低剂量电离辐射诱导转录因子NF-κB活化及其信号通路的实验研究

目的 研究低剂量电离辐射对转录因子NF—κB DNA结合活性的影响，探讨NF—κB结合活性信号传导通路的机理。方法 采用凝胶电泳移动变化分析及免疫组织化学的方法检测了X射线照射后FL-4细胞NF—κB DNA结合活性的时程变化及p65核转位、IκBα水平的变化，同时用脂质体介导的瞬时转染法将空质粒和NF-κB-荧光素酶表达质粒转染到NIH3T3细胞内，并用PKC信号通路阻断剂Calphostin C处理，检测受照后其荧光素酶的表达变化。结果 0．075Gy X射线照射可诱导NF—κB、p50／p65和p50／p50活性增强，而前者活性增强更明显。这种转录激活能力的增强，涉及到辐射诱导的p65核转位和IκBα水平的变化，表现为受照后p65亚基核阳性率明显升高，而IκBα水平的变化正相反，在照后4h分别达到峰值和低谷。而且PCK信号通路阻断剂Calphostinc可降低0．075Gy照射对NF—κB的活化效应。结论 低水平照射诱导NF-κB的迅速活化，而且可能通过PKC通路，进而调节细胞因子等特异基因的表达，促使免疫功能增强，这可能是低剂量辐射兴奋效应的机理之一。     

NF-κB在TNF-α和血管紧张素Ⅱ致内皮细胞凋亡中的作用

目的:了解NF-κB在TNF-α和血管紧张素Ⅱ导致内皮细胞凋亡中的作用。方法:用浓度为10 ng/ml TNF-α和浓度为1μmol/L血管紧张素Ⅱ分别干预内皮细胞,TUNEL法检测细胞的凋亡情况、EMSA检测NF-κB的活性和Western-blot检测IκBα的表达;用浓度检测细胞的凋亡、NF-κB的活性和IκB的表达。结果:TNF-α和血管紧张素Ⅱ显著引起了细胞的凋亡、IκBα蛋白的裂解和NF-κB的激活,用PDTC预处理后,在NF-κB活性减弱的同时抑制了细胞的凋亡。结论:在内皮细胞中,TNF-α和血管紧张素Ⅱ通过裂解胞浆内的IκBα蛋白进而激活NF-κB引起的细胞凋亡。     

IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2表达及其分子机制

目的观察白介素-1β(IL-1β)诱导人气道上皮细胞人β防御素-2(hBD-2)的表达及抑制因子I-κBα蛋白、核转录因子κB(NF-κB)活性的变化,探讨人气道上皮hBD-2表达的分子机制. 方法用IL-1β和(或)NF-κB抑制剂PDTC处理人原代气道上皮细胞,RT-PCR法检测hBD-2 mRNA的表达,Western blot检测胞浆I-κBα蛋白,凝胶迁移实验(EMSA)检测NF-κB活性的变化. 结果加入IL-1β 1μg/L刺激0.5h,可见I-κBα活性降低;刺激1.5h可见hBD-2 mRNA表达.NF-κB抑制剂PDTC可抑制hBD-2 mRNA的表达,EMSA显示NF-κB的异型二聚体p65-p50参与了hBD-2表达的转录.结论一定剂量的IL-1β可诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达,NF-κB p65/p50异型二聚体参与了IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达的转录调控.     

外源表达人CPNE5诱导细胞内质网应激反应

目的:探讨外源表达人CPNE5诱导细胞发生内质网应激反应的机制.方法:分别转染空载体pcDNA4和人CPNE5编码区序列的真核表达质粒pcDNA4-CPNE5至HEK293细胞,48 h后收集细胞,通过RT-PCR、Western印迹检测基因mRNA及蛋白的表达.结果:外源表达人CPNE5蛋白可以上调内质网应激特征分子GRP78、CHOP、JNK1基因的表达.结论:外源表达人CPNE5可以诱导HEK293发生内质网应激反应.     

高致病性禽流感H5N1NP蛋白与NIK蛋白相互作用初步研究

目的 研究高致病性禽流感H5N1(A/goose/Jilin/hb/2003)核蛋白(NP)与NF-κB 诱导激酶(NIK)是否存在蛋白质相互作用,探讨H5N1 NP对NIK诱导的NF-κB转录活性的影响.方法 从人宫颈癌细胞系HeLa细胞的总RNA中经逆转录和PCR获得NIK的全长cDNA双链片段,分别以其和pcDNA3-Flag-NP载体为模板,pCMV-Myc-N和pGEX-4T-1为载体,构建真核表达载体pCMV-Myc-NIK和原核表达载体pGEX-4T-1-NP (GST-NP),并通过免疫共沉淀及GST pull-down实验检测H5N1 NP和NIK之间是否存在相互作用,利用双荧光素酶报告基因系统检测H5N1 NP对NIK诱导的NF-κB转录活性的影响.结果 免疫共沉淀及GST pull-down实验表明,构建的真核表达载体pCMV-Myc-NIK和原核表达载体pGEX-4T-1-NP(GST-NP)均能正确表达,H5N1 NP与NIK之间存在相互作用;报告基因结果显示,H5N1 NP蛋白能明显抑制NIK诱导的NF-κB转录活性.结论 H5N1 NP与NIK之间存在蛋白质相互作用,并抑制NIK诱导的NF-κB转录活性,为进一步研究H5N1的致病机制打下基础.     

NF-κBp65特异性siRNA的筛选和功能鉴定

目的:筛选有效的核因子-κB(NF-κB)p65特异性小干扰核糖核酸(siRNA),优化反应条件,用来抑制白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的软骨细胞中一氧化氮合酶-2(NOS-2)和环氧合酶-2(COX-2)的表达,探讨siRNA技术在关节炎治疗方面的应用。方法:体外转录合成NF-κBp65特异性siRNA,质脂体转染软骨细胞,筛选出有效的siRNA。将筛选的siRNA转染培养的软骨细胞,再用IL-1β刺激诱导软骨细胞,提取蛋白质和RNA。利用RT-PCR和Westernblot从mRNA和蛋白质两水平检测NF-κBp65、NOS-2和COX-2的表达,采用凝胶电泳迁移率分析(EMSA)测定NF-κB的活性。结果:NF-κBp65特异性siRNA有效干扰NF-κBp65的表达,降低NF-κB的活性,抑制IL-1β诱导的NOS-2和COX-2的表达。结论:NF-κBp65特异性siRNA可用于关节炎治疗的实验研究。     

核因子κB降低小鼠胚胎成纤维细胞中Lmp2基因转录

目的 研究在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中,核因子κB(NF-κB)对Lmp2基因转录的影响.方法 利用NF-κB荧光素酶报告基因检测MEF和c-abl/arg缺失株(DKO)中内源性NF-κB活性;构建包含Lmp2启动子序列和NF-κB结合序列突变体的荧光素酶报告基因,通过双荧光素酶报告系统,研究NF-κB对Lmp2启动子转录活性的调控,并应用定量PCR、Western印迹比较Lmp2基因在MEF和DKO细胞中表达水平.结果 DKO细胞中内源性NF-κB活性上调;DKO细胞中Lmp2基因启动子的转录活性发生下调,并且NF-κB结合序列突变后,其转录活性升高;定量PCR和Western印迹结果表明,DKO细胞中Lmp2基因mRNA和蛋白表达水平比较MEF细胞均发生下调.结论 MEF中内源性NF-κB可负调控Lmp2基因转录,并降低其蛋白表达水平.     

IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2表达及其分子机制

目的观察白介素-1β（IL-1β）诱导人气道上皮细胞人13防御素2（hBD-2）的表达及抑制因子I-κBα蛋白、核转录因子KB（NF-κB）活性的变化，探讨人气道上皮hBI〉2表达的分子机制。方法用IL-1β和（或）NF-κB抑制剂PDTC处理人原代气道上皮细胞，RT-PCR法检测hBD-2mRNA的表达，Western blot检测胞浆I-κBa蛋白，凝胶迁移实验（EMSA）检测NF-κB活性的变化。结果加入IL-1β 1μg／L刺激0．5h，可见I-κBa活性降低；刺激1．5h可见hBD-2 mRNA表达。NF-κB抑制剂PDTC可抑制hBD-2 mRNA的表达，EMSA显示NF-κB的异型二聚体p65-p50参与了hBD-2表达的转录。结论一定剂量的IL-1β可诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达，NF-κB p65／pS0异型二聚体参与了IL-1β诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达的转录调控。     

Bortezomib对非小细胞肺癌细胞系增殖、细胞周期及核转录因子活性的影响

目的探讨Bortezomib对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞周期、增殖、凋亡及核转录因子(NF-κB)的影响。方法采用MTT法检测Bortezomib对细胞生长的抑制作用,流式细胞仪分析Bortezomib对细胞周期及凋亡的影响,Western blotting检测Borte-zomib对NF-κB、IκB和Bcl-2表达的影响。结果随着作用时间和药物浓度的增加,Bortezomib对NSCLC细胞的生长抑制作用越明显。25nmol/L的Bortezomib作用48h可以使细胞周期阻滞在G2/M期。6种NSCLC细胞中均有NF-κB的基础性表达,且胞核中NF-κB的表达水平与胞质IκB的表达水平呈反比。Bortezomib对细胞中NF-κB的基础表达水平没有影响,但能明显抑制TNF-α诱导的NF-κB的核转位,并下调抗凋亡蛋白Bcl-2的水平,且这种抑制作用呈时间和剂量依赖趋势。结论Bortezomib能够抑制NSCLC细胞增殖,并诱导凋亡发生,可能是通过NF-κB通路发挥作用。     

NF-κB在肝细胞生长因子介导的肝脏干细胞增殖效应中的作用

目的 研究NF-κB途径在肝细胞生长因子(HGF)介导的肝脏WB F-344细胞增殖信号转导调控中的作用.方法 用不同浓度的HGF(0,20,40,80,100ng/ml)刺激、WB F-344细胞,24h后用3H-TdR掺人法检测细胞的增殖效应.采用脂质体转染方法用位点阴性的IκBa蛋白突变体质粒转染WB F-344细胞,阻断NF-κB活性.用HGF(40ng/ml)刺激0、15、30、60、120min后提取核蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)检测NF-κB的结合活性.采用脂质体转染法将NF-κB报告基因质粒BD Great EscA PeSEAPvector瞬时转染WB F-344细胞后用不同浓度的HGF(0、10、20、40ng/m1)刺激8h,通过BD Great EscA PeTM SEAP荧光检测系统检测NF-κB的转录活性.用NF-κB抑制剂如BAY-11-7082和ASA预处理WB F-344细胞,再用HGF(40ng/ml)刺激24h,通过3H掺入法检测细胞增殖效应.结果 HGF具有促进WB-F344细胞增殖的作用,且呈剂量效应正相关趋势.HGF能够明显提高NF-κB DNA的结合活性,NF-κB复合物在HGF作用15min后即出现,并在30～60min时达到高峰,以后逐渐减退.HGF能够显著促进NF-κB的转录活性,呈剂量效应相关趋势.用NF-κB抑制剂BAY-11-7082或ASA阻断NF-κB后,HGF诱导的WB F-344细胞增殖能够被明显抑制;在转染NF-κB抑制质粒的细胞,HGF介导的WBF-344细胞增殖效应被完全阻断.结论 HGF可促进WBF-344细胞增殖,且呈剂量效应正相关趋势.HGF介导的WB F-344细胞增殖效应依赖NF-κB的活化,NF-κB的激活对于HGF介导的WB F-344细胞增殖效应是必须的.     

转染金属蛋白酶抑制剂2基因对损伤血管平滑肌细胞核因子—κB和蛋白激酶C的影响

目的探讨血管平滑肌细胞(VSMC)损伤后金属蛋白酶(MMPs)和蛋白激酶C(PKC)、核因子-κB(NF-κB)表达的变化.方法采用脂质体对VSMC转染金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)基因进行基因转染,并用Western blot加以鉴定,分别用酶谱分析法、凝胶电泳迁移率分析技术(EMSA)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学检测该细胞克隆MMPs、NF-κB的活性变化和PKCα mRNA、蛋白的表达水平.结果体外损伤的VSMC金属蛋白酶显著增加.PKCα、NF-κB在正常VSMC中很少表达,但在损伤的VSMC中这种表达非常显著,对兔VSMC进行lIMP-2转染后,损伤的VSMC MMP-2,9活性受抑制,并且PKCα、NF-κB的表达下调(P＜0.05).结论PKCα和NF-κB在MMPs合成及损伤VSMC迁移中有重要价值,TIMP-2能通过抑制平滑肌细胞PKCα、NF-κB信号途径来防止血管再狭窄.     

PTEN对脂多糖攻击RAW264.7细胞核因子-κB转录活性的影响及其意义

目的探讨PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）全县对脂多糖（LPS）攻击RAW264．7细胞核因子-κB转录活性的影响。方法NF-κB-LUC质粒与PTEN质粒或其突变质粒分别共转染RAW264．7细胞,通过检测NF-κB反应性荧光素酶报告基因表达,观察PTEN在LPS攻击巨噬细胞时对NF-κB转录激活的影响。结果野生型PTEN过表达可促进LPS诱导的NF-κB活性增强,而突变型PTEN则没有明显作用。结论PTEN可正性调控LPS诱导的NF-κB转录因子的激活,从而有可能在内毒素所诱导的炎症反应中发挥重要的调控作用。     

α-硫辛酸对高糖诱导的系膜细胞核因子-κB活性的抑制作用

目的探讨α-硫辛酸对高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖及核因子-κB(NF-κB)活性的影响。方法在体外条件下采用正常糖(NG)、高糖(HG)及HG 不同浓度α-硫辛酸处理大鼠系膜细胞;噻唑蓝法(MTT)测定系膜细胞增殖;采用凝胶电泳迁移率改变法检测NF-κB的活性。结果50~300μmol/L的α-硫辛酸可抑制系膜细胞增殖。HG刺激系膜细胞1h可引起NF-κB活性增强2·2倍(P<0·01),高糖诱导的NF-κB的活化可被α-硫辛酸(200μmol/L)所抑制(0·6±0·3vs2·2±0·2,P<0·01)。结论一定浓度的α-硫辛酸可抑制高糖诱导的系膜细胞增殖,并可降低NF-κB的DNA结合活性。     

Corilagin对小鼠小胶质细胞株照射后炎性反应因子表达的抑制作用

目的 研究抗炎药物Corilagin抑制放射引起小胶质细胞(BV-2)炎性反应的作用及其防护的分子机制。方法 细胞抑制实验(MTT)检测Corilagin对BV-2细胞的抑制率;Corilagin预处理小胶质细胞,12 h后,以0和32 Gy 2个放射剂量照射BV-2细胞,Real-time PCR检测小胶质细胞照射后不同时间点炎性反应因子IL-1β、TNF-α表达水平;硝酸还原酶法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)的含量;Western blot检测各组细胞核转录因子NF-κB p65蛋白表达;激光共聚焦显微镜观察各组细胞标志物Iba-1的表达、NF-κB p65核转位及Nemo的表达。结果 1～10 μg/ml浓度范围内Corilagin对BV-2细胞增殖几乎无影响;照射后小胶质细胞表面标志物Iba-1表达明显,提示小胶质细胞激活,且炎性反应因子NO、TNF-α、IL-1β表达上调,而Corilagin(5μg/ml)可以显著抑制上述炎性反应因子的表达(t_IL-1β=6.341, t_TNF-α=3.411, t_NO=3.134, P <0.05);Corilagin可抑制NF-κB活化蛋白Nemo,并显著抑制NF-κB p65的转位。结论 Corilagin可能通过NF-κB信号转导途径抑制照射后小胶质细胞的活化,从而下调炎性反应因子表达,保护神经元。     

核因子-κB在内毒素刺激大鼠肺泡巨噬细胞中的动态变化及其在肿瘤坏死因子-α表达中的作用

目的　观察内毒素 (LPS)刺激对大鼠肺泡巨噬细胞 (alveolarmacrophages,AM)中核因子 -κB(NF -κB)活性的影响 ,探讨NF -κB在LPS刺激大鼠AM表达肿瘤坏死因子 -α(TNF -α)中的作用。　方法　体外观察LPS刺激大鼠AM中NF -κB活性的动态变化 ,应用圈套策略观察NF-κB在LPS刺激大鼠AM表达TNF -α中的作用。　结果　LPS刺激可使大鼠AM内NF -κB明显活化 ,并与LPS剂量正相关 ;抗体超迁移率实验结果显示p5 0、p6 5参与了NF -κB的活化 ;NF -κB的圈套硫代寡核苷酸 (S -ODN)能明显抑制LPS刺激大鼠AM表达TNF -α ,但不能完全阻断LPS诱导的TNF -α表达。　结论　NF -κB(p5 0 p6 5 )在LPS介导的炎症反应中发挥重要作用 ,LPS刺激大鼠AM表达TNF -α受NF -κB调控 ,但其他核转录因子可能也在TNF -α的表达中发挥重要作用。     

核糖体蛋白RPS3 Ser209影响NF-κB转录活性及其与DNA结合能力

目的：构建人核糖体蛋白RPS3及其Ser209突变体的真核表达载体,初步探讨RPS3Ser209突变体对NF－κB转录活性及其DNA结合能力的影响。方法采用高保真PCR扩增RPS3的CDS序列,克隆入pcDNA－3．1myc－HisB载体,构建RPS3－myc表达载体。以构建成功的RPS3－myc质粒为模板,采用点突变方法构建RPS3Ser209突变体RPS3S209A－myc表达载体。报告基因实验检测RPS3及RPS3S209A对NF－κB转录活性的影响;共聚焦显微镜观察RPS3及RPS3S209A的细胞定位;EMSA 实验检测 RPS3及RPS3S209A的 DNA结合能力。结果成功构建RPS3－myc及RPS3S209A－myc真核表达载体,与野生型RPS3相比,RPS3S290A入核显著减少,其对NF－κB的激活显著降低,对NF－κB的DNA结合能力的影响显著下降。结论核糖体蛋白RPS3在NF－κB信号通路中的作用依赖于其第209位丝氨酸。     

β-七叶皂甙对脑损伤大鼠脑组织核因子-κB活性与肿瘤坏死因子-α蛋白表达的影响

目的　研究β-七叶皂甙(β-aescin)对大鼠急性脑损伤后脑组织核因子-κB(NF-κB)活性和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达的影响。　方法　62只SD大鼠采用自由落体致伤法制作脑外伤模型,随机分成四组: (1)假手术对照组(A); (2)创伤组(B); (3)β-七叶皂甙治疗组(C); (4)吡咯烷二硫基甲酸酯(PDTC)治疗组(D)。每组分别在术后6, 24h和3d三个时相点收取脑组织标本,采用凝胶电泳迁移率分析(EMSA)测定脑组织NF-κB活性;放射免疫法测定脑组织TNF-α蛋白水平,并测定脑组织含水量及进行病理形态学观察。　结果　与假手术对照组比较,大鼠脑损伤后脑组织NF-κB活性和TNF-α蛋白水平以及脑组织含水量显著增高(P<0. 01);与创伤组比较,β-七叶皂甙和PDTC治疗组脑组织NF-κB活性(P<0. 01 )、脑组织TNF-α蛋白水平(P<0. 01)及脑组织含水量(P<0. 05)均显著降低。　结论　β-七叶皂甙可以抑制NF-κB活化,下调TNF-α蛋白表达,从而减轻脑水肿。这可能是β-七叶皂甙治疗创伤性脑水肿的分子生物学作用机制之一。     

内毒素对心肌组织核因子-κB活化的影响及其意义

目的 通过观察内毒素(LPS)攻击大鼠心肌组织核因子-κB(NF-κB)的活化情况,探讨心肌损伤的可能信号机制.方法 大鼠腹腔注射5mg/kg LPS制作脓毒症模型,采用凝胶阻滞迁移分析法(EMSA)检测心肌组织NF-κB活化情况,RT-PCR法检测TNF-α基因表达情况.结果 LPS攻击后1h,NF-κB活化及TNF-α基因表达开始升高,2h达高峰,6h后逐渐下降.相关分析表明,心肌组织NF-κB活化与TNF-α基因表达呈显著正相关(r=0.992 2,P＜0.05).结论 LPS可增强心肌组织NF-κB的活化并诱导TNF-α基因表达.NF-κB活化导致的TNF-α合成增加在LPS介导心肌损害的分子机制中可能具有重要作用.     

BMP-7对高糖诱导近端肾小管上皮细胞外基质及NF-κB表达的影响

目的探讨骨形态发生蛋白7（BMP-7）对高糖诱导近端肾小管上皮细胞（HKc）表达细胞外基质及核转录因子-κB（NF-κB）的干预作用。方法采用人近端肾小管HKc细胞株,将细胞分为正常对照组（NG,5．5mmol／L葡萄糖）、高糖组（HG,25mmol／L葡萄糖）、HG＋100ng／ml BMP-7组、NG＋100ng／ml BMP-7组、高渗组（HM,25mmol／L甘露醇）。应用免疫细胞化学和ELISA技术检测细胞Ⅳ型胶原（Col Ⅳ）、纤维连接蛋白（FN）表达,用凝胶电泳迁移率竞争试验（EMSA）检测NF-κB的表达。结果高糖作用下NF-κB活性和Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白表达显著增高,加入100ng／ml BMP-7后可显著抑制NF-κB活性及Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白的表达。结论BMP-7可能通过抑制NF-κB活性而从转录水平抑制高糖诱导的近端小管细胞细胞外基质的过度表达。     

干扰素-α转染HepG2细胞内下调表达基因的筛选

目的 筛选干扰素-α真核表达质粒转染HepG2细胞后细胞内表达下调的基因,以进一步探讨干扰素-α作用的分子生物学机制.方法 将pcDNA3.1(-)-IFN-α以及pcDNA3.1(-)空载体分别转染肝母细胞瘤HepG2细胞系,用抑制性消减杂交技术筛选pcDNA3.1(-)-IFN-α转染HepG2细胞内表达下调的基因.以pcDNA3.1(-)转染组细胞作为tester,pcDNA3.1(-)-IFN-α转染组作为driver,建立消减文库,随机挑选阳性克隆,测序并进行序列比对,得到下调表达的基因.应用RT-PCR技术,进一步证明IFN-α对Hsp90的下调表达作用关系.结果 成功构建了IFN-α真核表达质粒转染HepG2细胞后表达下调的cDNA消减文库.从文库中随机挑选克隆,测序并进行生物信息学分析后,得到下调表达的基因有:铁蛋白,热休克蛋白90,S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶1,真核翻译延伸因子1β,信号序列受体β(SSR2),组织因子路径抑制子,RAD23同源物B.RT-PCR进一步表明,IFN-α真核表达质粒转染的HepG2细胞内Hsp90 mRNA表达水平下调.结论 应用SSH技术成功构建了pcDNA3.1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞内表达下调的cDNA消减文库,并筛选出下调表达基因,半定量RT-PCR表明IFN-α对Hsp90 mRNA具有下调表达作用.为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据.