不稳定逼尿肌Cx43基因表达及其与逼尿肌细胞间缝隙连接通讯功能的关系研究

目的研究连接蛋白Cx43基因在体外培养不稳定逼尿肌细胞中的表达及不稳定逼尿肌细胞间缝隙连接通讯(gap junction intercelluar communication,GJIC)功能的变化,初步探讨二者与逼尿肌不稳定(destrusor instability,DI)的关系.方法健康雌性Wistar大鼠40只,分为DI组和正常组.RT-PCR及Western blot法检测各组逼尿肌细胞中Cx43 mRNA及蛋白表达变化,划痕标记荧光染料示踪技术(SLDT)检测各组逼尿肌细胞间GJIC功能变化.结果RT-PCR及Western blot检测结果显示DI组逼尿肌细胞中Cx43 mRNA及蛋白含量明显高于正常组(P＜0.01),SLDT结果表明DI组逼尿肌细胞间GJIC明显强于正常组(P＜0.01).结论体外培养不稳定逼尿肌细胞中Cx43基因表达增加,细胞间GJIC增强,二者可能与DI的发生有密切关系.     

表皮生长因子对人子宫内膜细胞GJIC影响的体外研究

[目的]探讨表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)对人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞间隙连接细胞间通讯(Gap Junction htercellular Communication,GJIC)及连接蛋白(Connexin,Cx)43、32表达的影响.[方法]采用划痕染料标记示踪技术,以荧光黄染料在细胞同的扩散作为评价间隙连接通讯的指标,观察EGF对原代培养的人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞GJIC的影响,采用激光共聚焦显微镜扫描技术,观察EGF对Cx43、Cx 32表达的影响.[结果]EGF可显著抑制人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞GJIC功能(P＜0.01);增强Cx43、Cx2表达(P＜0.05).[结论]EGF可显著抑制人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞GJIC功能,提示其在子宫内膜增殖性病变的阶段扮演重要角色;EGF增强子宫内膜Cx43、Cx2表达,提示Cx表达量不能完全反映GJIC功能.     

抗心律失常肽对乳鼠心肌细胞急性缺氧时细胞间传导的影响

目的 研究抗心律失常肽(AAP10)对乳鼠心肌细胞急性缺氧时细胞间传导的影响.方法 原代培养的乳鼠心肌细胞,随机分为正常组、缺氧2 h组和100 nmol/L AAP10干预组,每组n=9.采用划痕标记染料示踪技术测定细胞间通讯,Western blot技术检测缝隙连接蛋白43(Connexin 43,Cx43)磷酸化水平的改变.结果 划痕标记染料示踪技术结果显示缺氧组细胞间传导下降,而AAP10干预后能促进荧光黄的扩散.Western blot结果显示缺氧组总Cx43蛋白表达下降,与正常组比较P＜0.01,而去磷酸化的Cx43(NP-Cx43)蛋白表达不变;AAP10干预组能提高总Cx43蛋白表达,与缺氧组比较P＜0.01,但对NP-Cx43蛋白表达无影响.结论 急性缺氧时磷酸化的Cx43(p-Cx43)蛋白表达下降,而AAP10改善传导主要通过促进Cx43磷酸化.     

豚鼠膀胱组织ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin 43表达意义

目的 探讨体外培养豚鼠膀胱组织ICCs细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)间隙连接蛋白Connexin 43的表达.方法 胶原酶消化法进行豚鼠膀胱组织ICCs细胞的原代培养, 对照为原代培养膀胱平滑肌细胞,免疫荧光法进行两种细胞的特征性蛋白c-kit及平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)染色观察,免疫荧光法及Western blot法进行培养细胞Connexin43的检测.结果 豚鼠膀胱ICCs细胞特征性蛋白c-kit染色阳性,SMA染色阴性.豚鼠膀胱ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin 43表达水平较高,显著高于膀胱平滑肌细胞.结论 豚鼠离体膀胱ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin43高表达可能是其信号传递的重要物质基础.     

几种趋化因子在伴放线放线杆菌刺激的巨噬细胞中的表达

目的探讨趋化因子在伴放线放线杆菌刺激的巨噬细胞中的表达情况.方法将伴放线放线杆菌和巨噬细胞共同培养,利用β-actin作为内参照,半定量逆转录PCR(RT-PCR)法,测定在不同时间点巨噬细胞表达趋化因子(IL-8、MIP-1α、RANTES、MGSA、MIG)mRNA的相对量.结果共同培养6h后,巨噬细胞中IL-8和MIP-1α mRNA表达量明显增加(P＜0.05,P＜0.01),并且随着培养时间的延长,表达量也增加.趋化因子RANTES mRNA的表达量无明显变化.结论趋化因子IL-8和MIP-1α mRNA表达量明显增加,提示其可能参与了以伴放线放线杆菌为优势致病菌的青少年牙周炎的免疫反应.     

腺病毒介导Cx43基因修饰对急性白血病骨髓基质细胞GJIC功能的影响

目的观察急性白血病骨髓基质细胞(acute leukemia bone marrow stromal cells,ALBMSCs)经腺病毒介导的间隙连接蛋白43(Cx43)基因修饰后Cx43基因表达的变化以及对细胞间隙连接通讯(GJIC)功能的影响。方法用重组腺病毒Ad-Cx43-GFP转染ALBMSCs,荧光显微镜观察报告基因GFP的表达并计算转染效率,RT-PCR法、Westernblot法和免疫细胞化学法检测ABMSCs转染前后Cx43基因及蛋白表达情况,通过染料传输实验观察细胞间隙连接通讯功能的变化。结果荧光显微镜下观察可见ALBMSCs在转染Ad-Cx43-GFP后24h即有绿色荧光表达,计数绿色荧光细胞的百分率得出转染效率为(82.7±2.16)%;RT-PCR法、Westernblot法和免疫细胞化学法检测显示转染Ad-Cx43-GFP后ALBM-SCsCx43基因及蛋白表达较转染前增强(P<0·01);转染Ad-Cx43-GFP后ALBMSCs GJIC功能较转染前增强(P<0·01)。结论腺病毒介导Cx43基因修饰ALBMSCs后可上调其Cx43基因的表达并增强GJIC功能。     

伴放线放线杆菌侵入人颊黏膜上皮细胞的研究

[目的]探讨伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,A.a)与人口腔颊黏膜上皮细胞之间的关系,加深对A.a侵入颊黏膜上皮细胞能力的了解.[方法]运用荧光原位杂交技术和激光共聚焦扫描显微镜对12例侵袭性牙周炎患者(AgP)、30例慢性牙周炎患者(CP)和12例牙周健康者频黏膜上皮细胞中的细菌进行定位及半定量.[结果]受检者口腔颊黏膜细胞内均检测出细菌.分别有11名AgP患者、27名CP患者和1名牙周健康者上皮细胞内检测出A.a;颊黏膜上皮细胞内A.a占全细菌相对比例为60%～100%处比较时,AgP组与CP组之间的差异具有显著性意义(P＜0.01).[结论]A.a能够黏附和侵袭口腔颊黏膜上皮细胞.     

间隙连接蛋白26-EGFP载体的构建与表达

目的：构建间隙连接蛋白(connexin，Cx)26-EGFP真核表达载体，观察其在细胞内的表达和功能情况。方法：经RT-PCR获得Cx26基因全长片段，重组至有增强绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N2中，经脂质体转染至宫颈癌Hela细胞中，通过激光共聚焦显微镜、免疫细胞化学方法、蛋白印迹法(Western blot)检测蛋白表达，应用荧光染料(Lucifer Yellow)细胞划痕法检测细胞间间隙连接通信状态。结果：转染细胞有增强绿色荧光蛋白及Cx26的表达，细胞间间隙连接通讯恢复。结论：融合表达增强绿色荧光蛋白后，不影响间隙连接蛋白的功能，在间隙连接蛋白的研究中，pEGFP-N载体可以作为一个优选载体。     

纳米银材料中可溶性银离子对皮肤细胞间隙连接通讯的影响

目的：探讨纳米银中可溶性银离子对皮肤细胞HaCaT间隙连接通讯的影响。方法：将1 g/L纳米银储备液于4 ℃,20 000×g离心2 h后,吸取上清作为银离子储备液,采用电感耦合等离子体质谱法测定其中银离子含量。采用细胞划痕染料标记示踪技术检测细胞间隙连接通讯的改变;分别采用蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR技术检测连接蛋白43（connexin 43, Cx43）及其mRNA表达的变化。结果：不同浓度银离子（0.01、0.1和1.0 mg/L）对HaCaT细胞间隙连接通讯无明显影响。进一步的研究发现,经上述不同浓度银离子作用后,细胞Cx43蛋白及mRNA水平均无明显改变。结论：纳米银材料中可溶性银离子对HaCaT细胞间隙连接通讯的影响及其作用特征可能与纳米银不同。     

体外培养的人脐静脉内皮细胞之间直接通讯的实验研究

目的寻找人脐静脉内皮细胞之间的直接通讯的形态学证据.方法本研究采用RT-PCR、免疫荧光染色、划痕负载染料迁移法等方法来研究培养的人脐静脉内皮细胞缝隙连接蛋白Cx43的表达情况以及染料负载迁移情况.结果RT-PCR方法证实体外原代培养的人脐静脉内皮细胞有缝隙连接蛋白Cx43的mRNA的表达,免疫荧光染色发现Cx43蛋白质主要位于胞膜上,少量位于胞浆中.用划痕负载染料迁移法发现,小分子量的荧光黄染料能在培养的人脐静脉内皮细胞之间互相传递,而大分子量的罗丹明染料则不能在细胞问自由扩散,荧光黄染料的传递是通过细胞问的缝隙连接来实现的.结论该研究为人脐静脉内皮细胞之间直接通讯提供了新的形态学证据.     

自噬核心蛋白ATG101对米色脂肪细胞分化和产热的影响

目的: 探究自噬相关蛋白101（autophagyrelated 101,ATG101）对米色脂肪细胞增殖、分化和产热过程的影响。方法: 将小鼠血管基质细胞（stromal vascular fraction,SVF）向米色脂肪细胞诱导分化,运用实时定量PCR及蛋白质印迹法检测诱导分化过程中（0、2、4、6和8 d）Atg101 mRNA和蛋白表达。使用慢病毒介导的shRNA在分化前敲减Atg101并诱导分化成米色脂肪细胞后,运用实时定量PCR检测成熟脂肪细胞（6 d）标志基因表达,油红O染色观察脂滴形态;同时检测分化过程中（0、2、4和6 d）产热相关基因的表达。结果： ATG101在米色脂肪细胞自然分化过程中表达量逐渐增加;Atg101敲减后,成熟米色脂肪细胞标志基因脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4,Fabp4）,诱导细胞死亡DNA片断化因子α样效应因子（cell death inducing DNA fragmentation factor α like effector A,Cidea）和葡萄糖转运体4（glucose transporter 4,Glut4）的表达较对照组明显降低（均P<0.05）,脂滴生成受损。同时,Atg101的敲减使米色脂肪细胞中产热相关基因PR结构域蛋白16（PR domain containing 16, Prdm16）,Cidea和解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,Ucp1)的表达也明显减少（均P<0.05）。结论： ATG101参与米色脂肪细胞分化过程;下调ATG101表达影响产热功能发挥。     

贲门癌和大肠癌组织中嗜铬蛋白A、Rb蛋白和PCNA的表达

目的:探讨贲门癌和大肠癌组织内分泌分化与Rb蛋白和PCNA表达的关系.方法:采用免疫组化ABC法检测57例贲门癌和78例大肠癌组织中嗜铬蛋白A(CGA)、Rb蛋白及PCNA的表达.结果:贲门癌和大肠癌组织中CGA阳性表达率分别为52.6%(30/57)和35.9%(28/78),Rb蛋白表达率分别为31.6%(18/57)和33.3%(26/78).CGA阳性大肠癌组织Rb蛋白表达率高于CGA阴性者(P＜0.005),但在贲门癌组织中差异无统计学意义(P＞0.05).CGA阳性和阴性贲门癌和大肠癌组织中PCNA阳性细胞数差异均无统计学意义.结论:Rb蛋白的表达变化在大肠癌内分泌分化过程中可能发挥重要作用,但在贲门癌可能不起关键作用;内分泌分化对贲门癌和大肠癌组织的增殖无影响.     

MTSS1、Ezrin及Annexin Ⅱ在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的:探讨结直肠癌组织中肿瘤转移抑制蛋白1(MTSS1)、埃兹蛋白(Ezrin)及膜联蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ)的表达及其与肿瘤转移的关系。方法:应用组织芯片和免疫组织化学技术检测240例结直肠癌组织中MTSS1、Ezrin及AnnexinⅡ的蛋白表达,分析3种蛋白的表达与结直肠癌各种临床病理特征的关系及三者的相关性。结果:MTSS1在中高分化、Dukes A+B+C期结直肠癌的阳性表达率显著高于低分化、Dukes D期结直肠癌(均P<0.01);Ezrin在中高分化、Dukes A+B+C期结直肠癌的阳性表达率高于低分化、Dukes D期结直肠癌(P<0.01,P<0.05);AnnexinⅡ在中高分化、Dukes A+B+C期结直肠癌的阳性表达率高于低分化、Dukes D期结直肠癌(均P<0.05)。经Spearman相关分析,MTSS1和Ezrin、Ezrin和AnnexinⅡ、AnnexinⅡ和MTSS1在结直肠癌中的表达均呈明显正相关(r=0.259,P<0.01;r=0.405,P<0.01;r=0.215,P<0.01)。结论:MTSS1、Ezrin及AnnexinⅡ在结直肠癌组织中的异常表达与肿瘤的转移密切相关,联合检测可作为一组有效的结直肠癌诊疗指标之一。     

肉桂酸对A549细胞分化及端粒酶活性的影响

目的：探讨肉桂酸对人肺腺癌A549细胞诱导分化及对端粒酶活性的影响。方法：应用1mmol／L，3mmol／L肉桂酸(CINN)分别处理A549细胞，并设空白对照，观察体外细胞增殖情况，细胞分裂指数，流式细胞仪测定细胞周期，以TRAP-银染技术的非放射性方法检测端粒酶活性。结果：CINN作用后的A549细胞，细胞增殖明显受到抑制；细胞分裂指数减少；细胞周期出现向G1／G0期移行的特征性动力学改变；相应的端粒酶活性下降，甚至活性丧失。结论：肉桂酸能诱导A549细胞的分化和降低端粒酶活性。     

m6A结合蛋白YTHDC2对人骨髓间充质干细胞分化的影响

目的 研究N6-腺苷酸甲基化(N6-methyladenosine,m6A)结合蛋白YTH结构域蛋白2(YTH domain-containing protein 2,YTHDC2)对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)成骨及成脂分化的调控...     

真核生物胞质伴侣素6A在非小细胞肺癌中的异常表达及临床意义

目的：本研究旨在评估真核生物胞质伴侣素6A(chaperonin containing TCP1 subunit 6A,CCT6A)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)癌组织中的异常表达,以及其与NSCLC患者临床病理特征和预后的关联。方法：本研究回顾性纳入160例经手术切除的NSCLC患者,采用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测癌组织和癌旁组织CCT6A表达水平。 结果：CCT6A主要表达在细胞质和细胞膜上,其表达水平在癌组织中显著高于癌旁组织(P<0.001)。癌组织CCT6A表达水平与高的东部肿瘤协作组体力状态(Eastern Cooperative Oncology Group Performance Status,ECOG PS)评分(P=0.038)、差的肿瘤分化(P=0.014)、以及淋巴结转移相关(P=0.018),而与患者其他临床病理特征不相关,例如：年龄、性别、吸烟、饮酒、慢性合并症、肿瘤细分类型、肿瘤大小等(均P>0.050)。此外,无病生存期(disease-free survival,DFS)(P<0.001)和总体生存期(overall survival,OS)(P=0.036)在癌组织CCT6A高表达患者中均显著短于癌组织CCT6A低表达患者。进一步采用多因素Cox回归分析患者的独立预后因素,发现癌组织CCT6A高表达可以独立预测患者差的DFS(P=0.001),然而不可以独立预测患者OS。结论：CCT6A在NSCLC组织中高表达,其高表达与NSCLC患者差肿瘤分化、淋巴结转移、ECOG PS评分及不良预后相关,表明CCT6A有作为NSCLC标记物的潜能。     

碲化镉量子点对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化潜能的影响

目的：探讨碲化镉量子点（CdTe QDs）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖与成骨细胞分化潜能的影响,阐明CdTe QDs的体外毒性,并为CdTe QDs 作为BMSCs体外活细胞标记应用提供实验依据。 方法：荧光光谱法检测CdTe QDs 在DMEM/F-12培养液中的分散情况。大鼠原代培养BMSCs,经不同浓度CdTe QDs（0、0.195 3、0.390 6、0.781 3、1.562 5、3.125 0、6.250 0、12.500 0、25.000 0和50.000 0 nmol·L^-1）作用24 h后,MTT法检测CdTe QDs
对BMSCs增殖的影响。体外地塞米松、甘油磷酸钠和维生素C诱导BMSCs向成骨细胞分化茜素红染色显示钙结节。计算半数增殖抑制浓度（IP50）和成骨半数分化抑制浓度（ID50）。结果：荧光光谱法检测,CdTe QDs 在DMEM/F-12培养液中分散良好,未发生聚合。随着BMSCs暴露于CdTe QDs的时间延长,其细胞的生长逐渐减慢,暴露24、48和72 h的回归系数分别为－23.96,－29.61和－24.30（P<0.05）, IP50分别为7.25、1.63和0.67 nmol?L-1。随着CdTe QDs浓度的增加,BMSCs分化成的成骨细胞逐渐减少,暴露48 h的成骨分化回归系数为－56.15（P<0.05）, ID50为0.0412 nmol·L^-1,增殖分化抑制比（IP50/ ID50）= 39.56。结论：在一定浓度范围内（0.195 3、0.390 6、0.781 3、1.562 5、3.125 0、6.250 0、12.500 0、25.000 0和50.000 0 nmol?L-1）,CdTe QDs抑制BMSCs的增殖;在一定浓度范围内（0.012 2、0.024 4、0.048 8、0.097 6和0.195 3 nmol·L^-1,CdTe QDs抑制BMSCs向成骨细胞的分化。在使用CdTe QDs作为活细胞标记物时,需要考虑其对细胞增殖及分化的影响。     

胰岛素受体底物1在前成骨细胞分化过程中的表达

目的 研究胰岛素受体底物1(IRS-1)在小鼠前成骨样MC3T3-E1细胞分化过程中的表达.方法 在小鼠前成骨样MC3T3-E1细胞分化成熟过程中,分别在不同时点收集细胞及上清液.骨钙素含量用放射免疫法测定;碱性磷酸酶活性用α-磷酸奈酚法测定;Ⅰ型胶原、骨涎蛋白、骨桥素和IRS-1的mRNA表达应用半定量RT-PCR检测;免疫印迹法测定IRS-1蛋白水平.结果 在小鼠前成骨样MC3T3-E1细胞分化过程中,IRS-1的表达量逐渐增加,而且与Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎素和骨桥素呈正相关.结论 IRS-1参与MC3T3-E1细胞的增殖、成熟与矿化的全过程.     

尿路上皮癌伴鳞状分化对TURBT术后pT1期患者预后的影响

目的: 探讨尿路上皮癌伴鳞状分化对初次经尿道膀胱肿瘤电切术（TURBT）术后pT1期患者预后的影响。方法: 回顾性分析初次经TURBT手术、术后病理诊断为T1期的尿路上皮癌的533例膀胱肿瘤患者的临床病理资料。根据患者的术后病理诊断将患者分为2组:A组为尿路上皮癌（单纯型）441例,B组为尿路上皮癌伴鳞状分化90例,应用SPSS 20.0统计软件,运用Kaplan-Meier法分析两种临床病理特点对无复发生存期（RFS）和无进展生存期（PFS）的影响, 并用Log-rank检验比较生存曲线;运用COX回归模型单因素和多因素分析膀胱尿路上皮癌伴鳞状分化与初次TURBT术后pT1期患者预后之间的关系,评估影响其RFS和PFS的因素。结果: A组单纯尿路上皮癌441例（83.05%）,B组尿路上皮癌伴鳞状分化90例（16.95%）。B组与A组比较更易具有高级别肿瘤（P＜0.001）,同时B组较A组有较高的复发率（P=0.018）、较短的无复发生存期（P＜0.001）以及较高的进展率（P=0.001）、较短的无进展生存期（P＜0.001）。B组与A组比较,年龄（P=0.185）、性别（P=0.135）、吸烟（P=0.728）、肿瘤大小（P=0.436）、肿瘤数目（P=0.112）和膀胱灌注（P=0.054）等差异均无统计学意义。COX多因素生存分析显示:吸烟（HR 1.34, 95% CI 1.00–1.79, P=0.048）、鳞状分化的伴发情况（HR 1.43, 95% CI 1.02–2.00, P=0.040）以及病理分级（HR 1.51, 95% CI 1.13–2.01, P=0.005）等因素显著增加TURBTpT1期患者的复发风险;同时,吸烟（HR 1.80, 95% CI 1.17–2.76, P=0.008）、鳞状分化的伴发情况（HR 2.07, 95% CI 1.32–3.24, P=0.001）以及病理分级（HR 1.90, 95% CI 1.24–2.92, P=0.003）等因素增加TURBTpT1期患者的进展风险。结论: 尿路上皮癌伴鳞状分化是TURBT术后pT1期患者的预后独立影响因素,复发率及进展率较高,需密切随访。