗原表位。结论：通过分段表达纯化的SARS-CoVN蛋白而制备的特异性针对SARS-CoV N蛋白不同区域抗原表位的单克隆抗体中,N1单抗识别N蛋白N端（1-549bp）,N2单抗识别N蛋白C端（496～1269bp）,可初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。     

SARS冠状病毒S蛋白基因片段的表达及其单克隆抗体的制备

目的: 表达SARS冠状病毒S蛋白片段,并制备特异性单克隆抗体(mAb).方法: 原核表达SARS冠状病毒S蛋白片段,从SARS病毒cDNA中扩增S蛋白(N端205至419aa)基因片段,测序结果正确.将该基因片段插入pQE-30中,构建重组质粒pQE-30-S1m,以重组质粒转化E.coli M15诱导表达His-S1m蛋白.纯化后免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb.结果: 表达并纯化了重组蛋白His-S1m,获得1株抗His-S蛋白的mAb1H2.Ig亚类鉴定为IgG1a,轻链为κ型.经Western blotting检测,mAb1H2与S蛋白发生特异性反应,而与His蛋白无交叉反应.结论: 成功表达了重组S蛋白并制备了特异性mAb,为SARS-CoV的早期诊断及进一步研究S蛋白的功能奠定了基础.     

抗肿瘤转移肝素酶特异性抗体的筛选及鉴定

目的通过鉴定制备的人肝素酶单克隆抗体,筛选出具有抗肿瘤转移特异性的单克隆抗体株,并大量制备.方法采用Western blot技术,以HepG2、SGC-7901、MKN45、SW480、U2OS、MCF-7细胞总蛋白为样本,对已制备的3株人肝素酶单克隆抗体进行初步鉴定,筛选出能够与肝素酶蛋白特异性结合的抗体,并采用免疫细胞化学技术进一步验证筛选出的抗体特异性,然后通过Transwell体外侵袭实验观察筛选出的肝素酶单克隆抗体对肿瘤转移的抑制作用.结果已制备的3株人肝素酶单克隆抗体均能与不同肿瘤细胞肝素酶蛋白结合,其中12号抗体与商品化肝素酶单克隆抗体在MCF-7细胞中均检测出肝素酶弱阳性表达,其特异性最佳;免疫细胞化学结果也显示在SGC-7901、HepG2、MKN45、SW480和U2OS细胞中12号抗体能检测出肝素酶阳性表达,而在MCF-7细胞中检测出肝素酶弱阳性表达;Transwell体外侵袭实验结果显示12号抗体(100 μg,浓度约1 mg/ml)作用于SGC-7901、HepG2、MKN45、SW480和U2OS细胞48 h后,其穿膜细胞数与正常小鼠IgG对照组相比明显减少(P<0.05).结论纯化制备的人肝素酶单克隆抗体能够与肿瘤细胞表达的肝素酶蛋白特异性结合,并通过抑制肝素酶蛋白达到抑制肿瘤细胞的扩散与转移.     

NMDA受体NR2B亚单位特异性单克隆抗体的制备及人胚脑皮层NR2B蛋白表达的研究

目的：制备NMDA受体NR2B亚单位特异性单克隆抗体，并对人胚脑皮层NR2B的表达作免疫印迹分析。方法：制备NR2BC末端934～1457氨基酸与GST的融合蛋白，并以此作为免疫原，经常规杂交瘤技术制备单克隆抗体。用该抗体对不同周龄的人胚脑皮层的NR2B蛋白作免疫印迹分析。结果：本研究制备的NR2B单克隆抗体能特异地识别180kDa的NR2B蛋白，并首次发现人胚脑皮层NR2B亚单位蛋白的表达。结论：成功制备了NR2B特异的单克隆抗体；12周龄的人胚脑皮层组织已有NR2B的表达，表达量随胎龄增大而增高。     

抑癌基因BCSC-1原核表达载体的构建及诱导表达

目的 构建BCSC-1基因原核表达载体并进行诱导表达、纯化.方法 PCR方法从腺病毒穿梭载体pDC316-BCSC-1扩增BCSC-1基因,构建原核表达载体ET30a-BCSC-1,转化感受态E.coli BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的 蛋白的表达,并用超声洗涤方法进行目的 蛋白洗涤纯化.结果 成功构建原核表达载体pET30a-BCSC-1;在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为86 000的重组BCSC-1蛋白,目的 蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,经超声洗涤纯化后,重组蛋白纯度可达85%以上.结论 利用构建的原核表达载体成功表达出BCSC-1蛋白,为进一步制备抗BCSC-1的单克隆抗体及在临床中的应用打下良好基础.     

FcεR Ⅰ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的 通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体FeεR Ⅰα亚基,并用重组蛋白制备单克隆抗体.方法 用RT-PCR的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取FcεR Ⅰα蛋白基因,经T-A克隆、亚克隆至pET28a( )原核表达载体,将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),IPTG诱导表达FeεR Ⅰα亚基蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白;并用其免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定.结果 成功调取了人IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基的基因,且测序正确;构建原核表达质粒FcεR Ⅰα-pET28a( );成功建立4株稳定分泌抗FcεR Ⅰα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为G101、C22、G113、G42.通过细胞免疫荧光实验证实,4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεR Ⅰα亚基.结论 成功利用基因重组技术制备了FcεR Ⅰα亚基蛋白,制备了4株效价高、特异性好的抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,为FeεR Ⅰα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础.     

Construction and expression of PON1 fusion protein

目的 重组及表达对氧磷脂酶PON1的融合蛋白,为进一步制备相应单克隆抗体作准备,为建立一种冠心病辅助诊断方法奠定基础.方法 以成人肝cDNA文库为模板,应用PCR技术扩增出PON1基因,将其分别与带有HIS标签的pET-32a及GST标签的pGEX-4T-1载体连接,转化人DH5α菌中进行克隆并测序鉴定.进一步构建表达体系,用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,最终在BL21菌中表达PON1融合蛋白(分别含有HIS、GST-Tag),并进行SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果 以成人肝cDNA文库为模板经PCR扩增后得到一条234 bp的DNA片段,经测序鉴定为PON1基因序列;并在大肠杆菌中实现了包涵体形式的表达,经Western blot鉴定为PON1融合蛋白.结论 采用原核表达方法可获得高纯度的PON1融合蛋白,为进一步制备相应的单克隆抗体和开发PON1诊断试剂盒打下基础,为冠心病的诊断开辟新途径.     

抗人PDCD10单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备鼠抗人程序性细胞死亡分子10(programmed cell death 10, PDCD10)的单克隆抗体,探讨PDCD10蛋白的结构和功能.方法:利用重组PDCD10蛋白为免疫原,免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合, 通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得鼠抗PDCD10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过ELISA,Western blot和免疫荧光实验等方法对其特性进行鉴定.结果:成功地建立了3株稳定分泌抗PDCD10蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5G1, 4F7和3H5.3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分别为IgG1(4F7和5G1)和IgG2b(3H5).ELISA检测的单克隆抗体腹水效价可达1:10⁷.3株单克隆抗体与重组PDCD10蛋白有较强的特异性反应,而与大肠杆菌细胞裂解液以及谷胱苷肽-S转移酶(glutathione S-transferase,GST)没有交叉反应.同时,5G1单克隆抗体也能特异性地结合真核细胞内源性和超表达的PDCD10蛋白,免疫荧光竞争结合实验以及Western blot的结果证明3株PDCD10的单克隆抗体能够识别不同的抗原表位,内源性以及超表达的PDCD10蛋白主要定位在细胞核.结论:获得了效价高、特异性好的PDCD10蛋白的单克隆抗体,为PDCD10的生物学功能研究奠定了基础.